轉(zhuǎn)人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因酵母YS-5hsCT及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)人-鮭嵌合降鈣素 串聯(lián)基因酵母YS-5hsCT及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 降鈣素（calcitonin，簡(jiǎn)稱CT)是由32個(gè)氨基酸殘基組成的一種多肽類激素，由 魚、鳥類等脊椎動(dòng)物的后腮體或哺乳動(dòng)物的甲狀腺濾泡旁細(xì)胞（C細(xì)胞）分泌的。自從Copp 等人1961年首次發(fā)現(xiàn)降鈣素以來(lái)，人們對(duì)其分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理進(jìn)行了廣泛的研宄。不 同來(lái)源的降鈣素氨基酸序列不同，但不同生物的降鈣素對(duì)人都有活性，后鰓體來(lái)源的降鈣 素活性高于甲狀腺來(lái)源的降鈣素。目前在臨床上以鮭魚降鈣素 （salmon calcitonin，簡(jiǎn)稱 sCT)活性最高，是人降媽素 （human calcitonin，簡(jiǎn)稱hCT)活性的20 - 40倍。降媽素已經(jīng) 在臨床上應(yīng)用多年，主要用于預(yù)防和治療老年性骨質(zhì)疏松、Paget氏綜合癥、高鈣血癥等，并 作為糖尿病、胃潰瘍、急性胰腸炎等疾病的輔助治療藥物。目前降鈣素已經(jīng)開發(fā)上市的劑型 只有注射和鼻噴給藥兩種，無(wú)口服給藥劑型，臨床使用最多的是化學(xué)合成的鮭魚降鈣素注 射劑（如密蓋息、蓋瑞寧等）。由于降鈣素生物半衰期短，臨床給藥時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月以上， 對(duì)于患者來(lái)說(shuō)用藥極為不便，且伴有額外的痛苦；并且生物當(dāng)中的降鈣素含量極微，而化學(xué) 合成的降鈣素產(chǎn)量低、造價(jià)昂貴且容易造成環(huán)境污染，極大地限制了降鈣素的廣泛使用。
[0003] 隨著基因工程技術(shù)的興起和發(fā)展，利用高效的生物表達(dá)系統(tǒng)（原核表達(dá)系統(tǒng)和真 核表達(dá)系統(tǒng)）制備廉價(jià)的降鈣素成為可能。近二十年，國(guó)內(nèi)外利用生物工程技術(shù)已經(jīng)獲得 降鈣素的多種表達(dá)方式。原核表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白產(chǎn)量高，生產(chǎn)周期短，但無(wú)法對(duì)外源蛋 白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾，酰胺化工藝水平直接影響重組表達(dá)降鈣素的活性，且細(xì)菌易產(chǎn)生熱源 和內(nèi)毒素，不易除去，蛋白純化工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本很高。真核表達(dá)系統(tǒng)可對(duì)外源蛋白進(jìn)行 酰胺化修飾，節(jié)約了生產(chǎn)成本，但外源基因的表達(dá)量普遍較低，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)、蛋白提取和 純化工藝更為復(fù)雜，限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。并且降鈣素分子太小，在溶液中極不穩(wěn)定， 真核表達(dá)系統(tǒng)仍無(wú)法避免蛋白提取、切割、純化等煩瑣的后續(xù)工作，嚴(yán)重影響目的蛋白的得 率。所以，目前存在的問(wèn)題迫切地要求發(fā)展一種更廉價(jià)更高效的真核表達(dá)系統(tǒng)。
[0004] 2001 年，Blanquet 在 "Trends Biotechnol " 上提出了 "biodrug" 的概念，指出冷 凍干燥后的重組釀酒酵母可在消化液存在的條件下作為載體運(yùn)輸口服多肽。釀酒酵母被認(rèn) 為是食品安全級(jí)的真核微生物，生產(chǎn)周期短，發(fā)酵技術(shù)相當(dāng)成熟。冷凍干燥后的酵母對(duì)胃腸 道的抗降解能力強(qiáng)，對(duì)表達(dá)的產(chǎn)物能起到良好的保護(hù)作用。而且研宄表明，降鈣素能夠以多 肽的形式直接穿過(guò)動(dòng)物胃腸道的表皮細(xì)胞進(jìn)入血液。因此用釀酒酵母表達(dá)降鈣素，可直接 口服，免去蛋白提取、切割加工和純化等工藝，極大地節(jié)約了工業(yè)化生產(chǎn)成本，為降鈣素的 臨床應(yīng)用提供一條有效廉價(jià)的給藥途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因酵母YS_5hsCT及其制備方法和應(yīng)用， 本發(fā)明以rDNA為同源重組位點(diǎn)將5拷貝人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因轉(zhuǎn)入酵母，通過(guò)串聯(lián)降 鈣素基因提高拷貝數(shù)，并以rDNA為同源重組位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)降鈣素基因在釀酒酵母基因組中的 高拷貝穩(wěn)定整合，從而提高降鈣素在釀酒酵母中的表達(dá)量。本發(fā)明可以解決目前降鈣素在 表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量低、需純化、活性低、造價(jià)高及不能口服給藥等一系列的問(wèn)題。更重要 的是以u(píng)ra3基因?yàn)獒劸平湍傅倪z傳選擇標(biāo)記基因，消除了抗生素等選擇標(biāo)記給后期工業(yè) 化生產(chǎn)帶來(lái)的不良影響或不安全問(wèn)題。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0007] 釀酒酵母YS-Aura，其分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 10014。
[0008] 釀酒酵母YS_5hsCT，其分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 10015。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述的釀酒酵母YS-5hsCT的制備方法，它包括如下步驟：
[0010] (1)5拷貝人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因5hsCT的克?。?br>[0011] 將5拷貝人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因5hsCT進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，連入克隆載體，構(gòu) 建含有5hsCT基因的重組載體；
[0012] (2)pgk基因啟動(dòng)子的克隆：
[0013] 以釀酒酵母基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得pgk基因，連入克隆載體， 構(gòu)建含有Pgk基因的重組載體；
[0014] (3)選擇標(biāo)記基因 ura3的克?。?br>[0015] 以釀酒酵母基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得ura3基因，連入克隆載體， 構(gòu)建含有ura3基因的重組載體；
[0016] (4) rDNA基因的克隆：
[0017] 以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得rDNAl和rDNA2兩個(gè) 基因，分別連入克隆載體，分別構(gòu)建含有rDNAl和rDNA2基因的重組載體；
[0018] (5)含人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因重組載體的制備：
[0019] 先將rDNAl基因插入到克隆載體中，然后將5hsCT基因插入到rDNAl基因的上游， 再將Pgk基因插入到5hsCT的上游，構(gòu)建含有P pgk-5hsCT-rDNAl重組片段的重組載體1 ;
[0020] 再將Ppgk-5hsCT-rDNAl重組片段插入到克隆載體中；
[0021] 將rDNA2基因插入到pgk基因的上游，再將ura3基因插入到rDNA2和pgk之間， 構(gòu)建含有rDNA2-ura3-P pgk-5hsCT-rDNAl重組片段的重組載體2 ;
[0022] (6)人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因向釀酒酵母的轉(zhuǎn)化：
[0023] 所述重組載體2經(jīng)酶切獲得線性DNA片段rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNAl，該線性 片段轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS- Λ ura感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子在SD/-Ura固體培養(yǎng)基上篩選重組子獲 得轉(zhuǎn)基因酵母YS_5hsCT。
[0024] 本發(fā)明還提供了所述的釀酒酵母YS_5hsCT在制備治療骨質(zhì)疏松癥、Paget氏綜合 癥和高鈣血癥的藥物或保健品中的應(yīng)用。所述釀酒酵母YS-5hsCT的用量為0. 01g/kg以上。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：本發(fā)明通過(guò)將5個(gè)單拷貝人-鮭嵌 合降鈣素基因串聯(lián)起來(lái)，單拷貝之間由一段柔性肽相連，合成一個(gè)新型5拷貝人-鮭嵌合降 鈣素串聯(lián)基因（5hsCT)，提高了自身拷貝數(shù)和穩(wěn)定性，再以rDNA為同源重組位點(diǎn)介導(dǎo)5拷貝 人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因在釀酒酵母基因組中實(shí)現(xiàn)高拷貝數(shù)的穩(wěn)定整合，實(shí)現(xiàn)外源基因 在酵母細(xì)胞內(nèi)的高效穩(wěn)定表達(dá)，大大提高了降鈣素的表達(dá)量，并采用釀酒酵母本身的組成 型強(qiáng)啟動(dòng)子（pgk promoter)高效啟動(dòng)人-鞋嵌合降媽素的表達(dá)，同時(shí)以u(píng)ra3基因?yàn)獒劸?酵母的遺傳選擇標(biāo)記基因，消除了抗生素等選擇標(biāo)記給后期工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)的不良影響或 不安全問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明所述轉(zhuǎn)基因酵母YS-5hsCT灌胃正常小白鼠具有持續(xù)的降血 鈣能力。為降鈣素的口服給藥提供了新途徑，增加其在純化及臨床應(yīng)用過(guò)程中的穩(wěn)定性，延 長(zhǎng)其生物半衰期，拓寬了降鈣素在骨質(zhì)疏松癥等臨床治療上的應(yīng)用，為降鈣素在醫(yī)療事業(yè) 上更廣泛的使用提供了依據(jù)。
[0026] 本發(fā)明通過(guò)將人-鮭嵌合降鈣素在釀酒酵母這種真核系統(tǒng)中來(lái)表達(dá)，基于釀酒酵 母生產(chǎn)容易、發(fā)酵技術(shù)已相當(dāng)成熟、表達(dá)量較高的優(yōu)勢(shì)，其次釀酒酵母是食品安全級(jí)的模式 真核微生物，可以直接食用，并且冷凍干燥后的酵母可緩解消化液環(huán)境下降解能力，減少降 鈣素的降解，使得降鈣素能夠以多肽的形式直接穿過(guò)動(dòng)物胃腸道的表皮細(xì)胞進(jìn)入血液。得 到的轉(zhuǎn)人-鮭嵌合降鈣素串聯(lián)基因的釀酒酵母可以直接口服，不需要蛋白提純、切割加工 和純化等繁瑣工藝，安全性好，從而極大地降低了生產(chǎn)成本，基本可以實(shí)現(xiàn)降鈣素的口服給 藥。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖 1 為重組克隆載體 pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNAl 構(gòu)建流程圖；
[0028] 圖2為重組人-鮭嵌合降鈣素5拷貝串聯(lián)基因的表達(dá)框；
[0029] 圖3為重組克隆載體pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNAl酶切驗(yàn)證結(jié)果圖；
[0030] 圖4為利用PCR方法篩選酵母轉(zhuǎn)化子電泳結(jié)果圖；
[0031] 圖5為轉(zhuǎn)基因酵母基因組DNA