專利名稱：朊病毒特異性的肽試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與朊病毒蛋白發(fā)生反應(yīng)的肽試劑，編碼這些肽試劑的多核苷酸，使用這些肽試劑和多核苷酸生產(chǎn)抗體的方法，以及使用這些方法生產(chǎn)的抗體。本發(fā)明還涉及使用這些肽試劑檢測(cè)樣品中致病朊病毒存在的方法，以及用這些肽試劑作為治療或預(yù)防組合物中的組分的方法。
背景技術(shù)：
蛋白構(gòu)象病包括一系列不相關(guān)的疾病，包括傳染性海綿樣腦病，這些疾病是由于蛋白質(zhì)(構(gòu)象病蛋白質(zhì))的異常構(gòu)象轉(zhuǎn)變引起的，這樣的轉(zhuǎn)變又會(huì)造成異常蛋白形式的自我結(jié)合，繼而導(dǎo)致組織沉積和損傷。這些疾病還在臨床表現(xiàn)方面具有驚人的相似性，典型的是在不同長(zhǎng)度的潛伏期后從診斷到死亡進(jìn)展迅速。
構(gòu)象病中的一類被稱為“朊病毒疾病”或“傳染性海綿樣腦病(TSEs)”。在人類中，這些疾病包括克雅病(CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合癥(GSS)、致命性家族性失眠癥、和庫(kù)魯病(參見，例如，Harrison′s Principles ofInternal Medicine，Isselbacher等編，McGraw-Hill，Inc.New York，(1994)；Medori等(1992)N.Engl.J.Med.326444-9.)。在動(dòng)物中，TSE包括羊瘙癢病、牛海綿樣腦病(BSE)、傳染性貂腦病、和捕獲性長(zhǎng)耳鹿和麇鹿(captive mule deer andelk)的慢性消耗性疾病(Gajdusek，(1990)亞急性海綿樣腦病由非常規(guī)病毒引發(fā)的傳染性腦淀粉樣變性病(亞急性海綿樣腦病由非傳統(tǒng)病毒引起的傳染性腦淀粉樣變性病)2289-2324頁(yè)，Virology，F(xiàn)ields，編New YorkRaven Press，Ltd.)。傳染性海綿樣腦病都具有相同的特征標(biāo)志存在朊病毒蛋白的異常(富含β折疊，抗蛋白酶K)構(gòu)象，在實(shí)驗(yàn)中把朊病毒蛋白接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括，靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、和轉(zhuǎn)基因小鼠)可傳染疾病。
最近，牛海綿樣腦病的迅速傳播以及其與人海綿樣腦病發(fā)生增多的關(guān)聯(lián)性提高了人們對(duì)非人哺乳動(dòng)物中傳染性海綿樣腦病檢測(cè)的興趣。這些疾病的意外傳染造成的悲劇性結(jié)果(參見，例如，Gajdusek，傳染性淀粉樣蛋白，和Prusiner，F(xiàn)ields Virology中的朊病毒，F(xiàn)ields等編，Lippincott-Ravin，Pub.Philadelphia(1996)；Brown等(1992)Lancet，34024-27)，去除污染的困難(Asher等(1986)59-71頁(yè)實(shí)驗(yàn)室安全原則和實(shí)踐，Miller編Am.Soc.Microb.)，以及最近有關(guān)牛海綿樣腦病的擔(dān)心(British Med.(1995)3111415-1421)都讓人們意識(shí)到擁有能夠識(shí)別患有傳染性海綿樣腦病的人和動(dòng)物的診斷測(cè)驗(yàn)以及對(duì)感染對(duì)象的治療的緊迫性。
朊病毒是引發(fā)海綿樣腦病(朊病毒病)的傳染病原體。朊病毒與細(xì)菌、病毒和類病毒有顯著的差別。主要的假說(shuō)是，不同于所有其它的傳染性病原體，其傳染是由朊病毒蛋白的異常構(gòu)象引起的，該異常構(gòu)象作為模板而將正常的朊蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變成異常構(gòu)象。在1980年代早期第一次鑒定了朊病毒蛋白(參見，例如，Bolton，McKinley等(1982)Science 2181309-1311；Prusiner，Bolton等(1982)Biochemistry 216942-6950；McKinley，Bolton等(1983)Cell 3557-62)。此后克隆了完整的編碼朊病毒蛋白的基因，測(cè)序并在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)。參見，例如，Basler，Oesch等(1986)Cell 46417-428。
朊病毒疾病的主要特征即是從正常的(細(xì)胞或非致病的)朊病毒蛋白(PrP)形式形成異常形狀的蛋白質(zhì)(PrPSc)，這種蛋白也稱為羊瘙癢病蛋白。參見，例如，Zhang等(1997)Biochem.36(12)3543-3553；Cohen & Prusiner(1998)AnnRev.Biochem.67793-819；Pan等(1993)Proc Natl Acad Sci USA 9010962-10966；Safar等(1993)J Biol Chem 26820276-20284。光譜學(xué)和結(jié)晶學(xué)研究已經(jīng)揭示，朊病毒的疾病相關(guān)形式基本上富含β-折疊結(jié)構(gòu)，而與其比較，非疾病形式的蛋白則主要是α-螺旋折疊。參見，例如，Wille等(2001)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 993563-3568；Peretz等(1997)J.Mol.Biol.273614-622；Cohen& Prusiner，第5章《朊病毒生物學(xué)和疾病》中的朊病毒蛋白的結(jié)構(gòu)研究，S.Prusiner編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，191-228頁(yè))。隨結(jié)構(gòu)改變而來(lái)的即是生化特性的變化PrPC可溶解在非變性去污劑中，而PrPSc則不溶；PrPC可以容易地被蛋白酶消化，而PrPSc則具部分抗性，消化后形成N-末端截短的片段，稱為″PrPres″(Baldwin等(1995)；Cohen & Prusiner(1995))，″PrP 27-30″(27-30 kDa)或″PK-抗性″(蛋白酶K抗性)形式。此外，PrPSc可以將PrPC轉(zhuǎn)變成致病構(gòu)象。參見，例如，Kaneko等(1995)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 9211160-11164；Caughey(2003)Br Med Bull.66109-20。
已證明在活體對(duì)象和取自活體對(duì)象的樣品中檢測(cè)構(gòu)象病蛋白的致病異型是很困難的。因此，在對(duì)象死亡之前對(duì)這些傳染性和含有淀粉樣的病癥進(jìn)行確定診斷和姑息療法仍然是基本上未解決的一大挑戰(zhàn)。組織病理學(xué)對(duì)腦的活組織檢查對(duì)于對(duì)象是很危險(xiǎn)的，而根據(jù)活組織檢查樣品取出的位置，可能會(huì)遺漏病灶和淀粉樣沉積。然而，對(duì)動(dòng)物、病人和保健工作者進(jìn)行活組織檢查仍然存在危險(xiǎn)。此外，通常直到動(dòng)物進(jìn)入食物供給才能獲得動(dòng)物的腦檢測(cè)結(jié)果。而且，對(duì)朊病毒肽產(chǎn)生的抗體同時(shí)識(shí)別變性的PrPSc和PrPC，但不能選擇性地識(shí)別感染性的(未變性的)PrPSc。(參見，例如，Matsunaga等(2001)《蛋白質(zhì)》結(jié)構(gòu)，功能和遺傳學(xué)，44110-118)。
因此，仍有需要開發(fā)檢測(cè)各種樣品中(例如，取自活體對(duì)象的樣品中、血液供給中、家畜中以及其它人和動(dòng)物的食物供給中)致病朊病毒蛋白存在情況的組合物和方法。此外，仍需要診斷和治療朊病毒相關(guān)疾病的方法和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明部分涉及與朊病毒蛋白發(fā)生反應(yīng)的試劑。更具體地，本文所述的肽試劑優(yōu)先與朊病毒蛋白的致病異型發(fā)生反應(yīng)。這些肽試劑可以用在很大范圍的應(yīng)用中，包括作為分離樣品中致病朊病毒或檢測(cè)樣品中致病朊病毒存在的工具，作為治療性或預(yù)防性組合物的組分和/或用來(lái)產(chǎn)生朊病毒特異性抗體。例如，相比較于PrPC優(yōu)先與PrPSc發(fā)生反應(yīng)的肽試劑可以用于直接檢測(cè)取自活體對(duì)象的樣品中的致病形式，例如，用于疾病診斷或用來(lái)篩選捐獻(xiàn)的血液樣品或篩選用于器官捐贈(zèng)的器官。
在更廣的方面，本發(fā)明包括優(yōu)先與構(gòu)象病蛋白的致病形式發(fā)生反應(yīng)的肽試劑。在某些實(shí)施方式中，相比較于朊病毒蛋白的非致病形式，本文所述的肽試劑優(yōu)先與致病形式的朊病毒蛋白發(fā)生反應(yīng)。本文所述的肽試劑可能部分或全部為合成的，例如，可以包含以下一個(gè)或多個(gè)部分環(huán)化殘基或肽，肽的多聚體，標(biāo)簽，和/或其它化學(xué)部分。合適的肽試劑的實(shí)例包括由SEQ ID NOs12-132肽衍生而來(lái)的肽，例如，SEQ ID NOs66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127，14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82，或84中描述的肽，及其類似物和衍生物。本文所述的肽試劑可以與任何構(gòu)象病蛋白發(fā)生相互作用，例如，朊病毒蛋白(例如，致病性蛋白PrPSc，和非致病性形式的PrPC)。在某些實(shí)施方式中，相比較于PrPC，肽試劑優(yōu)先與PrPSc發(fā)生相互作用。肽試劑一般對(duì)來(lái)源于多個(gè)物種的PrPSc具有特異性，但是也可僅對(duì)來(lái)自單個(gè)物種的PrPSc具特異性。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了由本文所述的任何序列表示的肽衍生而來(lái)的肽試劑。在某些實(shí)施方式中，肽試劑來(lái)源于朊病毒蛋白的某些區(qū)域，例如，采用對(duì)應(yīng)于殘基23-43或85-156的區(qū)域(例如，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2所示的小鼠朊病毒序列中編號(hào)為23-30，86-111，89-112，97-107，113-135，和136-156的區(qū)域)。為了方便起見，上文列出的氨基酸殘基號(hào)碼對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2所示的小鼠朊病毒蛋白序列；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的序列和本文提供的指導(dǎo)很容易地在其它物種的朊病毒蛋白中識(shí)別對(duì)應(yīng)區(qū)域。作為示例的肽試劑包括從以下序列號(hào)的肽衍生而來(lái)的試劑，SEQ ID NO66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，或127；或從以下序列號(hào)的肽衍生而來(lái)的試劑，SEQ ID NO14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，129，130，131，132或128；或從以下序列號(hào)的肽衍生而來(lái)的試劑，SEQ ID NO56，57，65，82，或84。
在另一方面，本發(fā)明包括含有本文所述的一種或多種肽試劑和朊病毒蛋白的復(fù)合物。
在另一方面，提供了產(chǎn)生識(shí)別朊病毒蛋白的抗體的方法，該方法包括以下步驟，即給對(duì)象(例如，動(dòng)物)施用本文所述的任何一種肽試劑(或編碼該肽試劑的多核苷酸)。在某些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包含從動(dòng)物中分離抗體的步驟。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面包括用該方法制備的抗體。優(yōu)選的抗體對(duì)致病形式具有特異性。
在還有一個(gè)方面，本發(fā)明包括含有本文所述任何抗體和朊病毒蛋白的復(fù)合物。在某些實(shí)施方式中，朊病毒蛋白是非致病性的異型，而在其它一些實(shí)施方式中，其為致病性的異型。
本文所述的任何肽試劑和/或抗體可以全部或部分由，一種或多種多核苷酸編碼，這些多核苷酸也是本發(fā)明的一部分。
在還有一個(gè)方面，提供了檢測(cè)朊病毒蛋白存在的方法。檢測(cè)方法可以有多種用途，如，與診斷朊病毒相關(guān)疾病的方法聯(lián)合使用(例如，在人或非人動(dòng)物對(duì)象中)，確保供血、血制品供給、或食物供給中基本不含PrPSc，分析用于移植的器官和組織樣品，監(jiān)測(cè)手術(shù)工具和儀器的去污染情況，以及任何其它的知道致病性朊病毒的存在與否至關(guān)重要的情形。
該檢測(cè)方法依賴本發(fā)明的肽試劑與致病性朊病毒異型的優(yōu)先相互作用。在某些實(shí)施方式中，提供了檢測(cè)生物樣品中是否存在致病性朊病毒的方法。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與本文所述的一種或多種肽試劑相接觸，所處的條件允許肽試劑與致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)發(fā)生相互作用；并通過(guò)其與肽試劑的結(jié)合情況檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在與否。肽試劑與致病性朊病毒的相互作用可以在溶液中進(jìn)行，或者可以在固相中或固相上提供一種或多種反應(yīng)物?？梢赃M(jìn)行夾心試驗(yàn)，其中將本發(fā)明的肽試劑可以用做捕獲試劑、檢測(cè)試劑或兩者。本方面中，可以將其它朊病毒結(jié)合試劑(例如，與變性的朊病毒蛋白結(jié)合的抗體或其它結(jié)合分子)與本發(fā)明的肽試劑聯(lián)合使用。
在該實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了在固相支持物上的一種或多種本發(fā)明的肽試劑，并將其與懷疑含有致病性朊病毒的樣品接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)與肽試劑的結(jié)合?？梢詫⑽唇Y(jié)合的樣品材料(包括任何非致病性朊病毒)去除，并檢測(cè)致病性朊病毒，可以在其仍與肽試劑結(jié)合的情況下加以檢測(cè)，也可以在其從肽試劑上解離后加以檢測(cè)?？梢允褂脦в锌蓹z測(cè)標(biāo)記的肽試劑(與用來(lái)“捕獲”致病性朊病毒相同的肽試劑或本發(fā)明的第二個(gè)肽試劑)或帶有可檢測(cè)標(biāo)記的抗朊病毒抗體或其它朊病毒結(jié)合試劑來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒。該抗體或朊病毒結(jié)合試劑無(wú)需對(duì)致病形式的朊病毒具備特異性。
在該實(shí)施方式的另一方面，提供了在固相支持物上的朊病毒結(jié)合試劑，并將其與懷疑含有致病性朊病毒的樣品接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)結(jié)合于朊病毒結(jié)合試劑?？梢詫⑽唇Y(jié)合的樣品材料去除，并檢測(cè)致病性朊病毒，可以在其仍與肽試劑結(jié)合的情況下加以檢測(cè)，也可以在其從肽試劑上解離后加以檢測(cè)?？梢允褂靡环N或多種帶有可檢測(cè)標(biāo)記的本發(fā)明的肽試劑來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒。
在該實(shí)施方式的另一方面，可以將樣品中的致病性朊病毒非特異地結(jié)合到固相支持物上(例如，ELISA板)，并通過(guò)與本發(fā)明的一種或多種帶有可檢測(cè)標(biāo)記的肽試劑(優(yōu)先與致病性朊病毒異型發(fā)生相互作用)的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與一種或多種選自具有SEQID NO12-132序列的肽及其類似物和衍生物的肽試劑相接觸，所處的條件允許肽試劑與致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)的結(jié)合；并通過(guò)其與肽試劑的結(jié)合檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在與否。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將樣品與一種或多種選自下組的肽試劑相接觸具有SEQID NO66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127，14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82，或84序列的肽，及其類似物和衍生物。
在其它實(shí)施方式中，提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的方法，該方法包括提供一個(gè)含有第一種肽的固相支持物，其中第一種肽包括本文所述的一種或多種優(yōu)先與PrPSc相互作用的肽試劑；將固相支持物與樣品接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)與第一種肽結(jié)合；將固相支持物與帶有可檢測(cè)標(biāo)記的第二種肽相接觸，其中第二種肽包括本文所述的一種或多種優(yōu)先與PrPSc蛋白相互作用的肽試劑，所處的條件允許第二種肽與結(jié)合在第一種肽上的致病性朊病毒相結(jié)合；并檢測(cè)由第一種肽、樣品中致病性朊病毒和第二種肽形成的復(fù)合物，以此檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
在其它實(shí)施方式中，本文提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括提供一個(gè)含有朊病毒結(jié)合試劑的固相支持物，其中朊病毒結(jié)合試劑與朊病毒蛋白相結(jié)合；將固相支持物與樣品相接觸，所處的條件允許在樣品中存在朊病毒蛋白的情況下，朊病毒蛋白與朊病毒結(jié)合試劑相結(jié)合；將固相支持物與本發(fā)明的帶有可檢測(cè)標(biāo)記的肽試劑相接觸，其中的肽試劑優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白相互作用；并檢測(cè)由朊病毒結(jié)合試劑、樣品中的致病性朊病毒和肽試劑形成的復(fù)合物。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括以下步驟提供含有本文所述第一肽試劑的固相支持物，其中第一肽試劑優(yōu)先與致病形式發(fā)生相互作用；將固相支持物與帶有可檢測(cè)標(biāo)記的第一配體(例如，纖維蛋白溶酶原、層粘連蛋白受體和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate))相接觸，所處的條件允許帶有可檢測(cè)標(biāo)記的肽試劑與配體形成復(fù)合物，其中第一肽試劑與帶有可檢測(cè)標(biāo)記的第一配體的結(jié)合親和力弱于第一肽試劑與致病性朊病毒的結(jié)合親和力；將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與固相支持物相接觸，所處的條件允許在樣品中存在致病性朊病毒的情況下，致病性朊病毒取代第一配體而與第一肽試劑結(jié)合；并通過(guò)固相支持物上帶有可檢測(cè)標(biāo)記的配體的減少來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
以上任何檢測(cè)致病性朊病毒的方法都可以用在朊病毒相關(guān)疾病的診斷方法中。
本發(fā)明還提供了分離致病性朊病毒的方法，該方法包括提供一個(gè)含有本發(fā)明的一種或多種肽試劑的固相支持物，將固相支持物與已知或懷疑含有致病性朊病毒的樣品相接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)與肽試劑的結(jié)合；并去除任何未結(jié)合的樣品材料。其它的實(shí)施方式進(jìn)一步包括以下步驟，即將結(jié)合的致病性朊病毒從肽試劑上解離下來(lái)，并任選地，回收解離的致病性朊病毒。
本發(fā)明還提供了從樣品中去除致病性朊病毒的方法，該方法包括提供含有本發(fā)明的一種或多種肽試劑的固相支持物，將固相支持物與已知或懷疑含有致病性朊病毒的樣品相接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(如果有致病性朊病毒存在)與肽試劑的結(jié)合；并回收未結(jié)合的樣品材料。
對(duì)于上述所有的提供含有本發(fā)明的一種或多種肽試劑的固相支持物的實(shí)施方式，也考慮了可選擇的實(shí)施方式，其中在肽試劑結(jié)合到固相支持物之前將肽試劑與樣品相接觸。在這些實(shí)施方式中，肽試劑含有結(jié)合對(duì)中的一個(gè)，而固相支持物則含有結(jié)合對(duì)中的另一個(gè)。例如，本發(fā)明的肽試劑可以含有或經(jīng)修飾含有生物素。將生物素化的肽試劑與懷疑含有致病性朊病毒的樣品相接觸，所處的條件允許肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上。然后，將含有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的固相支持物與生物素化的肽試劑相接觸。本文也描述了其它合適的結(jié)合對(duì)。
在任何本文所述的使用固相支持物的方法中，固相支持物可以是，例如，硝化纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠、聚氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、活化珠、和/或磁感應(yīng)珠、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯乳膠、聚碳酸酯、尼龍、葡聚糖、幾丁質(zhì)、砂、硅石、浮石、瓊脂糖、纖維素、玻璃、金屬、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多糖；重氮化紙；活化珠；磁感應(yīng)珠，和任何常用于固相合成、親和分離、純化、雜交反應(yīng)、免疫試驗(yàn)和其它此類應(yīng)用的材料。固相可以是顆粒的，或者可以是連續(xù)的平面形式，包括，膜、網(wǎng)格、板、丸、片、盤、毛細(xì)管、空心纖維、針、釘、小片、固體纖維、凝膠(例如硅膠)和珠，(例如，帶孔玻璃珠、硅膠、任選與二乙烯基苯相互交聯(lián)的聚苯乙烯珠、移植的共聚珠，聚丙烯酰胺珠，乳膠珠，任選與N-N′-二-丙烯酰乙二胺交聯(lián)的二甲基聚丙烯酰胺珠、氧化鐵磁珠，和包被疏水聚合物的玻璃顆粒)。
此外，在本文所述的任何方法中，樣品可以是生物樣品，也就是從活體或曾經(jīng)存活的生物體中獲得或衍生而來(lái)的，例如，器官、全血、血液部分、血液組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肌肉組織、骨髓、尿、淚液、非神經(jīng)系統(tǒng)組織、器官、和/或活組織檢查或尸體剖檢。在優(yōu)選實(shí)施方式中，生物樣品包括血液、血液部分或血液組分。樣品可以是非生物樣品。
在另一方面，本發(fā)明提供了診斷對(duì)象中朊病毒相關(guān)疾病的方法，該方法用任何本文所述的檢測(cè)方法通過(guò)檢測(cè)來(lái)自所述對(duì)象的生物樣品中致病性朊病毒的存在情況進(jìn)行診斷。
在另一方面，本發(fā)明包括制備基本上不含有致病性朊病毒的血液供給的方法，該方法包括以下步驟，即用任何本文所述的方法篩選從采集的血液樣品中得到的血液部分(例如，全血、血漿、血小板或血清)；棄取任何其中檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品；合并其中未檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品，以提供基本上不含有致病性朊病毒的血液供給。
在還有一個(gè)方面，本發(fā)明包括制備基本上不含有致病性朊病毒的食物供給的方法，尤其是肉類供給(例如，給人或動(dòng)物消耗的牛肉、羔羊肉、羊肉或豬肉)的方法，該方法包括以下步驟，即用任何本文所述的檢測(cè)方法篩選采集自將要進(jìn)入食物供給的活的或死的生物體的樣品或采集自意圖進(jìn)入食物供給的食物的樣品，鑒定出其中檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品；并從食物供給中去除任何其中檢測(cè)到致病性致病性朊病毒的活的或死的生物體或意圖進(jìn)入食物供給的食物；以提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供給。
在另一方面，本發(fā)明提供了含有本文所述一種或多種肽試劑的固相支持物。該固相支持物的用途有，如，用在本發(fā)明的檢測(cè)樣品中致病性朊病毒蛋白的方法中，用于從樣品中分離朊病毒蛋白，以及從樣品中去除致病性朊病毒蛋白。固相支持物可以如上文所述。
在另一方面，本發(fā)明提供了各種試劑盒用以檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況，用于從樣品中分離朊病毒蛋白，從樣品中去除致病性朊病毒蛋白，該試劑盒含有本文所述的一種或多種肽試劑；和/或含有本文所述一種或多種肽試劑的固相支持物以及其它所需試劑，以及任選地，陽(yáng)性和陰性對(duì)照。肽試劑可以帶有可檢測(cè)標(biāo)記。
在其它方面，本文提供了含有本文所述的一種或多種肽試劑、多核苷酸和/或抗體的組合物。
在其它方面，提供了治療或預(yù)防朊病毒疾病的方法，例如，這些方法包括給動(dòng)物(例如，非人哺乳動(dòng)物或人)施用本文所述的一種或多種組合物。在其它實(shí)施方式中，這些方法包括在引發(fā)步驟中施用含有本文所述任何組合物的第一種組合物，并施用含有本文所述任何組合物的第二種組合物作為增強(qiáng)劑，例如，其用量足以在對(duì)象中誘發(fā)免疫反應(yīng)?？梢杂靡韵路绞绞┯媒M合物肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服和/或靜脈內(nèi)。
閱讀本文的揭示以后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易了解本發(fā)明的這些及其它實(shí)施方式。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1描述了人朊病毒蛋白的氨基酸序列(SEQID NO1)和小鼠朊病毒蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2描述了來(lái)自人(SEQ ID NO3)，敘利亞倉(cāng)鼠(倉(cāng)鼠)(SEQ ID NO4)，牛(SEQID NO5)，羊(SEQ ID NO6)，小鼠(SEQ ID NO7)，麇鹿(SEQID NO8)，扁角鹿(扁角)(SEQ ID NO9)，長(zhǎng)耳鹿(長(zhǎng)耳)(SEQID NO10)，和白尾鹿(白)(SEQ ID NO11)的朊病毒蛋白的序列比對(duì)。來(lái)自麇鹿、扁角鹿、長(zhǎng)耳鹿、和白尾鹿的蛋白相互之間僅有2個(gè)殘基的差異S/N128和Q/E226(黑體表示)。
圖3，A-F欄描述了制備本文所述的任何肽試劑而進(jìn)行的示例性擬肽取代。每一欄中圈出了擬肽，并在本文所述的示例性肽試劑中加以表示(SEQ ID NO14，QWNKPSKPKTNG)，其中脯氨酸殘基(SEQ ID NO14的殘基8)用N-取代甘氨酸(擬肽)殘基加以替換。欄A表示的肽試劑中脯氨酸殘基由擬肽殘基N-(S)-(1-苯乙基)甘氨酸所取代；欄B表示的肽試劑中脯氨酸殘基由擬肽殘基N-(4-羥苯基)甘氨酸所取代；欄C表示的肽試劑中脯氨酸殘基由擬肽殘基N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸所取代；欄D表示的肽試劑中脯氨酸殘基由擬肽殘基N-(異丙基)甘氨酸所取代；欄E表示的肽試劑中脯氨酸殘基由擬肽殘基N-(3，5-二甲氧基苯基)甘氨酸所取代；欄F表示的肽試劑中脯氨酸殘基由擬肽殘基N-丁基甘氨酸所取代。
圖4描述實(shí)施例2中所述的Western印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。泳道1和2表示在正常的小鼠腦勻漿中(泳道1，標(biāo)記為″C″)和變性的感染小鼠的腦勻漿中(泳道2，標(biāo)記為“Sc”)存在朊病毒蛋白。泳道3，4和5表示如本文所述的肽試劑(SEQ IDNO68)在人血漿存在時(shí)與致病形式朊病毒的特異性結(jié)合。具體地，泳道3是人血漿對(duì)照，而泳道4是正常小鼠腦勻漿樣品。泳道5表示肽試劑與感染的小鼠腦勻漿樣品中的PrPSc具有很強(qiáng)的結(jié)合。
圖5描述了如本文所述示例性的PEG連接肽試劑的結(jié)構(gòu)。
詳細(xì)描述本發(fā)明涉及以下驚人的意外發(fā)現(xiàn)，即可以使用相對(duì)小的肽(長(zhǎng)度小于50至100個(gè)氨基酸的肽，優(yōu)選長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的肽，更優(yōu)選長(zhǎng)度小于約30個(gè)氨基酸的肽)來(lái)區(qū)分非致病性和致病性的朊病毒蛋白。因此，本發(fā)明公開涉及一項(xiàng)驚人的發(fā)現(xiàn)，即這些肽及其衍生物(總稱為″肽試劑″)，可以不同的特異性和/或親和性結(jié)合致病性和非致病性的蛋白質(zhì)形式，因此可以用在或本身用作診斷/檢測(cè)試劑或作為治療組合物的組分。在本發(fā)明公開之前，據(jù)信只有更大的分子(例如，抗體、PrPC，α型的rPrP和纖維蛋白溶酶原)可以用來(lái)區(qū)分致病和非致病的形式。如此，使用先前所述的抗原肽來(lái)產(chǎn)生抗體，并評(píng)估它們區(qū)分致病和非致病形式的能力。然而，由于朊病毒蛋白的相對(duì)非免疫原性特性，已證實(shí)很難產(chǎn)生對(duì)致病形式具特異性的抗體。參見，例如，R.A.Williamson等，《朊病毒生物學(xué)及疾病》“抗體作為探究朊病毒蛋白生物學(xué)的工具”，S.Prusiner編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，717-741頁(yè)。
如本文所述的某些肽優(yōu)先與致病性(PrPSc)朊病毒蛋白相互作用，這一發(fā)現(xiàn)就使發(fā)展出新型的診斷、檢測(cè)試驗(yàn)和治療等成為可能。因此，本發(fā)明涉及肽試劑，以及涉及使用這些肽試劑的檢測(cè)試驗(yàn)和診斷試驗(yàn)，使用這些肽試劑的純化或分離方法和含有這些肽試劑的治療組合物。還提供了編碼這些肽試劑的多核苷酸，和使用這些肽試劑產(chǎn)生的抗體。本文所述的肽試劑、多核苷酸和/或抗體可用在檢測(cè)致病性朊病毒存在情況(例如，生物樣品中)的組合物和方法中。此外，本發(fā)明還涉及使用這些肽試劑、抗體和/或多核苷酸作為治療性或預(yù)防性組合物的組分的方法。
本發(fā)明使用的肽試劑(和編碼這些肽試劑的多核苷酸)包括，相比較于非致病性異型，優(yōu)先與致病性異型相互作用的肽。例如，在某些實(shí)施方式中，如本文所述的肽試劑特異地結(jié)合構(gòu)象病蛋白的致病形式，而不與非致病形式相結(jié)合(或結(jié)合程度較低)。本文所述的肽試劑(和編碼所述肽試劑的多核苷酸)可以用來(lái)，例如，產(chǎn)生抗體。這些抗體可以識(shí)別致病形式、非致病形式或兩者。這些分子可以單獨(dú)使用，或以各種組合用在診斷試驗(yàn)和/或預(yù)防或治療組合物中。
本發(fā)明的實(shí)施采用，除非另外說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)傳統(tǒng)的化學(xué)、生化、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥學(xué)方法。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見，例如，雷明頓藥物科學(xué)(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(Easton，PennsylvaniaMack Publishing Company，1990)；酶學(xué)方法(S.Colowick和N.Kaplan編，Academic Press，Inc.)；和實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，編，1986，Blackwell Scientific Publications)；Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第二版，1989)；表面和膠體化學(xué)手冊(cè)(Birdi，K.S.編，CRC Press，1997)；分子生物學(xué)簡(jiǎn)要方案，第四版(Ausubel等編，1999，John Wiley & Sons)；分子生物學(xué)技術(shù)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室課程，(Ream等編，1998，Academic Press)；PCR(生物技術(shù)介紹系列)，第二版(Newton & Graham編，1997，Springer Verlag)；Peters和Dalrymple，F(xiàn)ields Virology(第二版)，F(xiàn)ields等編，B.N.Raven Press，New York，NY。
可以理解的是本發(fā)明的肽試劑、抗體和方法不僅限于具體的配方或處理參數(shù)，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以有所變動(dòng)。同樣可以理解的是本文使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
的目的，而不用以限制本發(fā)明。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都全文引入本文作為參考。
I.定義為了便于理解本發(fā)明，對(duì)本申請(qǐng)中選擇使用的術(shù)語(yǔ)做以下描述。
術(shù)語(yǔ)″朊病毒″、″朊病毒蛋白″、″PrP蛋白″和″PrP″在本文中可以互換使用，指的是蛋白質(zhì)的致病形式(也稱為羊瘙癢病蛋白、蛋白質(zhì)致病形式、致病異型、致病性朊病毒和PrPSc)和非致病形式(也稱為細(xì)胞蛋白形式、細(xì)胞異型、非致病異型、非致病性朊病毒蛋白、和PrPC)，以及變性形式和朊病毒蛋白的各種重組形式，它們可以不含有致病構(gòu)象或不含有正常的細(xì)胞構(gòu)象。蛋白質(zhì)的致病形式與人和動(dòng)物中的疾病狀態(tài)(海綿樣腦病)相關(guān)；非致病形式正常情況下存在于動(dòng)物細(xì)胞中，并可在合適的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒缘腜rPSc構(gòu)象。在很多哺乳動(dòng)物種類(包括人、羊、牛和小鼠)中天然產(chǎn)生朊病毒。人朊病毒蛋白的代表氨基酸序列列于SEQ ID NO1。小鼠朊病毒蛋白的代表氨基酸序列利于SEQ ID NO2。其它代表性的序列列于圖2中。
如本文所述，術(shù)語(yǔ)″致病性″可以指蛋白質(zhì)實(shí)際上引起疾病，或可以簡(jiǎn)單地指蛋白質(zhì)與疾病相關(guān)，并因此在疾病存在時(shí)存在。因此，與本發(fā)明公開關(guān)聯(lián)使用的致病性蛋白質(zhì)不一定是某種疾病的特異性致病蛋白。致病形式可以是或可以不是感染性的。術(shù)語(yǔ)“朊病毒的致病形式”更具體是指哺乳動(dòng)物、禽或重組朊病毒蛋白的構(gòu)象和/或富含β折疊的構(gòu)象。通常，富含β折疊的構(gòu)象是具蛋白酶K抗性的。用于指構(gòu)象病蛋白質(zhì)形式時(shí)，術(shù)語(yǔ)“非致病性”和“細(xì)胞的”可以互換使用指其存在與疾病不相關(guān)的蛋白質(zhì)的正常異型。
此外，本文使用的″朊病毒蛋白″或“構(gòu)象病蛋白”不僅限于與本文所述多肽具有完全相同序列的多肽。顯而易見的是，該術(shù)語(yǔ)包括來(lái)自任何已識(shí)別或未識(shí)別的物種或疾病(例如，阿爾茲海默氏病，帕金森，等等)的構(gòu)象病蛋白質(zhì)。在閱讀本發(fā)明的公開和技術(shù)之后，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在任何其它朊病毒蛋白中確定對(duì)應(yīng)于圖中所示序列的區(qū)域，使用例如，序列比對(duì)程序(例如，BLAST和其它本文所述程序)或結(jié)構(gòu)特征或基序的識(shí)別和比對(duì)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)″PrP基因″是用來(lái)描述任何表達(dá)朊病毒蛋白(包括已知的多態(tài)性和致病性突變)的遺傳物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“PrP基因”通常是指任何物種中編碼PrP蛋白任何形式的任何基因。一些熟知的PrP序列描述于Gabriel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899097-9101(1992)，和美國(guó)專利號(hào)5,565,186；5,763,740；5,792,901；和WO97/04814中，引入本文作為參考以揭示和描述這些序列。PrP基因可以來(lái)自任何動(dòng)物(包括本文所述的“宿主”和“受試”動(dòng)物)，及其任何和全部的多態(tài)性和突變形式，可以理解的是這些術(shù)語(yǔ)包括其它這樣的有待發(fā)現(xiàn)的PrP基因。這樣的基因表達(dá)的蛋白可以具備PrPC(非疾病)形式或PrPSc(疾病)形式。
如本文使用的″朊病毒相關(guān)疾病″是指全部或部分由致病性朊病毒蛋白(PrPSc)引起的疾病。朊病毒相關(guān)疾病包括，但不僅限于，羊瘙癢病、牛海綿樣腦病(BSE)、瘋牛病、貓海綿樣腦病、庫(kù)魯病、克-雅病(CJD)、克-雅病的新型變異形式(nvCJD)、慢性消耗性疾病(CWD)、Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)、和致命性家族性失眠癥(FFI)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“肽試劑”是指任何含有天然存在的或合成的氨基酸或氨基酸樣分子聚合物的化合物，包括但不僅限于，僅含有氨基和/或亞氨基分子的化合物。本發(fā)明的肽試劑優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白發(fā)生相互作用，它們通常來(lái)源于朊病毒蛋白的片段。術(shù)語(yǔ)“肽”可以和“寡肽”或“多肽”互換使用，使用這些術(shù)語(yǔ)時(shí)并不特指具體的大小。定義中還包括，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物的肽(包括，例如，非天然氨基酸、擬肽，等等)，具有取代連接(substituted linkage)的肽，以及其它本領(lǐng)域已知的修飾，天然存在的和非天然存在的(例如，合成的)。因此，合成的肽、二聚體、多聚體(例如，串聯(lián)重復(fù)、多抗原肽(MAP)形式、線性連接肽)、環(huán)化的、分支分子，等等，都包括在此定義內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還包括含有一種或多種N-取代甘氨酸殘基(“擬肽”)和其它合成氨基酸或肽的分子。(關(guān)于擬肽的描述，參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,831,005；5,877,278；和5,977,301；Nguyen等(2000)Chem Biol.7(7)463-473；和Simon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(20)9367-9371)。適用于本發(fā)明的肽的非限制性長(zhǎng)度包括長(zhǎng)度為3至5個(gè)殘基的肽，長(zhǎng)度為6至10個(gè)殘基(或其間任何整數(shù))的肽，長(zhǎng)度為11至20個(gè)殘基(或其間任何整數(shù))的肽，長(zhǎng)度為21至75個(gè)殘基(或其間任何整數(shù))的肽，長(zhǎng)度為75至100個(gè)殘基(或其間任何整數(shù))的肽，或長(zhǎng)度超過(guò)100個(gè)殘基的多肽。通常，適用于本發(fā)明的肽對(duì)于其目標(biāo)應(yīng)用可具有一個(gè)合適的最大長(zhǎng)度。優(yōu)選地，肽的長(zhǎng)度在3至100個(gè)殘基之間。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本文的指導(dǎo)容易地選擇最大長(zhǎng)度。此外，如本文所述的肽試劑，例如合成肽，可以包括其它分子，如標(biāo)記、接頭、或其它化學(xué)部分(例如，生物素、淀粉樣蛋白特異性染料如控制紅(Control Red)或硫磺素)。這些部分可以進(jìn)一步加強(qiáng)肽與朊病毒蛋白的相互作用和/或進(jìn)一步檢測(cè)朊病毒蛋白。
肽試劑還包括本發(fā)明氨基酸序列的衍生物，其含有一個(gè)或多個(gè)取代、插入和/或缺失，包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸。優(yōu)選地，衍生物與任何野生型或參考序列至少顯示出約50％的同一性，優(yōu)選地與本文所述的任何野生型或參考序列至少具有約70％的同一性，更優(yōu)選地至少約75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性?？梢杂孟挛乃龇椒ù_定序列(或百分)同一性。這些衍生物可以包括多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化，等等。
肽衍生物也可以包括對(duì)天然序列的修飾，如缺失、插入和取代(通常在自然界是保守的)，只要多肽仍舊保持所需的活性。這些修飾可以是有意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或者可以是偶然發(fā)生的，如通過(guò)產(chǎn)生某蛋白質(zhì)的宿主的突變或由于PCR擴(kuò)增引發(fā)的錯(cuò)誤。此外，可以產(chǎn)生具備以下的一種或多種效果的修飾降低毒性；提高對(duì)朊病毒蛋白的親和性和/或特異性；有利于細(xì)胞處理(例如，分泌、抗原呈遞，等等)；以及有利于呈遞給B細(xì)胞和/或T細(xì)胞。本文所述的多肽可以用重組的方法制備、合成、從天然來(lái)源中純化、或在組織培養(yǎng)中制備。
如本文使用的“片段”是指僅由天然存在的完整全長(zhǎng)蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)的一部分組成的肽。例如，包含蛋白質(zhì)C末端缺失和/或N-末端缺失的片段。通常，片段保留了其來(lái)源全長(zhǎng)多肽序列的一種、部分或全部功能。通常，片段含有天然蛋白質(zhì)中至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基；優(yōu)選地，天然蛋白質(zhì)中至少約8個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基；更優(yōu)選地，至少約10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。
如本領(lǐng)域已知的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”通常是指核酸分子?！岸嗪塑账帷笨梢园p鏈和單鏈序列，是指，但不僅限于，原核序列，真核mRNA，來(lái)源于病毒、原核或真核mRNA的cDNA，來(lái)源于病毒(例如RNA和DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)、原核DNA或真核(例如，哺乳動(dòng)物)DNA的基因組RNA和DNA序列，特別是合成的DNA序列。該術(shù)語(yǔ)還包括含有任何DNA和RNA的已知堿基類似物的序列，也包括對(duì)天然序列進(jìn)行的修飾，如缺失、插入和取代(在自然界中通常保守)。這些修飾可以是有意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可以是偶然產(chǎn)生的，如通過(guò)宿主的突變，包括編碼朊病毒的多核苷酸。多核苷酸的修飾可以具有任何幾項(xiàng)功能，包括，例如，利于多肽產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
多核苷酸可以編碼生物活性(例如，免疫原性或治療性的)蛋白質(zhì)或多肽。根據(jù)由多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)，多肽可以含有少至10個(gè)核苷酸，例如，當(dāng)多核苷酸編碼抗原或表位時(shí)。通常，多核苷酸編碼的肽至少具有18，19，20，21，22，23，24，25，30或者更多個(gè)氨基酸。
“多核苷酸編碼序列”或“編碼”所選多肽的序列，是指當(dāng)置于合適的調(diào)控序列(或“控制元件”)的控制下時(shí)，在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成(DNA的情況下)和翻譯成(mRNA的情況下)多肽的核酸分子。編碼序列的邊界由位于5′(氨基)末端的起始密碼子和位于3′(羧基)末端的翻譯終止密碼子所確定。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼序列的3′端。典型的“控制元件”，包括，但不僅限于，轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、和多聚腺苷酸序列；而翻譯調(diào)控子，如翻譯起始的優(yōu)化序列，例如，Shine-Dalgarno(核糖體結(jié)合位點(diǎn))序列，Kozak序列(也就是，翻譯的優(yōu)化序列，位于，例如，編碼序列的5′位置)，前導(dǎo)序列(異源或天然的)，翻譯起始密碼子(例如，ATG)，和翻譯終止序列。啟動(dòng)子可以包括可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(與啟動(dòng)子可操作性連接的多核苷酸序列的表達(dá)是由分析物、輔助因子、調(diào)控蛋白等所誘導(dǎo)的)，可抑制啟動(dòng)子(與啟動(dòng)子可操作性連接的多核苷酸序列的表達(dá)是由分析物、輔助因子、調(diào)控蛋白等所誘導(dǎo)的)和組成型啟動(dòng)子。
“可操作性連接”是指元件的排列順序，其中所述組分的配置能夠使其發(fā)揮它們通常具有的功能。因此，與編碼序列可操作連接的給定啟動(dòng)子能夠在有合適的酶存在的情況下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。啟動(dòng)子不需要與編碼序列毗鄰，只要它能發(fā)揮指導(dǎo)表達(dá)的功能即可。因此，例如，在啟動(dòng)子和編碼序列間可插入非翻譯然而轉(zhuǎn)錄的序列，而該啟動(dòng)子仍可以認(rèn)為與編碼序列“可操作性連接”。
本文用以描述核酸分子的“重組”核酸分子是指根據(jù)其來(lái)源或操作屬于半合成或合成來(lái)源的基因組多核苷酸、cDNA多核苷酸(1)不與其天然連接的多核苷酸的全部或部分相連的多核苷酸；和/或(2)與其天然連接的多核苷酸以外的多核苷酸相連的多核苷酸。本文使用的用以指蛋白質(zhì)或多肽的術(shù)語(yǔ)“重組”是指由重組多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生的多肽?！爸亟M宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”“細(xì)胞培養(yǎng)物”和其它此類術(shù)語(yǔ)表示以單細(xì)胞實(shí)體培養(yǎng)的原核微生物或真核細(xì)胞系，它們可以互換使用，指的是可以用作或已經(jīng)用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移DNA的受體的細(xì)胞，包括已轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的后代。可以理解的是，由于偶然地或有意地突變，單一親代細(xì)胞的后代可以不一定與原始親代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA上完全相同。通過(guò)相關(guān)特性，如編碼所需肽的核苷酸序列的存在情況，所表征的與親代足夠相似的親代細(xì)胞的后代包括在本定義的后代中，并被上述術(shù)語(yǔ)所涵蓋。
在指多核苷酸或多肽時(shí)，“分離的”是指所述分子是單獨(dú)的、與完整的生物體分離，該分子天然存在于此生物體中，或者當(dāng)該多核苷酸或多肽天然不存在時(shí)，基本上不含有其它生物大分子，而使該多核苷酸或多肽可以用于其設(shè)想的目的。
如本領(lǐng)域已知，“抗體”包括一種或多種通過(guò)化學(xué)或物理方法可以結(jié)合到或締合目的多肽表位的生物部分。例如，本發(fā)明的抗體可以與朊病毒的致病構(gòu)象優(yōu)先發(fā)生相互作用(例如，特異地結(jié)合)。術(shù)語(yǔ)“抗體”包括從多克隆和單克隆方法制備的抗體，以及以下抗體雜交(嵌合)抗體分子(參見，例如，Winter等(1991)Nature 349293-299；和美國(guó)專利號(hào)4,816,567；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共價(jià)結(jié)合的異二聚體，參見，例如，Inbar等(1972)Proc Natl AcadSci USA 692659-2662；和Ehrlich等(1980)Biochem194091-4096)；單鏈Fv分子(sFv)(參見，例如，Huston等(1988)Proc Natl Acad Sci USA855897-5883)；二聚體和三聚體的抗體片段構(gòu)建物；小型抗體(minibodies)(參見，例如，Pack等(1992)Biochem 311579-1584；Cumber等(1992)JImmunology 149B120-126)；人化抗體分子(參見，例如，Riechmann等(1988)Nature 332323-327；Verhoeyan等(1988)Science 2391534-1536；和英國(guó)專利出版號(hào)GB 2,276,169，出版于1994年9月21日)；以及來(lái)自這些分子的任何功能性片段，其中這些片段保留了親代抗體分子的免疫結(jié)合特性。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括通過(guò)非傳統(tǒng)的步驟，如噬菌體展示，獲得的抗體。
如本文使用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指具有均質(zhì)抗體群體的抗體組合物。該術(shù)語(yǔ)不局限抗體的種類或來(lái)源，也不在其制備方法上受到限制。因此，該術(shù)語(yǔ)包括來(lái)自鼠雜交瘤的抗體，以及使用人而不是鼠雜交瘤獲得的人單克隆抗體。參見，例如，Cote等，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，1985，77頁(yè)。
如果希望使用多克隆抗體，通常用免疫原性的組合物(例如，如本文所述的肽試劑)免疫選擇的哺乳動(dòng)物(例如，小鼠、兔、山羊、馬，等等)。收集免疫動(dòng)物的血清，再根據(jù)已知程序進(jìn)行處理。如果含有抗所選擇肽試劑的多克隆抗體的血清還含有其它抗原的抗體，則可以用免疫親和層析純化該多克隆抗體。生產(chǎn)和處理多克隆抗血清的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如，Mayer和Walker編，(1987)《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Academic Press，London)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以很容易制備抗本文所述肽試劑的單克隆抗體。用雜交瘤制備單克隆抗體的常用方法是熟知的?？梢杂眉?xì)胞融合方法生產(chǎn)永生的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系，也可以用其它技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用EB(Epstein-Barr)病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參見，例如，M.Schreier等(1980)《雜交瘤技術(shù)》；Hammerling等(1981)，《單克隆抗體和T細(xì)胞雜交瘤》；Kennett等(1980)《單克隆抗體》；以及參見，美國(guó)專利號(hào)4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。
如本文使用，“單結(jié)構(gòu)域抗體”(dAb)是由一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的抗體，其與指定的抗原特異結(jié)合。dAb不含有VL結(jié)構(gòu)域，但是可以含有其它的已知存在于抗體中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如，κ和λ結(jié)構(gòu)域。制備dab的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Ward等，Nature 341544(1989)。
抗體也可以由VH和VL結(jié)構(gòu)域組成，以及其它已知的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些類型抗體的實(shí)例以及它們的制備方法是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4,816,467，引入本文作為參考)，包括以下這些。例如，“脊椎動(dòng)物抗體”是指四聚體的抗體或其聚集體，包含通常以″Y″構(gòu)型聚集的輕鏈和重鏈，其在鏈之間可以有或沒(méi)有共價(jià)連接。在脊椎動(dòng)物抗體中，鏈的氨基酸序列與脊椎動(dòng)物體產(chǎn)生(原位或體外(例如，在雜交瘤中))的抗體序列同源。脊椎動(dòng)物抗體包括，例如，純化的多克隆抗體和單克隆抗體，它們的制備方法描述于下文中。
“雜交抗體”中的鏈分別與哺乳動(dòng)物抗體鏈同源，并代表它們的新型裝配，這樣兩種不同的抗原可由四聚體或聚集體沉淀下來(lái)。在雜交抗體中，一對(duì)重鏈和輕鏈與對(duì)第一種抗原產(chǎn)生的抗體中的鏈同源，而第二對(duì)鏈則與對(duì)第二種抗原產(chǎn)生的抗體中的鏈同源。這樣就得到“二價(jià)”特性，也就是，與兩種抗原同時(shí)結(jié)合的能力。也可以使用嵌合鏈形成這樣的雜交抗體，如下文所述。
“嵌合抗體”是指其中的重鏈和/或輕鏈?zhǔn)侨诤系鞍椎目贵w。通常，鏈的氨基酸序列的一部分與來(lái)源于某一特定物種或特定綱的抗體的對(duì)應(yīng)序列同源，而鏈的其余部分則與來(lái)源于另一物種和/或另一綱的序列同源。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)擬似來(lái)源于一種脊椎動(dòng)物的抗體可變區(qū)或抗體，而其恒定區(qū)則與來(lái)源于另一種脊椎動(dòng)物的抗體中的序列同源。然而，該定義并不局限于此特定實(shí)例。還包括重鏈或輕鏈之一或兩者由擬似不同來(lái)源抗體中序列的序列組合而組成的任何抗體，不論這樣的來(lái)源是不同的綱或是不同的種，也不管融合點(diǎn)是否位于可變區(qū)/恒定區(qū)的交界處。因此，產(chǎn)生的抗體可以是其恒定區(qū)或可變區(qū)均不與已知抗體序列擬似的抗體。這樣，可以，例如構(gòu)建其可變區(qū)對(duì)特定抗原具有更高特異親和性的抗體，或其恒定區(qū)可以引發(fā)增強(qiáng)的補(bǔ)體結(jié)合，或在特定恒定區(qū)具有的特性上進(jìn)行其它改進(jìn)。
另一實(shí)例是“變化的抗體”，是指脊椎動(dòng)物抗體中天然存在的氨基酸序列已經(jīng)發(fā)生改變。利用重組DNA技術(shù)，可以重新設(shè)計(jì)抗體以獲得所需的特性?？赡艿淖兓泻芏?，從改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸到完全重新設(shè)計(jì)一個(gè)區(qū)域，例如，恒定區(qū)。通常，恒定區(qū)中的變化可以獲得所需的細(xì)胞處理特性，例如，補(bǔ)體結(jié)合的改變，與膜相互作用的改變，及其它效應(yīng)子功能的改變?？梢詫?duì)可變區(qū)進(jìn)行變化來(lái)改變抗原結(jié)合特性。也可以設(shè)計(jì)抗體以輔助將分子或物質(zhì)遞送到特定的細(xì)胞或組織區(qū)域?？梢杂梅肿由飳W(xué)已知的技術(shù)進(jìn)行所需的改變，例如，重組技術(shù)，定點(diǎn)誘變，等等。
還有另一個(gè)實(shí)例是“單價(jià)抗體”，它是由重鏈/輕鏈二聚體結(jié)合到第二條重鏈的Fc(也就是，莖部)區(qū)域而形成的聚集體。此類抗體逃過(guò)抗原調(diào)節(jié)。參見，例如，Glennie等，Nature 295712(1982)。包含在此定義內(nèi)的抗體還有抗體的″Fab″片段?！錐ab″區(qū)域是指重鏈和輕鏈中與包含重鏈和輕鏈分支部分序列近似等同或類似的部分，并且已經(jīng)顯示該區(qū)域?qū)μ囟ǖ目乖憩F(xiàn)出免疫結(jié)合，但其缺乏效應(yīng)器Fc部分?！錐ab″包括一條重鏈和一條輕鏈的聚集體(常稱為Fab′)，以及含有2H和2L鏈的四聚體(稱為F(ab)2)，其能夠與指定的抗原或抗原家族選擇性地發(fā)生反應(yīng)。Fab抗體可以與如上所述類似地分為幾個(gè)亞組，也就是“脊椎動(dòng)物Fab”、“雜交Fab”、“嵌合Fab”、和“變化的Fab”。生產(chǎn)抗體Fab片段的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，蛋白水解和用重組技術(shù)合成。
″抗原-抗體復(fù)合物″是指由特異結(jié)合到抗原上某一表位的抗體形成的復(fù)合物。
如果肽(或肽試劑)與另一肽或蛋白質(zhì)特異地、非特異地或以特異和非特異的某種組合形式相結(jié)合，則說(shuō)該肽(或肽試劑)與另一肽或蛋白質(zhì)發(fā)生“相互作用”。如果肽(或肽試劑)與朊病毒蛋白的致病形式結(jié)合的親和性和/或特異性比其與非致病異型結(jié)合的親和性和/或特異性高，則說(shuō)肽(或肽試劑)“優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白相互作用”。優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白發(fā)生相互作用的肽試劑也在本文中稱作致病性朊病毒特異性的肽試劑。可以理解的是，優(yōu)先的相互作用不一定需要有各肽中特定氨基酸殘基和/或基序之間的相互作用。例如，在某些實(shí)施方式中，本文所述的肽試劑優(yōu)先與致病異型發(fā)生相互作用，但是它可能能夠與非致病異型以較弱的，卻可以檢測(cè)的水平(例如，對(duì)感興趣的多肽顯示出10％或更低的結(jié)合)相結(jié)合。通常，與感興趣的化合物或多肽之間的較弱的結(jié)合，或背景結(jié)合，可以很容易地與優(yōu)先相互作用區(qū)分開來(lái)，例如，使用合適的對(duì)照。通常，在存在106倍過(guò)量的非致病形式的情況下，本發(fā)明的肽仍與致病性朊病毒相結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“親和性”是指結(jié)合的強(qiáng)度，可以定量地表示為解離常數(shù)(Kd)。優(yōu)選地，優(yōu)先與致病異型相互作用的肽(或肽試劑)其與致病異型的相互作用親和性比其與非致病異型的相互作用親和性優(yōu)選地至少高2倍，更優(yōu)選地，至少高10倍，更優(yōu)選地，至少高100倍?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定結(jié)合親和性(也就是，Kd)。
確定氨基酸序列“相似性”或“百分同一性”的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。通常，“相似性”是指兩個(gè)或更多多肽在合適的位置進(jìn)行的氨基酸對(duì)氨基酸的比對(duì)，其中氨基酸是相同的或具有相似的化學(xué)和/或物理特性，如電荷或疏水性。然后，就可以在比較的多肽序列之間確定所定義的術(shù)語(yǔ)“百分同一性”。確定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，包括確定基因mRNA的核苷酸序列的技術(shù)(通常通過(guò)cDNA中間物)并確定其編碼的氨基酸序列，再將其與第二個(gè)氨基酸序列加以比較。通常，“同一性”是指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸完全相同。
可以通過(guò)確定它們的“百分同一性”來(lái)比較兩個(gè)或多個(gè)氨基酸或多核苷酸序列。可以對(duì)兩個(gè)分子(一個(gè)參考序列及一個(gè)與參考序列的％同一性未知的序列)之間的序列信息直接進(jìn)行比較來(lái)確定“百分同一性”比對(duì)序列，對(duì)兩個(gè)比對(duì)序列之間完全相同的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，除以參考序列的長(zhǎng)度，并將所得結(jié)果乘以100?？梢允褂煤芊奖惬@得的計(jì)算機(jī)程序來(lái)輔助分析，如ALIGN，Dayhoff，M.O.，蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖冊(cè)，M.O.Dayhoff編，5增刊3353-358，國(guó)家生物醫(yī)藥研究基金會(huì)，Washington，DC，其采用的是Smith和Waterman的局部同一性算法，Advances in Appl.Math.2482-489，1981用于肽分析。確定核苷酸序列同一性的程序可以獲自Wisconsin序列分析包，第8版(可購(gòu)自Genetics ComputerGroup，Madison，WI)例如，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和GAP程序，其也依賴于Smith和Waterman的算法?？梢圆捎蒙a(chǎn)商推薦的以及上述Wisconsin序列分析包中描述的缺省參數(shù)很容易地運(yùn)用這些程序。例如，可以使用Smith和Waterman的同源性算法來(lái)確定特定核苷酸序列對(duì)參考序列的百分同一性，使用缺省評(píng)分表和6個(gè)核苷酸位置的間隙罰分。
在本發(fā)明背景下的確定百分同一性的另一種方法是使用MPSRCHTM程序包，愛(ài)丁堡大學(xué)版權(quán)所有，開發(fā)者為John F.Collins和Shane S.Sturrok，可獲自多個(gè)來(lái)源，例如在因特網(wǎng)上。從這組程序包中，可以采用Smith-Waterman算法，其中將缺省參數(shù)用于評(píng)分表(例如，間隙開放罰分12，間隙延伸罰分1，間隙6)。從數(shù)據(jù)產(chǎn)生的“配對(duì)”值反映出“序列同一性”。用于計(jì)算序列之間百分同一性或相似性的其它合適程序是本領(lǐng)域所熟知的，例如，另一個(gè)比對(duì)程序是BLAST，采用缺省參數(shù)。例如，可以使用下列缺省參數(shù)來(lái)運(yùn)用BLASTN和BLASTP遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；濾過(guò)＝?jīng)]有；鏈＝兩者；截?cái)嘀担?0；期望＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50個(gè)序列；選擇＝高分；數(shù)據(jù)庫(kù)＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。很容易獲得這些程序的細(xì)節(jié)。
如本文使用的“免疫原性組合物”是指將其施用給對(duì)象時(shí)，能夠在對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的任何組合物(例如，肽、抗體和/或多核苷酸)?？梢詫⒚庖咴越M合物直接導(dǎo)入接受對(duì)象中，如通過(guò)注射，吸入，口服或鼻內(nèi)或其它任何胃腸道外或粘膜施用途徑(例如，直腸內(nèi)或陰道內(nèi))。
“表位”是指特異性B細(xì)胞和/或T細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答的抗原上的區(qū)域，這使該分子(包括該表位)能夠引發(fā)免疫原性反應(yīng)或能夠與存在于生物樣品中的抗體發(fā)生反應(yīng)。該術(shù)語(yǔ)也可以和“抗原決定簇”或“抗原決定區(qū)”互換使用。表位可以包含3個(gè)或更多氨基酸，其具有表位獨(dú)特的空間構(gòu)象。通常，表位至少含有5個(gè)這樣的氨基酸，更通常，含有至少8-10個(gè)這樣的氨基酸。確定氨基酸空間構(gòu)象的方法是本領(lǐng)域已知的，包括，例如，x射線晶體學(xué)和2-維核磁共振。此外，使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)很容易可以在給定的蛋白質(zhì)中確定表位，如使用疏水性研究和通過(guò)定點(diǎn)血清學(xué)。也可參見，Geysen等，Proc.Natl.Acad Sci.USA(1984)813998-4002(快速合成肽以在給定的抗原中確定免疫原性表位位置的常用方法)；美國(guó)專利號(hào)4,708,871(識(shí)別和化學(xué)合成抗原表位的方法)；以及Geysen等，Molecular Immunoogy(分子免疫學(xué))(1986)23709-715(識(shí)別對(duì)給定抗體具有高親和性的肽的技術(shù))。可以在簡(jiǎn)單的免疫測(cè)定中(顯示出一種抗體具有阻礙另一種抗體與靶抗原結(jié)合的能力)鑒定出識(shí)別相同表位的抗體。
如本文使用的“免疫應(yīng)答”是指在對(duì)象中對(duì)如本文所述的肽(當(dāng)多肽存在于疫苗組合物中)產(chǎn)生體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些抗體也可以中和感染性，和/或介導(dǎo)抗體-補(bǔ)體或抗體依賴細(xì)胞毒性，以給經(jīng)過(guò)免疫的宿主提供保護(hù)?？梢栽跇?biāo)準(zhǔn)的免疫測(cè)定中確定免疫反應(yīng)性，如本領(lǐng)域所熟知的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)驗(yàn)。
“基因轉(zhuǎn)移”或“基因遞送”是指可靠地將感興趣的DNA插入到宿主細(xì)胞中的方法或系統(tǒng)。這樣的方法可以使非整合的轉(zhuǎn)移的DNA瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行染色體外復(fù)制和轉(zhuǎn)移的復(fù)制子(例如，游離體)表達(dá)，或?qū)⑥D(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞的基因組DNA中?；蜻f送表達(dá)載體包括，但不僅限于，來(lái)源于甲病毒、痘病毒和牛痘病毒的載體。用于免疫時(shí)，這樣的基因遞送表達(dá)載體可以指疫苗或疫苗載體。
術(shù)語(yǔ)“樣品”包括生物和非生物樣品。生物樣品是那些從活的或曾經(jīng)存活的生物體中獲得或來(lái)源的樣品。非生物樣品不來(lái)源于活的或曾經(jīng)存活的生物體。生物樣品包括，但不僅限于，來(lái)自動(dòng)物(活的或死的)的樣品，如器官(例如，腦、肝、腎，等等)，全血，血液部分，血漿，腦脊液(CSF)，尿，淚液，組織，器官，活組織檢查。非生物樣品的實(shí)例包括藥物、食物、化妝品，等等。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”和“可檢測(cè)標(biāo)記”是指能夠檢測(cè)的分子，包括，但不僅限于，放射性同位素、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、酶的底物、酶的輔因子、酶的抑制劑、發(fā)色團(tuán)，染料、金屬離子、金屬鹽、配體(例如，生物素或半抗原)等等。術(shù)語(yǔ)“熒光物質(zhì)”是指一種物質(zhì)或其部分能夠在可檢測(cè)的范圍內(nèi)顯示熒光。可以和本發(fā)明一起使用的標(biāo)記的特定實(shí)例包括，但不僅限于，熒光素、羅丹明、二甲氨基萘磺酰、傘形花內(nèi)酯、得克薩斯紅(Texas red)、魯米諾、acradimum酯、NADPH、β-半乳糖苷酶、辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶和脲酶。標(biāo)記也可以是表位標(biāo)簽(例如，His-His標(biāo)簽)，抗體或可擴(kuò)增或者可檢測(cè)的寡核苷酸。
II.綜述本文所述的是含有肽試劑(和/或編碼這些肽試劑的多核苷酸)的組合物，其中肽試劑能夠區(qū)分朊病毒蛋白的致病和非致病異型，例如，通過(guò)優(yōu)先與其中的一種形式發(fā)生相互作用而不優(yōu)先與另一種形式發(fā)生相互作用。也提供了使用這些肽試劑產(chǎn)生的抗體，以及含有這些肽試劑和/或抗體的組合物和制備及使用這些肽試劑和/或抗體的方法(例如，用于分離和/或檢測(cè)致病性朊病毒蛋白)。
本發(fā)明部分有賴于本發(fā)明者做出的以下發(fā)現(xiàn)，即相對(duì)小片段的朊病毒蛋白可以優(yōu)先與朊病毒的致病形式相互作用。這些片段不需要是更大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或其它類型支架分子的一部分即可表現(xiàn)出與朊病毒致病異型的優(yōu)先相互作用。盡管不希望受任何特殊理論的約束，然而這些肽片段似乎同時(shí)具有允許其與朊病毒致病異型相結(jié)合而不和朊病毒非致病異型相結(jié)合的構(gòu)象，這可能是通過(guò)擬似存在與非致病異型中的構(gòu)象的結(jié)果。這一總體原則，即構(gòu)象病蛋白的某些片段優(yōu)先與該構(gòu)象病蛋白(本文中指朊病毒)的致病形式發(fā)生相互作用，可以方便地運(yùn)用到其它構(gòu)象病蛋白中以產(chǎn)生優(yōu)先與致病形式相互作用的肽試劑。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，盡管片段提供了起始點(diǎn)(例如，在大小或序列特征方面)，但是可以對(duì)這些片段進(jìn)行多種修飾以產(chǎn)生具有更合乎需要特征的肽試劑(例如，更高的親和性，更好的穩(wěn)定性，更佳的溶解性，較低的蛋白酶敏感性，更好的特異性，更容易合成，等等)。
通常，本文所述的肽試劑能夠優(yōu)先與朊病毒蛋白的致病形式發(fā)生相互作用。因此，這些肽試劑就能容易地檢測(cè)致病性朊病毒蛋白的存在情況，所以事實(shí)上能在幾乎任何樣品包括生物樣品或非生物樣品(包括活體或死亡的腦、脊髓、或其它神經(jīng)系統(tǒng)組織以及血液)中容易地診斷朊病毒相關(guān)疾病。
此外，可以使用本文所述的肽試劑來(lái)產(chǎn)生抗體，這些抗體可以用在診斷性或治療性組合物和方法中。特別地，當(dāng)肽試劑和/或抗體優(yōu)先與致病性蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，可以用其檢測(cè)致病異型的存在情況，例如，通過(guò)排列(ordering)聚集或其它方式誘導(dǎo)致病形式的蛋白質(zhì)成為可以被檢測(cè)到的狀態(tài)。本文所述的肽試劑可以用在各種診斷試驗(yàn)中，包括在含血液的樣品中檢測(cè)致病形式?？梢詷?biāo)記或標(biāo)志抗體和/或肽試劑(或它們的一個(gè)或多個(gè)組成部分)以利于檢測(cè)和/或增強(qiáng)其與朊病毒蛋白的相互作用。
此外，可以使用任何合適的信號(hào)放大系統(tǒng)進(jìn)一步有利于檢測(cè)，包括但不僅限于，使用分支DNA用于信號(hào)放大(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,681,697；5,424,413；5,451,503；5,4547,025；和6,235,483)；應(yīng)用靶向擴(kuò)增技術(shù)如PCR，滾環(huán)擴(kuò)增，Third Wave′s invader(Arruda等，2002 Expert.Rev.Mol.Diagn.2487；美國(guó)專利號(hào)6090606，5843669，5985557，6090543，5846717)，NASBA，TMA，等等(美國(guó)專利號(hào)6,511,809；EP0544212A1)；和/或免疫-PCR技術(shù)(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,665,539；國(guó)際出版物WO 98/23962；WO 00/75663；和WO 01/31056)。
此外，本文所述的肽試劑和抗體可以單獨(dú)或以任何組合形式使用，來(lái)治療或預(yù)防疾病。
III.A.肽試劑本文所述的肽試劑與構(gòu)象病蛋白的致病形式發(fā)生相互作用。本文以朊病毒蛋白作為構(gòu)象病蛋白的示例。
下表非限制性地列舉了其相關(guān)蛋白具有兩種或多種不同構(gòu)象的疾病。


此外，以上列舉的構(gòu)象病蛋白中的每一個(gè)都包括很多變異及突變，這樣得到的不同種類都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。下文列出了對(duì)小鼠朊病毒蛋白的各個(gè)區(qū)域及序列進(jìn)行的功能分析。也可以參見，Priola(2001)Adv.Protein Chem.571-27。可以根據(jù)本文所述的標(biāo)準(zhǔn)步驟和指導(dǎo)容易地確定其它物種中對(duì)應(yīng)于下表列舉的小鼠(Mo)，倉(cāng)鼠(Ha)，人(Hu)，禽(A)和羊(Sh)的區(qū)域和殘基。



同樣應(yīng)當(dāng)指出的是，朊病毒蛋白(及其它構(gòu)象病蛋白)對(duì)于相同的氨基酸序列具有兩種不同的三維構(gòu)象。一種構(gòu)象與疾病特征相關(guān)并通常是不可溶的，而另一種構(gòu)象不與疾病特征相關(guān)且是可溶的。參見，例如，Wille，等，″用電子結(jié)晶學(xué)對(duì)羊瘙癢病朊病毒蛋白進(jìn)行的結(jié)構(gòu)研究″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99(6)3563-3568(2002)。盡管用朊病毒蛋白作為示例，本發(fā)明并不僅限于列出的疾病、蛋白和種類。
因此，在某些方面，本文所述的肽試劑含有從天然存在的蛋白衍生而來(lái)的氨基酸序列，例如，構(gòu)象病蛋白(例如，朊病毒蛋白)，或者是含有的基序或序列與朊病毒蛋白表現(xiàn)出同源性的蛋白。具體地，本發(fā)明的肽試劑通常是由天然存在的朊病毒蛋白衍生而來(lái)的。優(yōu)選地，肽試劑衍生自朊病毒蛋白某些區(qū)域的氨基酸序列。以小鼠朊病毒序列(SEQ ID NO2)來(lái)示例這些優(yōu)選的區(qū)域，氨基酸殘基23-43和85-156的區(qū)域，及其亞區(qū)域。本發(fā)明并不僅限于從小鼠序列衍生而來(lái)的肽試劑，而是包括以如上文所述類似的方式從任何物種(包括，人、牛、羊、鹿、麇鹿、倉(cāng)鼠)的朊病毒序列衍生而來(lái)的肽試劑。衍生自朊病毒蛋白時(shí)，本文所述的肽試劑可以包括聚脯氨酸II型螺旋基序。該基序通常含有一般序列PxxP(例如，SEQ ID NO1的殘基102-105)，盡管已經(jīng)提出其它序列，具體是丙氨酸四肽，也可以形成聚脯氨酸II型螺旋(參見，例如，Nguyen等ChemBiol.2000 7463；Nguyen等，Science 1998 2822088；Schweitzer-Stenner等J.Am.Chem Soc.2004 1262768)。在PxxP序列中，″x″可以是任何的氨基酸而″P″在天然存在的序列中是脯氨酸，但在本發(fā)明的肽試劑中可以由脯氨酸替代物所替換。這樣的脯氨酸替代物包括通常稱為擬肽的N-取代甘氨酸。因此，在包括基于PxxP序列的脯氨酸II型螺旋的本發(fā)明肽試劑中，″P″代表脯氨酸或N-取代甘氨酸殘基，而″x″則代表任何氨基酸或氨基酸類似物。本文所述尤其優(yōu)選N-取代甘氨酸。
此外，已知由多個(gè)不同物種產(chǎn)生的朊病毒蛋白的多核苷酸和氨基酸序列，這些包括人、小鼠、羊和牛。這些序列的變體也存在于每個(gè)物種中。因此，本發(fā)明使用的肽試劑可以包含任何物種或變體的氨基酸序列的片段或衍生物。例如，在某些實(shí)施方式中，本文所述的肽試劑衍生自圖2列出的任何序列(SEQ IDNOs3-11)。本文具體公開的肽試劑序列總體是基于小鼠的朊病毒序列，然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地在合適時(shí)用來(lái)自其它物種的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行替換。例如，如果需要對(duì)人進(jìn)行診斷或治療，可以方便地用對(duì)應(yīng)于小鼠序列的人序列進(jìn)行替換。在一個(gè)具體實(shí)例中，從約85殘基至約112殘基的區(qū)域衍生而來(lái)的肽試劑(例如，SEQ ID NO35，36，37，40)中，可以用甲硫氨酸取代對(duì)應(yīng)于殘基109位置的亮氨酸，可以用甲硫氨酸取代對(duì)應(yīng)于殘基112位置的纈氨酸，可以用絲氨酸取代對(duì)應(yīng)于殘基97位置的天冬氨酸。類似地，如果需要對(duì)牛進(jìn)行診斷，可以對(duì)公開的肽序列進(jìn)行合適的取代以反應(yīng)牛朊病毒序列。因此，繼續(xù)用上述實(shí)例中從約85殘基至約112殘基的區(qū)域衍生而來(lái)的肽試劑，可以用甲硫氨酸取代對(duì)應(yīng)于殘基109位置的亮氨酸，可以用甘氨酸取代對(duì)應(yīng)于殘基97位置的天冬氨酸。也可以使用朊病毒蛋白的衍生物，包括對(duì)這些序列進(jìn)行的氨基酸取代、缺失、插入和其它突變。優(yōu)選地，任何對(duì)朊病毒蛋白序列所做的氨基酸取代、插入和缺失不影響肽試劑與致病形式發(fā)生相互作用的能力。
應(yīng)當(dāng)理解的是，無(wú)論用于本文所述肽試劑的來(lái)源是什么，這些肽試劑不一定要與已知的朊病毒蛋白表現(xiàn)出序列同源性。因此，本文所述的肽試劑可以包括相對(duì)于天然存在的朊病毒蛋白或本文公開的序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入、和缺失的序列，只要它們?nèi)耘f保留其優(yōu)先與構(gòu)象病蛋白的致病形式發(fā)生相互作用的能力。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是指那些發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族之內(nèi)的取代。遺傳編碼的氨基酸通常分為四個(gè)家族(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸，甘氨酸；(2)堿性氨基酸＝賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性氨基酸＝丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不帶電荷的極性氨基酸＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸有時(shí)也一起歸類為芳香族氨基酸。例如，可以合理地預(yù)測(cè)分別用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，用絲氨酸取代蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸進(jìn)行類似的保守取代，不會(huì)對(duì)生物學(xué)活性造成很大的影響。
同樣顯而易見的是可以使用天然氨基酸和非天然氨基酸類似物的任意組合來(lái)制備本文所述的肽試劑。經(jīng)常用到的非遺傳編碼的氨基酸類似物包括，但不僅限于，鳥氨酸(Orn)；氨基異丁酸(Aib)；苯并硫代苯丙氨酸(BtPhe)；脲基丙氨酸(Abz)；叔丁基甘氨酸(Tle)；苯基甘氨酸(PhG)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1-萘基丙氨酸(1-Nal)；2-噻吩丙氨酸(2-Thi)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)；高精氨酸(Har)；Na-甲基精氨酸(N-MeArg)；磷酸酪氨酸(pTyr或pY)；六氫吡啶羧酸(Pip)；4-氯苯丙氨酸(4-ClPhe)；4-氟苯丙氨酸(4-FPhe)；1-氨基環(huán)丙羧酸(1-NCPC)；和肌氨酸(Sar)。任何用在本發(fā)明肽試劑中的氨基酸可以是D-，或更典型的，L-異構(gòu)體。
可以用其它非天然存在的氨基酸類似物來(lái)形成本文所述的肽試劑，包括擬肽和/或肽擬似化合物，如氨基酸的磺酸和硼酸類似物，這些生物學(xué)功能等價(jià)物也可以用在本發(fā)明的化合物中，其包括具有一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵的化合物，可任選地用同電子排列體進(jìn)行取代。在本發(fā)明的背景下，例如，可用--CH2NH--，--NHCO--，--SO2NH--，--CH2O--，--CH2CH2--，--CH2S--，--CH2SO--，--CH--CH--(順式或反式)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--和1，5-二取代四唑來(lái)取代--CONH--，這樣由這些同電子排列體連接的基團(tuán)可以和用--CONH--連接的基團(tuán)具有相似的空間取向。本文所述肽試劑中的一個(gè)或多個(gè)殘基可以含有擬肽。
因此，肽試劑也可以含有一個(gè)或多個(gè)N-取代的甘氨酸殘基(含有一個(gè)或多個(gè)N取代的甘氨酸殘基的肽可以稱為“擬肽”)。例如，在某些實(shí)施方式中，本文所述任何肽試劑的一個(gè)或多個(gè)脯氨酸殘基由N取代甘氨酸殘基所取代。適用于此的特定的N取代甘氨酸殘基包括，但不僅限于，N-(S)-(1-苯乙基)甘氨酸；N-(4-羥苯基)甘氨酸；N-(環(huán)丙基甲基)甘氨酸；N-(異丙基)甘氨酸；N-(3，5-二甲氧基苯)甘氨酸；和N-丁基甘氨酸。(例如，圖3)。其它的N取代甘氨酸也可以用來(lái)取代本文所述肽試劑序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。關(guān)于這些和其它氨基酸類似物及肽擬似物的綜述，參見，Nguyen等(2000)Chem Biol.7(7)463-473；Spatola，A.F.，氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)，肽和蛋白質(zhì)，B.Weinstein編，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。也可以參見，Spatola，A.F.，肽骨架修飾(綜述)，Vega Data，卷1，第3期，(1983年3月)；Morley，TrendsPharm Sci(綜述)，463-468頁(yè)(1980)；Hudson，D.等，Int J Pept Prot Res，14177-185(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola等，Life Sci，381243-1249(1986)(--CH2--S)；Hann J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，307-314(1982)(--CH--CH--，順式和反式)；Almquist等，J Med Chem，231392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett，232533(1982)(--COCH2--)；Szelke等，European Appln.EP 45665 CA9739405(1982)(--CH(OH)CH2-)；Holladay等，Tetrahedron Lett，244401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；和Hruby，Life Sci，31189-199(1982)(--CH2--S--)；每一篇都引入本文作為參考。C末端羧酸可由硼酸--B(OH)2或硼酸酯--B(OR)2或其它這樣的硼酸衍生物取代，如美國(guó)專利號(hào)5,288,707所述，引入本文作為參考。
本文所述的肽試劑可以含有單體、多聚體、環(huán)狀分子、分支分子、接頭，等等。也考慮了本文所述任何序列或其生物學(xué)功能等價(jià)物的多聚體(也就是，二聚體、三聚體，等等)。多聚體可以是同型多聚體，也就是由相同的單體組成，例如，每個(gè)單體都是相同的肽序列?；蛘?，多聚體可以是異型多聚體，就是指不是所有組成多聚體的單體都是相同的。
可以通過(guò)單體之間的直接相互附著或直接將單體附著到基質(zhì)上形成多聚體，包括，例如，多抗原肽(MAPS)(例如，對(duì)稱的MAPS)，附著到聚合物支架上的肽，例如，PEG支架，和/或串聯(lián)連接的肽(之間有或沒(méi)有間隔單位)。
或者，可以將連接基團(tuán)添加到單體序列上而將單體連接在一起并形成多聚體。使用連接基團(tuán)形成的多聚體的非限制性實(shí)例包括使用甘氨酸接頭的串聯(lián)重復(fù)序列；MAPS通過(guò)接頭連接到基質(zhì)上和/或線性連接的肽通過(guò)接頭連接到支架上。連接基團(tuán)可以包括使用雙功能間隔單位(同型雙功能或異型雙功能)，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。用作實(shí)例而不作為限制，有許多方法可以整合連接的肽中的這樣的間隔單位，使用的試劑如琥珀酰亞胺-4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧化物(SMCC)，琥珀酰亞胺-4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺甲基苯)丁酸鹽等等，描述于Pierce免疫技術(shù)手冊(cè)(Pierce Chemical Co.，Rockville，Ill.)，可以購(gòu)自SigmaChemical Co.(St.Louis，Mo.)和Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，Wis.)，以及描述于″綜合有機(jī)轉(zhuǎn)化″，VCK-Verlagsgesellschaft，Weinheim/德國(guó)(1989)?？梢杂糜趯误w序列連接在一起的連接基團(tuán)的一個(gè)實(shí)例是--Y1--F--Y2，其中Y1和Y2是相同或不同的0-20個(gè)碳原子的烯烴基團(tuán)，優(yōu)選地0-8個(gè)碳原子，更優(yōu)選地0-3個(gè)碳原子，而F是一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)，如--O--，--S--，--S--S--，--C(O)--O--，--NR--，--C(O)--NR--，--NR--C(O)--O--，--NR--C(O)--NR--，--NR--C(S)--NR--，--NR--C(S)--O--。Y1和Y2可以任選地用羥基、烷氧基、羥基烷基、烷氧基烷基、氨基、羧基、羧基烷基等等加以取代。可以理解的是，單體的任何合適的原子都可以連接到連接基團(tuán)上。
此外，本發(fā)明的肽試劑可以是線形的，分支的或環(huán)狀的。單體單位可以是環(huán)狀的或可以連接在一起而以線形或分支的方式提供多聚體，以環(huán)狀的形式(例如，大環(huán))，以星形(樹突狀)或球形(例如，呋侖碳)。熟練的技術(shù)人員很容易識(shí)別可以由本文公開的單體序列形成的很多多聚物。在某些實(shí)施方式中，多聚體是環(huán)形二聚體。使用如上所述相同的術(shù)語(yǔ)，二聚體可以是同型二聚體或異型二聚體。
可以用上述連接中的任何一種制備環(huán)形的單體或多聚體，如，但不僅限于，例如(1)將N末端胺與C末端羧酸環(huán)化，或者通過(guò)在氮和C末端羧基之間直接形成酰胺鍵，或者通過(guò)間隔基團(tuán)中間物，例如，用ε氨基羧酸進(jìn)行縮合；(2)在兩個(gè)殘基的側(cè)鏈之間成鍵而環(huán)化，例如，通過(guò)在天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈和賴氨酸側(cè)鏈之間形成酰胺鍵，或通過(guò)在兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈之間形成二硫鍵或在青霉胺和半胱氨酸側(cè)鏈之間成鍵，或在兩個(gè)青霉胺側(cè)鏈之間成鍵；(3)通過(guò)在一個(gè)側(cè)鏈(例如，天冬氨酸或賴氨酸)和N末端氨基或C末端羧基之間形成酰胺鍵而環(huán)化；和/或(4)通過(guò)短碳間隔基團(tuán)中間物而連接兩個(gè)側(cè)鏈。
優(yōu)選地，本文所述肽試劑是非致病性的和/或非感染性的。
本發(fā)明肽試劑的長(zhǎng)度可以是3至約100個(gè)殘基之間的任意長(zhǎng)度(或其間任意值)或更長(zhǎng)，優(yōu)選地從約4個(gè)至75個(gè)殘基(或其間任意值)，優(yōu)選地從約5個(gè)至約63個(gè)殘基(或其間任意值)，更優(yōu)選地從約8個(gè)至約30個(gè)殘基(或其間任意值)，最優(yōu)選的肽試劑的長(zhǎng)度為10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個(gè)殘基。
適用于本文所述組合物和方法的肽試劑的非限制性實(shí)例來(lái)源于表1和表4所示序列。表中的肽試劑是用傳統(tǒng)的單字母氨基酸符號(hào)所表示的，N末端在左側(cè)而C末端在右側(cè)。方括號(hào)中的氨基酸表示在不同的肽試劑中該位置可以選擇使用的殘基。圓括號(hào)表示殘基可以存在或不存在于肽試劑中。任何脯氨酸殘基都可以用N取代甘氨酸殘基取代以形成擬肽。表中的任何序列可以任意地在N和/或C末端含有Gly接頭(Gn，其中n＝1，2，3，或4)。
表1





在一個(gè)方面，本發(fā)明的肽試劑包括本文公開的每個(gè)肽及其衍生物(如本文所述)。因此，本發(fā)明包括由SEQ ID NO12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，11 1，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，或132的肽衍生而來(lái)的肽試劑。
本發(fā)明優(yōu)選地包括從SEQ ID NO12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，72，74，76，77，78，81，82，84，89，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，或132的肽衍生而來(lái)的肽試劑。
在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，肽試劑特異地結(jié)合到致病性朊病毒上，例如，從SEQ ID NOs66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127，14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82，或84的肽衍生而來(lái)的肽試劑，及其類似物(例如，用N取代的甘氨酸取代一個(gè)或多個(gè)脯氨酸)和衍生物。
如上文所述，本文所述的肽試劑可以包括一個(gè)或多個(gè)取代、插入、和/或突變。例如，可以用其它殘基(例如，丙氨酸殘基)或氨基酸類似物或N取代的甘氨酸殘基替換肽試劑中的一個(gè)或多個(gè)殘基以形成擬肽(參見，例如，Nguyen等(2000)Chem Biol.7(7)463-473)。
此外，本文所述的肽試劑也可以含有其它的肽或非肽組分。其它的肽或非肽組分的非限制性實(shí)例包括間隔殘基，例如位于一個(gè)末端或兩個(gè)末端的兩個(gè)或更多個(gè)甘氨酸(天然或衍生的)殘基或氨基己酸接頭，或可以輔助肽試劑溶解的殘基，例如酸性殘基，如天冬氨酸(Asp或D)，例如SEQ ID NOs83，86中所示。在某些實(shí)施方式中，例如，可以將肽試劑合成為多抗原肽(MAPs)。通常，將肽試劑的多個(gè)拷貝(例如，2-10個(gè)拷貝)直接合成到MAP載體上，如分支的賴氨酸或其它MAP載體核。參見，例如，Wu等(2001)J Am Chem Soc.2001123(28)6778-84；Spetzler等(1995)Int J Pept Proteiii Res.45(1)78-85。
可以包含在本文所述肽試劑中的非肽組分的非限制性實(shí)例(例如，化學(xué)部分)包括，一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記，標(biāo)簽(例如，生物素，His-標(biāo)簽，寡核苷酸)，染料，結(jié)合對(duì)的成員，等等，可以位于肽試劑的末端或內(nèi)部。也可以將非肽組分(例如，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的共價(jià)連接)直接地或通過(guò)間隔(例如，氨基基團(tuán))連接到化合物的某些位置上，這些位置由定量結(jié)構(gòu)活性數(shù)據(jù)和/或分子模型分析不會(huì)產(chǎn)生干擾。如本文所述的肽試劑也可以包括朊病毒特異性化學(xué)部分，如淀粉樣蛋白特異性染料(例如，剛果紅，硫磺素，等等)?；衔锏难苌?例如，標(biāo)記，環(huán)化，連接化學(xué)部分，等等)應(yīng)當(dāng)基本上不會(huì)干擾(甚至可能增強(qiáng))肽試劑的結(jié)合特性、生物學(xué)功能和/或藥理活性。
典型地，本發(fā)明的肽試劑與本文列出的朊病毒蛋白片段或肽序列至少具有約50％的同一性。優(yōu)選地，肽試劑與本文列出的朊病毒蛋白片段或肽序列至少具有70％的同一性，更優(yōu)選地至少約75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性。
如本文所述的肽試劑優(yōu)先與致病形式發(fā)生相互作用，并因此可以廣泛地用于分離、純化、檢測(cè)、診斷和治療中。例如，在肽試劑優(yōu)先與致病形式發(fā)生相互作用的實(shí)施方式中，可以用肽試劑本身檢測(cè)樣品中的致病形式，樣品如血液，神經(jīng)系統(tǒng)(腦、脊髓、CSF，等等)或其它組織或器官樣品。同樣，肽試劑也可用于診斷與致病形式相關(guān)的疾病，分離致病形式和通過(guò)去除致病形式而去除樣品的污染。
可以使用任何已知的結(jié)合試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)肽試劑與朊病毒蛋白的相互作用，例如，標(biāo)準(zhǔn)的免疫試驗(yàn)，如ELISA，Western印跡，等等。
檢測(cè)本發(fā)明肽試劑特異性的一個(gè)簡(jiǎn)便方法就是選擇含有致病性和非致病性朊病毒的樣品。通常，這樣的樣品包括來(lái)自患病動(dòng)物的腦或脊髓組織。將特異地與致病形式結(jié)合的如本文所述的肽試劑結(jié)合到固相支持物上(采用的方法是本領(lǐng)域已知的，并在下文中有進(jìn)一步描述)，并用它從其它樣品組分中分離(“下拉(pull down)”)致病性的朊病毒，從而獲得與固相支持物上的肽-朊病毒結(jié)合相互作用直接相關(guān)的定量數(shù)值。也可以使用該方法的改進(jìn)方法及其它本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)來(lái)證實(shí)本發(fā)明肽試劑的特異性。參見，例如，實(shí)施例。
盡管在使用本文所述的肽試劑時(shí)并不是所需的條件，但是這些試驗(yàn)可能利用了以下事實(shí)，即具有致病構(gòu)象的朊病毒通常對(duì)某些蛋白酶具有抗性，如蛋白酶K。相同的蛋白酶能夠降解非致病構(gòu)象的朊病毒。因此，在使用蛋白酶時(shí)，可以將樣品分為兩份相同的體積?？梢詫⒌鞍酌讣尤氲诙輼悠分?，并進(jìn)行相同的試驗(yàn)。因?yàn)榈诙輼悠分械牡鞍酌笗?huì)降解任何非致病性的朊病毒，所以第二份樣品中的任何肽-朊病毒結(jié)合相互作用都可以歸因于致病性的朊病毒。
因此，評(píng)估本文所述肽試劑的結(jié)合特異性和/或親和性的方法的非限制性實(shí)例包括標(biāo)準(zhǔn)的Western和Far-Western印跡方法；標(biāo)記的肽；ELISA類似試驗(yàn)；和/或基于細(xì)胞的試驗(yàn)。例如，Western印跡法，通常采用標(biāo)記過(guò)的一抗，其從SDS-PAGE膠中檢測(cè)到變性的朊病毒蛋白，該凝膠上的樣品來(lái)自“下拉(pulldown)”試驗(yàn)(如本文所述)，該樣品已經(jīng)用電印跡法轉(zhuǎn)移到硝化纖維素或PVDF上。識(shí)別變性朊病毒蛋白的抗體已有描述(描述于，Peretz等1997 J.Mol.Biol.273614；Peretz等2001 Nature 412739；Williamson等1998 J.Virol.729413；美國(guó)專利號(hào)6,765,088；美國(guó)專利號(hào)6,537548，等等)，一些是可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買到的。其它朊病毒結(jié)合分子已有描述，例如，基序嫁接雜交多肽(參見，WO03/085086)，某些陽(yáng)離子或陰離子聚合物(參見，WO03/073106)，某些作為“增殖催化劑(propagation catalysts)”的肽和纖維蛋白溶酶原(參見，WO02/0974444)。然后，用檢測(cè)標(biāo)簽(例如，鏈霉抗生物素偶聯(lián)的堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，ECL試劑，和/或可擴(kuò)增的寡核苷酸)的探針檢測(cè)(和/或擴(kuò)增)一抗。也可以使用檢測(cè)試劑來(lái)評(píng)估結(jié)合，如攜帶親和標(biāo)簽(例如，生物素)用檢測(cè)親和標(biāo)簽(例如，鏈霉抗生物素偶聯(lián)的堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，ECL試劑，和/或可擴(kuò)增的寡核苷酸)的探針標(biāo)記和擴(kuò)增的肽。此外，可以使用類似于夾心ELISA的微量滴定板方法，例如，使用本文所述的朊病毒特異性肽試劑將朊病毒蛋白固定在構(gòu)象支持物上(例如，微量滴定板的孔，珠，等等)，其它的檢測(cè)試劑可以包括，但不僅限于，具有親和性和/或檢測(cè)標(biāo)記的另一種朊病毒特異性肽試劑，如偶聯(lián)的堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，ECL試劑，或可擴(kuò)增的寡核苷酸。也可以采用基于細(xì)胞的試驗(yàn)，例如，直接在單個(gè)細(xì)胞上檢測(cè)朊病毒蛋白(例如，使用熒光標(biāo)記的朊病毒特異性肽試劑，這樣就能夠進(jìn)行基于熒光的細(xì)胞分選，計(jì)數(shù)，或檢測(cè)特異標(biāo)記的細(xì)胞)。
III.B.肽試劑的生產(chǎn)可以用多種方式制備本發(fā)明的肽試劑，所有的方法都是本領(lǐng)域所熟知的。
在一個(gè)實(shí)施方式中，肽試劑全部或部分是遺傳編碼的肽，可以使用本領(lǐng)域所熟知的重組技術(shù)來(lái)生產(chǎn)這樣的肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用本文的標(biāo)準(zhǔn)方法和指導(dǎo)很容易地確定編碼所需肽的核苷酸序列。一旦分離了重組的肽，可任選地對(duì)其進(jìn)行修飾而使其包含非遺傳編碼的組分(例如，可檢測(cè)的標(biāo)記，結(jié)合對(duì)成員，等等)來(lái)制備肽試劑，如本文所述，也如本領(lǐng)域所熟知的。
可以根據(jù)已知序列來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，并用做基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的探針。然后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)一步分離序列，并例如，使用限制性內(nèi)切酶在全長(zhǎng)序列的所需位置截?cái)嗷?。類似地，可以使用已知的技術(shù)(如苯提取)直接從含有感興趣序列的細(xì)胞和組織中分離這些序列，并進(jìn)一步對(duì)這些序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生所需的截?cái)嗟幕?。參見，例如，Sambrook等，上文所述，有關(guān)DNA獲取和分離技術(shù)的描述。
也可以合成編碼肽的序列，例如，基于已知的序列?？稍O(shè)計(jì)核苷酸序列使其具有編碼所需的特定氨基酸序列的合適的密碼子。通常用標(biāo)準(zhǔn)的方法制備寡核苷酸，并用重疊的寡核苷酸裝配出完整的編碼序列，以此獲得全長(zhǎng)序列。參見，例如，Edge(1981)Nature 292756；Nambair等(1984)Science 2231299；Jay等(1984)J.Biol.Chem.2596311；Stemmer等(1995)Gene 16449-53。
可以容易地用重組技術(shù)克隆編碼用于所述肽試劑的多肽的序列，然后替換合適的堿基對(duì)進(jìn)行體外誘變，以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于所需氨基酸的密碼。這樣的改變可以包括小至一個(gè)堿基對(duì)的改變，一個(gè)氨基酸的改變，或者可以涵蓋幾個(gè)堿基對(duì)的改變?；蛘?，可以使用與親代核苷酸序列(通常是對(duì)應(yīng)于RNA序列的cDNA)雜交的錯(cuò)配引物在溫度低于錯(cuò)配雙鏈的熔解溫度時(shí)來(lái)產(chǎn)生突變?？梢酝ㄟ^(guò)控制引物長(zhǎng)度和在較窄的限制條件下控制堿基組成以及將突變堿基控制在中央位置來(lái)制備特異性引物。參見，例如，Innis等，(1990)PCR應(yīng)用功能基因組學(xué)方案；Zoller和Smith，Methods Enzymol.(1983)100468。使用DNA聚合酶完成引物延伸，選擇克隆的產(chǎn)物和含有突變DNA的克隆(含有突變的克隆來(lái)源于對(duì)引物延伸鏈的分離)?？梢允褂猛蛔円镒鳛殡s交探針來(lái)進(jìn)行選擇。該技術(shù)也可用于產(chǎn)生多點(diǎn)突變。參見，例如，Dalbie-McFarland等Proc.Natl.Acad.SciUSA(1982)796409。
一旦分離和/或合成了編碼序列，可以將它們克隆到任何合適的載體或復(fù)制子中用于表達(dá)。(也可以參見，實(shí)施例)。從本文的指導(dǎo)中顯而易見的是，可以通過(guò)表達(dá)構(gòu)建物的制備來(lái)產(chǎn)生很多編碼修飾多肽的載體，這些表達(dá)構(gòu)建物以各種組合方式可操作性連接編碼(含有本文所述缺失或突變的)多肽的多核苷酸。
多種克隆載體是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，對(duì)于合適的克隆載體的選擇只是選擇的問(wèn)題。用于克隆的重組DNA載體及其它們可以轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括，噬菌體λ(大腸桿菌)，pBR322(大腸桿菌)，pACYC177(大腸桿菌)，pKT230(革蘭氏陰性細(xì)菌)，pGV1106(革蘭氏陰性細(xì)菌)，pLAFRl(革蘭氏陰性細(xì)菌)，pME290(非大腸桿菌革蘭氏陰性細(xì)菌)，pHV14(大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)，pBD9(桿菌)，pIJ61(鏈霉菌)，pUC6(鏈霉菌)，YIp5(酵母)，YCp19(酵母)和牛乳頭瘤病毒(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)?？傮w參見，DNA克隆卷I & II，上文中；Sambrook等，上文中；B.Perbal，上文中。
也可以使用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如桿狀病毒系統(tǒng)，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，描述于，例如，Summers和Smith，得克薩斯農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站報(bào)1555號(hào)(1987)。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以以試劑盒的形式從Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″試劑盒)等購(gòu)得。
也可以用植物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)本文所述的肽試劑。通常，這樣的系統(tǒng)使用基于病毒的載體用異源基因轉(zhuǎn)染植物。關(guān)于這些系統(tǒng)的描述，參見，例如，Porta等，Mol.Biotech.(1996)5209-221；和Hackland等，Arch.Virol.(1994)1391-22.
病毒系統(tǒng)，如基于牛痘病毒感染/轉(zhuǎn)染的系統(tǒng)，如Tomei等，J.Virol.(1993)674017-4026和Selby等，J.Gen.Virol.(1993)741103-1113所述，也可以運(yùn)用于本發(fā)明中。在該系統(tǒng)中，先在體外用編碼細(xì)菌噬菌體T7 RNA聚合酶的重組牛痘病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。該聚合酶表現(xiàn)出精確的特異性，其只轉(zhuǎn)錄帶有T7啟動(dòng)子的模板。感染以后，用感興趣的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該DNA由T7啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。由重組牛痘病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的聚合酶將轉(zhuǎn)染的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，然后RNA再由宿主的翻譯機(jī)器翻譯成蛋白質(zhì)。該方法提供了高水平、瞬時(shí)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生產(chǎn)大量RNA及其翻譯產(chǎn)物的方法。
可以將基因置于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)于細(xì)菌表達(dá))，和任選地操縱子的控制中，(這些在本文中統(tǒng)稱為“控制”元件)，這樣編碼所需多肽的DNA序列就能在用含有表達(dá)構(gòu)建物的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼系列可以含有不含信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。在本發(fā)明中，可以使用天然存在的信號(hào)肽或者也可以使用異源序列。前導(dǎo)序列可以在翻譯后加工中被宿主去除。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)4,431,739；4,425,437；4,338,397。這樣的序列包括，但不僅限于，TPA前導(dǎo)序列，以及蜜蜂六甲基苯(mellitin)信號(hào)序列。
也可能希望使用其它調(diào)控序列，這些序列用以相對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)而調(diào)控蛋白質(zhì)序列的表達(dá)。這些調(diào)控序列是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，實(shí)例包括那些對(duì)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在情況)產(chǎn)生應(yīng)答而使基因表達(dá)開放和關(guān)閉的調(diào)控序列。載體中也可以存在其它類型的調(diào)控元件，例如，增強(qiáng)序列。
可以在插入載體之前，將控制序列和其它調(diào)控序列連接到編碼序列上?；蛘?，可以直接將編碼序列克隆到已含有控制序列和合適的限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體中。
在某些情況下中，可能需要修飾編碼序列以使其能以合適的方向與控制序列相連接；也就是，保留正確的閱讀框。可以通過(guò)蛋白質(zhì)編碼序列的部分缺失，序列的插入，和/或通過(guò)序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代來(lái)制備突變體或類似物。用以修飾核苷酸序列的技術(shù)，如定點(diǎn)誘變，是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。參見，例如，Sambrook等，見上文；DNA克隆，卷I和II，見上文；核酸雜交，見上文。
然后，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏(ATCC)的永生細(xì)胞系，如，但不僅限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，小倉(cāng)鼠腎(baby hamster kidney)(BHK)細(xì)胞，猴腎細(xì)胞(COS)，人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)，Vero293細(xì)胞，以及其它細(xì)胞。類似地，細(xì)菌宿主如，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，和鏈球菌，也可以用在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建物中。適用于本發(fā)明的酵母宿主包括，釀酒酵母，白色假絲酵母(Candida albicans)，Candida maltosa，多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)，Kluyveromyces fragilis，Kluyveromyces lactis，Pichia guillerimondii，Pichiapastoris，Schizosaccharomyces pombe和Yarrowia lipolytica，等等。用于桿狀病毒表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞包括，埃及伊蚊(Aedes aegypti)，Autographa californica，家蠶(Bombyx mori)，黑腹果蠅，Spodoptera frugiperda，和Trichoplusia ni。
根據(jù)所選擇的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，在感興趣的蛋白質(zhì)能夠表達(dá)的條件下，通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了上文所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞而生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。對(duì)于合適生長(zhǎng)條件的選擇屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞將多肽產(chǎn)物分泌到周圍培養(yǎng)基中?？梢栽谳d體中包括某些調(diào)控序列以增強(qiáng)蛋白產(chǎn)物的分泌，例如，使用組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)前導(dǎo)序列，干擾素(γ或α)信號(hào)序列或其它來(lái)自已知分泌型蛋白的信號(hào)肽序列。然后，可以用本文所述的各種技術(shù)分離所分泌的多肽產(chǎn)物，例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)，如，但不僅限于，羥[基]磷灰石樹脂，柱層析，離子交換層析，排阻層析，電泳，HPLC，免疫吸附技術(shù)，親和層析，免疫沉淀，等等。
或者，可以使用化學(xué)、物理或機(jī)械方法破碎轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，這些方法能夠裂解細(xì)胞但仍舊使重組多肽基本上保持完整。也可以從細(xì)胞壁或細(xì)胞膜去除組分以獲得細(xì)胞內(nèi)蛋白，例如，通過(guò)使用去污劑或有機(jī)溶劑，這樣就造成多肽的泄漏。這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，描述于，例如，蛋白純化應(yīng)用實(shí)踐方法(E.L.V.Harris和S.Angal編，1990)。
例如，可以用于本發(fā)明的細(xì)胞破碎方法包括，但不僅限于聲波或超聲破碎；振蕩；液體或固體擠壓；熱處理；凍融；干燥；爆炸減壓；滲透沖擊；裂解酶包括蛋白酶，如胰蛋白酶，神經(jīng)酰胺酶和溶菌酶處理；堿處理；以及使用去污劑和溶劑如膽鹽，十二烷基磺酸鈉，Triton，NP40和CHAPS。用于細(xì)胞破碎的特定技術(shù)大部分是選擇的問(wèn)題，其依據(jù)的條件是表達(dá)多肽的細(xì)胞類型，培養(yǎng)條件和使用的任何預(yù)處理。
細(xì)胞破碎以后，去除細(xì)胞碎片，通常是用離心的方法，再對(duì)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的多肽進(jìn)一步純化，使用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)，如，但不僅限于，柱層析，離子交換層析，排阻層析，電泳，HPLC，免疫吸附技術(shù)，親和層析，免疫沉淀，等等。
例如，獲得本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)多肽的一種方法包括使用親和純化，如通過(guò)使用抗體(例如，先前產(chǎn)生的抗體)進(jìn)行的免疫親和層析，或用植物凝集素親和層析。特別優(yōu)選的植物凝集素樹脂是能識(shí)別甘露糖部分的樹脂，如，但不僅限于，Galarathus nivalis凝集素(GNA)，Lens culinaris凝集素(LCA或扁豆凝集素)，Pisumsativum凝集素(PSA或豌豆凝集素)，Narcissus pseudonarcissus凝集素(NPA)和Allium ursinum凝集素(AUA)衍生而來(lái)的樹脂。合適的親和樹脂的選擇屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。親和純化后，可以使用本領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)多肽進(jìn)一步純化，如使用上文所述的任何技術(shù)。
可以用化學(xué)方法方便地合成肽試劑，例如使用肽領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任何技術(shù)。通常，這些方法將生長(zhǎng)著的肽鏈連續(xù)添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸。通常，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基由合適的保護(hù)基團(tuán)加以保護(hù)。然后，可以將保護(hù)的或衍生的氨基酸連到惰性的固相支持物上，或在溶液中應(yīng)用，加入序列中的下一個(gè)氨基酸，其含有以合適方法保護(hù)的互補(bǔ)(氨基或羧基)基團(tuán)，反應(yīng)條件允許形成酰胺鍵。然后，從新添加的氨基酸殘基中去除保護(hù)基團(tuán)，再添加下一個(gè)(以合適方法保護(hù)的)氨基酸，等等。在所需的氨基酸已經(jīng)以恰當(dāng)?shù)捻樞蜻B接后，依次或同時(shí)去除任何殘留的保護(hù)基團(tuán)(和任何固相支持物，如果使用的是固相合成技術(shù))，這樣就得到了最終的多肽產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)這樣的常用步驟的簡(jiǎn)單改進(jìn)，可以同時(shí)對(duì)生長(zhǎng)著的肽鏈添加多個(gè)氨基酸，例如，通過(guò)將保護(hù)的三肽與以合適方法保護(hù)的二肽偶聯(lián)(所處的條件不會(huì)使手性中心外消旋化)，而在脫保護(hù)后形成五肽。有關(guān)固相肽合成技術(shù)參見，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL 1984)以及G.Barany和R.B.Merrifield，肽分析、合成、生物學(xué)，編者E.Gross和J.Meienhofer，卷2，(Academic Press，New York，1980)，3-254頁(yè)；和M.Bodansky，肽合成原則，(Springer-Verlag，Berlin 1984)和E.Gross和J.Meienhofer編，肽分析、合成、生物學(xué)，卷I，有關(guān)經(jīng)典的液相合成。這些方法通常用于相對(duì)較小的多肽，也就是，長(zhǎng)度達(dá)約50-100個(gè)氨基酸的多肽，但是也可以應(yīng)用于更大的多肽。
典型的保護(hù)基團(tuán)包括，叔丁基氧羰基(Boc)，9-芴甲氧羰基(Fmoc)芐氧羰基(Cbz)；對(duì)甲苯磺酰(Tx)；2，4-二硝基苯；芐基(Bzl)；二苯異丙氧羰基-羰基，叔戊基氧羰基，異冰片基氧羰基，鄰溴苯氧羰基，環(huán)己基，異丙基，乙?；徬趸交酋；鹊?。
典型的固相支持物是交聯(lián)的聚合支持物?？梢园ɑ诙蚁┍浇宦?lián)苯乙烯的聚合物，例如，二乙烯苯-羥甲基苯乙烯共聚物，二乙烯苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。
可以根據(jù)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,877,278；6,033,631；Simon等(1992)Proc.NatlAcad.Sci.USA 899367，來(lái)合成含擬肽的共聚物。
本發(fā)明的肽試劑也可以用其它方法進(jìn)行化學(xué)制備，如使用多肽同時(shí)合成方法。參見，例如，Houghten Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)825131-5135；美國(guó)專利號(hào)4,631,211。
IV.抗體此外，用于本發(fā)明的本文所述的肽試劑可用來(lái)生產(chǎn)抗體。在某些實(shí)施方式中，抗這些肽試劑而產(chǎn)生的抗體對(duì)致病性朊病毒具有特異性。在其它的實(shí)施方式中，這些抗體既與致病形式結(jié)合，又與非致病形式結(jié)合。在其它實(shí)施方式中，抗體對(duì)非致病異型具有特異性。任選地，本文所述抗體抑制非致病形式向致病構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。通常，將本文所述肽試劑(或編碼這樣的肽試劑的多核苷酸)施用給動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。這些方法也可以包括從動(dòng)物中分離抗體。
本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體制劑、單特異性抗血清、人抗體，或者可以是雜交或嵌合抗體，如人化抗體、變化的抗體(Fab′)2片段、F(ab)片段、Fv片段、單結(jié)構(gòu)域抗體、二聚體或三聚體抗體片段或構(gòu)建物、小型抗體(minibody)、或它們中與靶抗原結(jié)合的功能片段。
生產(chǎn)抗體所使用的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，這些技術(shù)揭示于，例如，美國(guó)專利號(hào)4,011,308；4,722,890；4,016,043；3,876,504；3,770,380；以及4,372,745。例如，用感興趣的抗原(例如，本文所述的肽試劑)來(lái)免疫合適的動(dòng)物，如小鼠、大鼠、兔、綿羊、或山羊，來(lái)產(chǎn)生多克隆抗體。為了增強(qiáng)免疫原性，可以在免疫之前將抗原連接到載體上。這樣的載體是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。通常在鹽水中混合或乳化抗原，優(yōu)選地在佐劑(如，弗氏完全佐劑)中進(jìn)行混合和乳化，并將混合物或乳化物經(jīng)胃腸道外途徑進(jìn)行注射(通常是皮下注射或肌肉內(nèi)注射)來(lái)進(jìn)行免疫。通常在2-6周以后，用鹽水中的抗原(優(yōu)選地使用弗氏不完全佐劑)對(duì)動(dòng)物再進(jìn)行一次或多次抗原注射以增強(qiáng)免疫。也可用本領(lǐng)域已知的方法，通過(guò)體外免疫的方法產(chǎn)生抗體。然后，從免疫動(dòng)物身上獲得多克隆抗血清。
通常使用Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497的方法，或其改良方法來(lái)制備單克隆抗體。通常，如上文所述免疫小鼠或大鼠。然而獲取血清的方法不是將動(dòng)物放血，而是摘除脾臟(和任選的幾個(gè)較大的淋巴結(jié))并將其分離成單細(xì)胞。如果需要，可以通過(guò)將細(xì)胞懸浮液加到抗原包被的板或孔上來(lái)篩選脾臟細(xì)胞(在去除非特異性結(jié)合的細(xì)胞以后)。表達(dá)抗原特異性膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞將會(huì)結(jié)合到板上，且不會(huì)與懸浮液的其它部分一起被淋洗掉。然后，誘導(dǎo)所得的B細(xì)胞或所有分離的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而產(chǎn)生雜交瘤，并培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基中(例如，次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶培養(yǎng)基，“HAT”)。用有限稀釋的方法將所得的雜交瘤鋪板，并檢測(cè)其產(chǎn)生的特異性結(jié)合免疫抗原(而不與不相關(guān)抗原結(jié)合)的抗體。然后，對(duì)選擇到的分泌單克隆抗體的雜交瘤進(jìn)行體外培養(yǎng)(例如，在組織培養(yǎng)瓶中或空心纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)培養(yǎng)(例如，作為小鼠的腹水)。
人化和嵌合抗體也可應(yīng)用于本發(fā)明。雜交(嵌合)抗體分子通常討論于Winter等(1991)Nature 349293-299和美國(guó)專利號(hào)4,816,567中。人化抗體分子通常討論于Riechmann等(1988)Nature 332323-327；Verhoeyan等(1988)Science 2391534-1536；和公開于1994年9月21日的英國(guó)專利公開號(hào)GB 2,276,169)。一種工程化產(chǎn)生人化抗體的方法包括克隆重組DNA以此產(chǎn)生小鼠-人抗體(一種人化抗體)，該重組DNA含有啟動(dòng)子、引導(dǎo)序列、和來(lái)自小鼠抗體基因的可變區(qū)序列、以及來(lái)自人抗體基因恒定區(qū)的外顯子，。通常參見，Kuby，《免疫學(xué)》，第三版(Immunology)，W.H.Freeman和Company，紐約(1998)136頁(yè)。
用于抗本文所述肽試劑的抗體(單克隆或多克隆抗體)在診斷和治療應(yīng)用中尤為有用，例如，那些中和抗體可用于被動(dòng)免疫治療。尤其是單克隆抗體可以用來(lái)生產(chǎn)抗獨(dú)特型抗體。
抗獨(dú)特型抗體是攜帶制劑中抗原的“內(nèi)部圖像”的免疫球蛋白，所需的保護(hù)即是針對(duì)該抗原制劑的。產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Grzych(1985)，Nature 31674；MacNamara等(1984)，Science 2261325，Uytdehaag等(1985)，J.Immunol.1341225。這些抗獨(dú)特型抗體也可用于構(gòu)象病(conformational disease)的治療和/或診斷。
抗體片段也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域已知很多包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，這些抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠表現(xiàn)出完整的抗體分子所具有的免疫結(jié)合特性。例如，可以通過(guò)對(duì)來(lái)自抗體分子的恒定區(qū)(不對(duì)抗原結(jié)合起作用的區(qū)域)的切割(使用，例如，胃蛋白酶)來(lái)生產(chǎn)F(ab′)2片段，從而生產(chǎn)功能性抗體片段。這些片段含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，但是缺乏來(lái)自各個(gè)重鏈的恒定區(qū)的一部分。類似地，如果需要，可以生產(chǎn)含有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段，例如，用木瓜蛋白酶消化多克隆或單克隆抗體。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，如重組體生產(chǎn)或?qū)γ庖咔虻鞍追肿拥膬?yōu)選蛋白水解，來(lái)生產(chǎn)僅含有重鏈和輕鏈可變區(qū)的功能性片段。這些片段稱為Fv。參見，例如，Inbar等(1972)Proc.Nat.Acad.Sci USA 692659-2662；Hochman等(1976)Biochem 152706-2710；和Ehrlich等(1980)Biochem 194091-4096.
單鏈Fv(″sFv″或scFv″)多肽是共價(jià)連接的VH-VL異源二聚體，其由包含VH-和VL-編碼基因的融合基因表達(dá)，VH-和VL-編碼基因之間由編碼肽的接頭連接。Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 855879-5883。已經(jīng)描述了多種方法來(lái)分辨和發(fā)展化學(xué)結(jié)構(gòu)(接頭)，該化合結(jié)構(gòu)用來(lái)將天然聚集但化學(xué)分離的來(lái)自抗體V區(qū)的重鏈和輕鏈多肽鏈轉(zhuǎn)化成sFv分子，該分子會(huì)折疊成與抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基本相似的三維結(jié)構(gòu)。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,091,513；5,132,405；和4,946,778?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已述的方法生產(chǎn)sFv分子。參見，例如，Huston等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci USA 855879-5338；美國(guó)專利號(hào)5,091,513；5,132,405和4,946,778。設(shè)計(jì)準(zhǔn)則包括確定跨過(guò)一條鏈的C末端和另一條鏈的N末端的合適長(zhǎng)度，其中接頭通常由不會(huì)卷曲或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的小的親水性氨基酸殘基構(gòu)成。這些方法在本領(lǐng)域中已有描述。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,091,513；5,132,405和4,946,778。合適的接頭通常含有由甘氨酸和絲氨酸殘基的交替排列組形成的多肽鏈，并可包括插入的谷氨酸和賴氨酸殘基以增強(qiáng)溶解性。
“小型抗體”(Mini-antibodiesminibodies″)也可以用于本發(fā)明中。小型抗體是在它們的C末端包含寡聚結(jié)構(gòu)域的sFv多肽鏈，該寡聚結(jié)構(gòu)域與sFv之間由鉸鏈區(qū)所分隔。Pack等，(1992)Biochem 311579-1584。寡聚結(jié)構(gòu)域含有自聚集(self-associating)的α螺旋，例如，亮氨酸拉鏈，其可以進(jìn)一步通過(guò)其它二硫鍵加以穩(wěn)定。將寡聚結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)為與跨膜的向量折疊相匹配，該過(guò)程被認(rèn)為有利于體內(nèi)多肽折疊成功能性結(jié)合蛋白。通常，使用本領(lǐng)域熟知的重組方法產(chǎn)生小型抗體。參見，例如，Pack等，(1992)Biochem 311579-1584；Cumber等(1992)J.Immunology 149B120-126。
也可以使用非常規(guī)的方法來(lái)生產(chǎn)及識(shí)別抗體。例如，可以篩選噬菌體展示庫(kù)以尋找與致病形式的結(jié)合強(qiáng)于與非致病形式結(jié)合(或相反情況)的抗體。通常參見，Siegel，″重組單克隆抗體技術(shù)″(″Recombinant Monoclonal AntibodyTechnology″)，Transfus.Clin.Biol.(2002)9(1)15-22；Sidhu，″藥學(xué)生物技術(shù)中的噬菌體展示″(″Phage Display in PharmaceuticalBiotechnology″)，Curr.Opin.Biotechnol.(2000)11(6)610-616；Sharon，等，″重組多克隆抗體庫(kù)″(″Recombinant Polyclonal Antibody Libraries″)，Comb.Chem。高通量篩選(High Throughput Screen)(2000)3(3)185-196；和Schmitz等，″噬菌體展示生產(chǎn)抗體的分子工具-綜述″(″Phage DisplayA Molecular Tool for theGeneration of Antibodies-Review″)，Placenta，(2000)21 SupplAS 106-12。
如上所述，也可以將編碼如本文所述的肽試劑的多核苷酸序列施用給動(dòng)物，以此來(lái)產(chǎn)生抗體。當(dāng)肽在體內(nèi)表達(dá)時(shí)，抗體即在體內(nèi)產(chǎn)生。多核苷酸遞送的方法如下文所述。
可以如上文所述來(lái)檢測(cè)本發(fā)明抗體的特異性，以用于肽試劑。如上所述，具有致病構(gòu)象的朊病毒通常對(duì)某些蛋白酶具有抗性，如蛋白酶K。相同的蛋白酶可以降解非致病構(gòu)象的朊病毒。一種測(cè)試本發(fā)明的抗體特異性的方法是，選擇同時(shí)含有致病性和非致病性朊病毒的生物樣品?？梢詫悠贩譃閮煞菹嗤捏w積?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體吸附到固相支持物上(如下文所做的進(jìn)一步描述)并用來(lái)獲得與固相支持物上的抗體-朊病毒結(jié)合相互作用數(shù)量直接相關(guān)的數(shù)量值?？梢詫⒌鞍酌讣尤氲诙輼悠分?，并進(jìn)行相同的試驗(yàn)。由于第二份樣品中的蛋白酶會(huì)降解任何非致病性的朊病毒，所以第二份樣品中的任何抗體-朊病毒結(jié)合相互作用都可以歸因于致病性的朊病毒。以及本領(lǐng)域已知的其它試驗(yàn)和變化形式也可用來(lái)證實(shí)本發(fā)明抗體的特異性。
V.試驗(yàn)本發(fā)明的肽試劑可以用在多種試驗(yàn)中來(lái)篩選樣品(例如，生物樣品，如血液、腦、脊髓、CSF或器官樣品)，例如，用來(lái)檢測(cè)這些樣品中致病形式的構(gòu)象病蛋白的存在與否。與很多目前已有的朊病毒診斷試劑不同，本文所述的肽試劑可以在幾乎任何類型的生物或非生物樣品中進(jìn)行診斷，包括血液樣品、血制品或活組織檢查樣品。
因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與本發(fā)明的一種肽試劑相接觸，所處的條件允許該肽試劑與致病性朊病毒蛋白相結(jié)合(如果有致病性朊病毒存在的話)；并通過(guò)其與肽試劑的結(jié)合情況檢測(cè)致病性朊病毒的存在情況(如果有致病性朊病毒存在)。
為了用于本發(fā)明的方法中，樣品可以是任何已知或懷疑含有致病性朊病毒蛋白的樣品。樣品可以是生物樣品(也就是從活體或曾經(jīng)存活的生物體中制備的樣品)或非生物樣品。合適的生物樣品包括，但不僅限于，器官、全血、血液部分(blood fraction)、血液組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肌肉組織、骨髓、尿、淚液、非神經(jīng)系統(tǒng)組織、器官、和/或活組織檢查或尸體剖檢。優(yōu)選的生物樣品包括全血、血液部分、血液組分、血漿、血小板、和血清。
樣品與本發(fā)明的一種或多種肽試劑相接觸，所處的條件允許肽試劑與致病性朊病毒蛋白相結(jié)合(如果其存在的話)。根據(jù)本文的公開，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全有能力確定具體的條件。通常，將樣品和肽試劑一起孵育在合適的緩沖液中，該緩沖液的pH基本呈中性(例如，TBS緩沖液，pH7.5)、合適的溫度條件下(例如，約4℃)、孵育合適的時(shí)間(例如，約1小時(shí)至過(guò)夜)，以使它們發(fā)生結(jié)合。
可以通過(guò)致病性朊病毒蛋白與肽試劑的結(jié)合來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒蛋白的存在情況。可以用多種方法使得致病性朊病毒蛋白與本發(fā)明的肽試劑結(jié)合從而檢測(cè)致病性朊病毒的存在情況。例如，可以通過(guò)本發(fā)明的肽試劑和致病性朊病毒蛋白之間形成的第一復(fù)合物而使用肽試劑特異性地“捕獲”致病性朊病毒蛋白，該第一復(fù)合物可以從未結(jié)合的樣品材料(包括任何存在于樣品中的非致病性朊病毒蛋白)中分離。然后，可以加入本發(fā)明的一種或多種肽試劑及與其結(jié)合來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒蛋白，其中肽試劑已經(jīng)添加了可檢測(cè)標(biāo)記(也就是，標(biāo)記的肽試劑)。在致病性朊病毒蛋白存在于第一復(fù)合物中時(shí)可以檢測(cè)致病性朊病毒蛋白，或者可以在添加本發(fā)明的標(biāo)記肽試劑及其結(jié)合之前將致病性朊病毒蛋白從第一復(fù)合物中解離出來(lái)。
或者，在用如上所述方法使用本發(fā)明的肽試劑捕獲致病性朊病毒蛋白，并將第一復(fù)合物從未結(jié)合的樣品材料中分離出以后，可以在致病性朊病毒蛋白仍存在于第一復(fù)合物之中時(shí)或是在致病性朊病毒蛋白從第一復(fù)合物解離出來(lái)之后，使用攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的朊病毒結(jié)合試劑來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒蛋白。“朊病毒結(jié)合試劑”是與任何構(gòu)象的朊病毒蛋白結(jié)合的試劑，通常朊病毒結(jié)合試劑會(huì)與朊病毒蛋白的變性形式相結(jié)合。這樣的試劑已經(jīng)有所描述，包括，例如，抗朊病毒抗體(尤其是描述于，Peretz等1997 J.Mol.Biol.273614；Peretz等2001Nature 412739；Williamson等1998 J.Virol.729413；美國(guó)專利號(hào)6,765,088；美國(guó)專利號(hào)6,537548，等等)、基序嫁接(motif-grafted)雜交多肽(參見，WO03/085086)、某些陽(yáng)離子或陰離子聚合物(參見，WO03/073106)、某些作為″增殖催化劑″(propagation catalyst)肽(參見，WO02/0974444)和纖維蛋白溶酶原。顯而易見的是，如果所使用的特定朊病毒結(jié)合試劑與朊病毒的變性形式相結(jié)合，那么在用朊病毒結(jié)合試劑檢測(cè)之前應(yīng)當(dāng)先使“捕獲的”致病性朊病毒蛋白變性。
或者，可以使用朊病毒結(jié)合試劑來(lái)捕獲存在于樣品中的任何朊病毒(致病性和非致病性的)，以形成第一復(fù)合物，并且可以使用一種或多種本發(fā)明的攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的肽試劑在第一復(fù)合物中或在致病性朊病毒從第一復(fù)合物上解離以后檢測(cè)致病性朊病毒。
或者，還可以直接將樣品捕獲到固相支持物上(也就是，不用任何朊病毒結(jié)合試劑)，且如果致病性朊病毒蛋白存在的話，可以使用一種或多種本發(fā)明的攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的肽試劑檢測(cè)出致病性朊病毒蛋白。
以上所述的捕獲和檢測(cè)步驟可以在溶液中、或在固相支持物中或上或用溶液和固相的某種組合中進(jìn)行。一些合適的溶液相形式包括，例如，熒光相關(guān)光譜(參見，Giese等Arch.Virol.Suppl.2000 16161；Bieschke等Proc.Natl Acad.Sci.USA 2000 9755468)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移。通常，在這些溶液相形式中本發(fā)明的肽試劑會(huì)被添加上可檢測(cè)標(biāo)記。優(yōu)選地，肽試劑可被標(biāo)記上兩種或多種可區(qū)分的可檢測(cè)標(biāo)記。通過(guò)在第一復(fù)合物中兩種或多種可檢測(cè)標(biāo)記的重合來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒蛋白的存在情況。本文中描述了合適的固相試驗(yàn)形式。通常，對(duì)于固相形式，將捕獲試劑(可以是本發(fā)明的一種或多種肽試劑，或一種或多種朊病毒結(jié)合試劑)連接到或使其適于連接到固相支持物上?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來(lái)使捕獲試劑適于連接到固相支持物上，例如，捕獲試劑和固相支持物可以分別含有結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員，這樣當(dāng)捕獲試劑與固相支持物接觸時(shí)，捕獲試劑就通過(guò)結(jié)合對(duì)成員之間的結(jié)合而連接到固相支持物上。例如，捕獲試劑可以含有生物素，而支持物可以含有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白。除了生物素-抗生物素蛋白和生物素-鏈霉抗生物素蛋白，其它適用于此實(shí)施方式的結(jié)合對(duì)包括，例如，抗原-抗體、半抗原-抗體、擬肽-抗體、受體-激素、受體-配體、激動(dòng)劑-拮抗劑、植物凝集素-碳水化合物、蛋白A-抗體Fc。這樣的結(jié)合對(duì)是熟知的(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)6,551,843和6,586,193)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有能力選擇合適的結(jié)合對(duì)并使其適用于本發(fā)明。當(dāng)捕獲試劑適于連接到如上所述的支持物時(shí)，可以在捕獲試劑連接到支持物之前或之后將樣品與捕獲試劑相互接觸。
因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中是否存在致病性朊病毒的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑相接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)，以形成第一復(fù)合物；和(b)通過(guò)致病性朊病毒與第一肽試劑的結(jié)合(如果樣品中含有致病性朊病毒)來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
肽試劑如本文所述，優(yōu)選地，肽試劑衍生自具有SEQ ID NO12-132序列的肽，更優(yōu)選地，衍生自具有以下一種SEQ ID NO序列的肽SEQ ID NO66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127，129，130，131，132；或衍生自具有以下序列的肽，SEQ ID NO14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118或128；或衍生自具有以下序列的肽，SEQ ID NO56，57，65，82，或84?？梢詫?duì)肽試劑進(jìn)行生物素化?？梢詫㈦脑噭┻B接到固相支持物上。在某些實(shí)施方式中，可以給肽試劑添加可檢測(cè)標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑相接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上(如果樣品中存在致病性朊病毒)，以形成第一復(fù)合物；(b)將所述的第一復(fù)合物與第二肽試劑相接觸，所處的條件允許第二肽試劑結(jié)合到所述第一復(fù)合物中的致病性朊病毒上，其中所述的第二肽試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記；和(c)通過(guò)致病性朊病毒與第二肽試劑的結(jié)合(如果存在致病性朊病毒)來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒的存在情況。
當(dāng)檢測(cè)方法中利用第一肽試劑和第二肽試劑時(shí)，第一和第二肽試劑可以是相同的或是不同的?！跋嗤摹笔侵傅谝缓偷诙脑噭┑膮^(qū)別僅是第二肽試劑中含有可檢測(cè)的標(biāo)記。
第一肽試劑和第二肽試劑可以從朊病毒蛋白的相同區(qū)域的肽片段衍生而來(lái)，或從朊病毒蛋白的不同區(qū)域的肽片段衍生而來(lái)。第一和第二肽試劑可以分別選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ ID NO12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、或132。
第一和第二肽試劑可以分別選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ ID NO66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、127、14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、132、56、57、65、82、和84。
第一肽試劑可以選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ IDNO66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、或127，而第二肽試劑可以選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQID NO14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、或132，或者反之。第一肽試劑可以選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ ID NO66、67、68、72、81、96、97、98、107、108、119、120、121、122、123、124、125、126、或127，而第二肽試劑可以選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ ID NO56、57、65、82、和84，或者反之。第一肽試劑可以選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ ID NO14、35、36、37、40、50、51、77、89、100、101、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、128、129、130、131、或132，而第二肽試劑可以選自具有以下序列的肽衍生而來(lái)的肽試劑，SEQ ID NO56、57、65、82、和84，或者反之。
第一肽試劑可以生物素化，可以連接到固相支持物上。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)，以形成第一復(fù)合物；(b)去除未結(jié)合的樣品材料；(c)將所述致病性朊病毒從所述第一復(fù)合物上解離下來(lái)；(d)將所述解離的致病性朊病毒與第二肽試劑接觸，所處的條件允許第二肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上，其中所述的第二肽試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記；以及(e)通過(guò)致病性朊病毒與第二肽試劑的結(jié)合(如果有致病性朊病毒存在)來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。第一和第二肽試劑可以相同或不同。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)，以形成第一復(fù)合物；(b)去除未結(jié)合的樣品材料；(c)將所述致病性朊病毒從所述第一復(fù)合物上解離下來(lái)；(d)將所述解離的致病性朊病毒與朊病毒結(jié)合試劑接觸，所處的條件允許朊病毒結(jié)合試劑結(jié)合到致病性朊病毒上，其中所述的朊病毒結(jié)合試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記；以及(e)通過(guò)致病性朊病毒與朊病毒結(jié)合試劑的結(jié)合(如果有致病性朊病毒存在)來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。朊病毒結(jié)合試劑可以是抗朊病毒抗體、基序嫁接雜交多肽、陽(yáng)離子或陰離子聚合物、增殖催化劑和纖維蛋白溶酶原，或其它任何已知與朊病毒蛋白結(jié)合的部分。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與朊病毒結(jié)合試劑接觸，所處的條件允許朊病毒結(jié)合試劑結(jié)合到致病性朊病毒上(如果有致病性朊病毒存在)，以形成第一復(fù)合物；(b)去除未結(jié)合的樣品材料；(c)將所述第一復(fù)合物與肽試劑接觸，所處的條件允許肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上，其中所述肽試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記；(d)通過(guò)致病性朊病毒與肽試劑的結(jié)合(如果有致病性朊病毒存在)來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)提供含有第一肽試劑的固相支持物；(b)將樣品與固相支持物接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(在存在于樣品中時(shí))，結(jié)合到第一肽試劑上；(c)將固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的第二肽試劑接觸，所處的條件允許第二肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上，該致病性朊病毒結(jié)合在第一肽試劑上；以及，(d)檢測(cè)由第一肽試劑、來(lái)自樣品的致病性朊病毒和第二肽試劑形成的復(fù)合物，以此檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
或者，可以提供在固相支持物上的朊病毒結(jié)合試劑。本發(fā)明因此提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)提供含有朊病毒結(jié)合試劑的固相支持物；
(b)將樣品與固相支持物接觸，所處的條件允許致病性朊病毒(在存在于樣品中時(shí))，結(jié)合到朊病毒結(jié)合試劑上；(c)將固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的第二肽試劑接觸；以及，(d)檢測(cè)由朊病毒結(jié)合試劑、來(lái)自樣品的致病性朊病毒和第二肽試劑形成的復(fù)合物。
試驗(yàn)可以比較的形式進(jìn)行；因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)提供了含有第一肽試劑的固相支持物；(b)將固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的第一配體混合，其中第一肽試劑與帶有可檢測(cè)標(biāo)記的第一配體的結(jié)合親和力弱于第一肽試劑與致病性朊病毒的結(jié)合親和力；(c)將樣品與固相支持物相混合，所處的條件允許在樣品中存在致病性朊病毒的情況下，致病性朊病毒與第一肽試劑結(jié)合并取代第一配體；(d)檢測(cè)由第一肽試劑和來(lái)自樣品的致病性朊病毒之間形成的復(fù)合物。
通常，如本文所述的肽試劑用于結(jié)合樣品中的朊病毒蛋白(例如，用做捕獲試劑)和/或檢測(cè)朊病毒蛋白的存在情況(例如，用做檢測(cè)試劑)。捕獲試劑和檢測(cè)試劑可以是不同的分子，或者一種分子可以兼具捕獲和檢測(cè)的功能。在某些實(shí)施方式中，捕獲和/或檢測(cè)試劑是本文所述的肽試劑，其優(yōu)先與致病性朊病毒發(fā)生相互作用(也就是，致病性朊病毒特異性)。在其它實(shí)施方式中，捕獲試劑對(duì)于致病性朊病毒具有特異性，而檢測(cè)試劑則既與致病形式結(jié)合又與非致病形式結(jié)合，例如結(jié)合朊病毒蛋白的抗體。這樣的朊病毒結(jié)合試劑在本文中已有描述?；蛘?，在其它實(shí)施方式中，捕獲試劑對(duì)致病性朊病毒不具備特異性，而檢測(cè)試劑則對(duì)致病性朊病毒具特異性。
然后，可以使用任何合適的檢測(cè)方法來(lái)識(shí)別如本文所述的肽試劑和朊病毒蛋白之間的結(jié)合。例如，如本文所述的試驗(yàn)可以包括經(jīng)標(biāo)記的肽試劑或抗體的使用。適用于本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記包括任何能夠檢測(cè)的分子，包括，但不僅限于，放射性同位素、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、發(fā)色團(tuán)、熒光半導(dǎo)體納米晶體、酶、酶的底物、酶的輔助因子、酶的抑制劑、發(fā)色團(tuán)，染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(例如，生物素、鏈霉抗生物素蛋白或半抗原)等等。其它的標(biāo)記包括，但不僅限于，那些使用熒光的標(biāo)記，包括那些能夠在可檢測(cè)的范圍內(nèi)顯現(xiàn)出熒光的物質(zhì)或其部分?？梢杂糜诒景l(fā)明的標(biāo)記的具體實(shí)例包括，但不僅限于，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、熒光素、FITC、羅丹明、二甲氨基萘磺酰、傘形花內(nèi)酯、二甲基吖啶酯(DMAE)、得克薩斯紅(Texas red)、魯米諾、NADPH和β-半乳糖苷酶。此外，可檢測(cè)標(biāo)記可以包括寡核苷酸標(biāo)記物(tag)，這樣的標(biāo)記物可以用本領(lǐng)域已知的任何核酸檢測(cè)方法加以檢測(cè)，包括PCR、TMA、b-DNA、NASBA，等等。
除了使用標(biāo)記的檢測(cè)試劑(如上文所述)以外，可以使用免疫沉淀來(lái)分離出結(jié)合到朊病毒蛋白(例如，致病性朊病毒)上的肽試劑。優(yōu)選地，可以添加沉淀促進(jìn)劑以利于免疫沉淀。沉淀促進(jìn)劑包括，能夠促進(jìn)或增加結(jié)合到致病性朊病毒上的肽試劑沉淀的部分，包括聚乙二醇(PEG)、G蛋白、A蛋白，等等。在使用G蛋白或A蛋白作為沉淀促進(jìn)劑時(shí)，可以任選地將蛋白質(zhì)連接到珠上，優(yōu)選地為磁珠?？梢酝ㄟ^(guò)使用離心或使用磁力而進(jìn)一步促進(jìn)沉淀。這些沉淀促進(jìn)劑的使用是本領(lǐng)域已知的。
對(duì)來(lái)自檢測(cè)試劑的信號(hào)放大試驗(yàn)也是已知的。這樣的實(shí)例包括利用生物素或抗生物素蛋白的試驗(yàn)，以及酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫測(cè)定，如ELISA試驗(yàn)。
可以在溶液(例如，液體培養(yǎng)基)中或在固相支持物上實(shí)施本文所述的試驗(yàn)的一個(gè)或多個(gè)步驟。用于本發(fā)明目的的固相支持物可以是任何不溶性基質(zhì)材料，可以具有剛性的或半剛性的表面，感興趣的分子(例如，本發(fā)明的肽試劑、朊病毒蛋白、抗體，等等)可以連接或附著在該表面上。典型的固相支持物包括，但不僅限于，諸如硝化纖維素、聚氯乙烯這樣的基材；聚丙烯、聚苯乙烯、乳膠、聚碳酸酯、尼龍、葡聚糖、幾丁質(zhì)、砂、硅石、浮石、瓊脂糖、纖維素、玻璃、金屬、聚丙烯酰胺、硅、橡膠、多糖，聚氟乙烯；重氮化紙；活化珠；磁感應(yīng)珠，和任何常用于固相合成、親和分離、純化、雜交反應(yīng)、免疫試驗(yàn)和其它此類應(yīng)用的材料。支持物可以是顆粒狀的，或者可以是連續(xù)的平面形式，包括，膜、網(wǎng)格、板、丸、片、盤、毛細(xì)管、空心毛細(xì)管、針、釘、小片、固體纖維、凝膠(例如硅膠)和珠，(例如，帶孔玻璃珠、硅膠、任選與二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯珠、，移植的共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳膠珠、任選與N-N′-雙-丙烯酰乙二胺交聯(lián)的二甲基丙烯酰胺珠、、氧化鐵磁珠、和包被了疏水性聚合物的玻璃顆粒)。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將如本文所述的肽試劑方便地結(jié)合到固相支持物上?？梢韵葘㈦脑噭┙Y(jié)合到蛋白質(zhì)上(例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有更好的固相結(jié)合特性時(shí))來(lái)增強(qiáng)對(duì)支持物的固定化。合適的結(jié)合蛋白包括，但不僅限于，大分子，如血清白蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、鎖眼形血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、及其它本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的蛋白質(zhì)?？捎糜趯⒎肿咏Y(jié)合到支持物上的其它試劑，包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物，等等。這些分子以及將這些分子結(jié)合到蛋白質(zhì)上的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。參見，例如，Brinkley，M.A.，(1992)Bioconjugate Chem.，32-13；Hashida等(1984)J.Appl.Biochem.，656-63；以及Anjaneyulu和Staros(1987)Intemational J.of Peptide and Protein Res.30117-124。
如果需要，可以很方便地對(duì)要添加到固相支持物上的分子進(jìn)行功能化以產(chǎn)生苯乙烯或丙烯酸酯部分，這樣就能將分子整合到聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或其它聚合物中去，如聚酰亞胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚乙烯基、聚丁二炔，聚亞苯基-乙烯、多肽、多糖、多吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、環(huán)氧樹脂、硅玻璃、硅膠、硅氧烷、多聚磷酸、水凝膠、瓊脂糖、纖維素，等等。
可以通過(guò)結(jié)合對(duì)分子的相互作用將肽試劑粘附到固相支持物上。這樣的結(jié)合在本領(lǐng)域中是已知的，并在本文的其它地方已有描述。結(jié)合對(duì)中的一個(gè)成員用上文所述技術(shù)結(jié)合到固相支持物上，而結(jié)合對(duì)的另一成員則連接到肽試劑上(于合成之前，中間或以后)?？梢詫⑦@樣修飾的肽試劑與樣品接觸，并與致病性朊病毒的相互作用就會(huì)在溶液中發(fā)生(如果存在致病性朊病毒的話)，，此后可以將固相支持物與肽試劑(或肽-朊病毒復(fù)合物)接觸。用于此實(shí)施方式的優(yōu)選結(jié)合對(duì)包括生物素和抗生物素蛋白、以及生物素和鏈霉抗生物素蛋白。
也可以在本發(fā)明的試驗(yàn)中使用合適的對(duì)照。例如，可以在試驗(yàn)中使用PrPC的陰性對(duì)照。也可以在試驗(yàn)中使用PrPSc(或PrPres)的陽(yáng)性對(duì)照。這樣的對(duì)照可任選地含有可檢測(cè)的標(biāo)記。
使用本發(fā)明的肽試劑的多種變化形式和組合也可以應(yīng)用到本發(fā)明的試驗(yàn)中。以下非限制性實(shí)例的描述用于說(shuō)明。
在某些實(shí)施方式中，描述了檢測(cè)生物樣品中致病性朊病毒的試驗(yàn)。在這樣的方法中，本發(fā)明的肽試劑可以用做生物或非生物樣品中的致病性朊病毒捕獲試劑。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，先將固相支持物(例如，磁珠)與本文所述肽試劑發(fā)生反應(yīng)，該肽試劑優(yōu)先與致病性朊病毒相互作用，這樣肽試劑就被充分地固定到支持物上。然后，將固相支持物與懷疑含有致病性朊病毒的樣品相接觸，所處的條件優(yōu)選可使肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒上。去除未結(jié)合的樣品材料后，結(jié)合的致病性朊病毒可以從肽試劑上解離下來(lái)，并使用任何已知的檢測(cè)機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)，包括，但不僅限于，Western印跡法和ELISA，例如，如下文實(shí)施例和本文引用的參考資料中所述?；蛘撸梢栽谥虏⌒噪貌《静粡碾脑噭┥辖怆x的情況下檢測(cè)結(jié)合的致病性朊病毒。
或者，可以在結(jié)合到固相支持物之前，將本發(fā)明的肽試劑與懷疑含有致病性朊病毒的樣品相接觸，然后將肽試劑結(jié)合到固相支持物上(例如，可以對(duì)肽試劑生物素化，而固相支持物則含有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)。去除未結(jié)合的樣品材料以后，致病性朊病毒可以從肽試劑上解離下來(lái)，并使用任何已知的檢測(cè)機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)，包括，但不僅限于，Western印跡法和ELISA，例如，如下文實(shí)施例和本文引用的參考資料中所述?；蛘撸跈z測(cè)之前致病性朊病毒可以不需要從肽試劑上解離下來(lái)。
可以使用如本文所述的優(yōu)先與致病形式相互作用的肽試劑來(lái)檢測(cè)樣品中的致病性朊病毒。或者，可以用非特異性的檢測(cè)試劑(例如，與所有PrP結(jié)合的肽或抗體)來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒。在某些實(shí)施方式中，在將捕獲的致病性朊病毒從固相支持物上解離以后，在檢測(cè)前先使捕獲的致病性朊病毒變性，這樣就能使用非特異性的檢測(cè)試劑以便于檢測(cè)?；蛘?，如果，例如，修飾肽試劑以使其含有可激活的反應(yīng)基團(tuán)(例如，光反應(yīng)基團(tuán))，該反應(yīng)基團(tuán)可用于在肽試劑和致病性朊病毒之間建立共價(jià)連接，則可以在捕獲的致病性朊病毒未從肽試劑上解離的情況下就使其變性。
可以使用如Ryou等(2003)Lab Invest.83(6)837-43中所述的ELISA等方案來(lái)對(duì)從固相支持物上洗脫下來(lái)的致病性朊病毒進(jìn)行計(jì)量。(參見，實(shí)施例)。簡(jiǎn)言之，用從固相支持物上解離(洗脫)下來(lái)的致病性朊病毒覆蓋微量滴定板的孔?？梢韵礈彀逡匀コ唇Y(jié)合的部分，并加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的結(jié)合分子，如抗朊病毒抗體或本發(fā)明的肽試劑(可以與用于捕獲的試劑相同或不同)。允許該結(jié)合分子與任何捕獲的樣品朊病毒結(jié)合，洗滌滴定板，并用本領(lǐng)域所熟知的方法檢測(cè)標(biāo)記抗體和/或標(biāo)記肽試劑的存在情況。結(jié)合分子不需要對(duì)致病性朊病毒形式具有特異性，而是與兩種異構(gòu)體或變性的PrP都可以結(jié)合，只要捕獲試劑對(duì)致病性朊病毒形式具有特異性即可。
在另一些典型試驗(yàn)中，捕獲試劑和朊病毒在檢測(cè)前并不解離。例如，將固相支持物(例如，微量滴定板的孔)與第一致病性朊病毒特異性的分子(肽試劑)相連接。然后，將含有或懷疑含有致病性朊病毒的生物樣品加入固相支持物。孵育一段時(shí)間后，該時(shí)間足以使任何致病性朊病毒結(jié)合到第一種分子上，可以洗滌固相支持物以去除未結(jié)合的部分，然后加入攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的如上所述的第二結(jié)合分子，如第二種抗-PrP抗體或朊病毒特異性的肽試劑。或者，可以將與致病形式和非致病形式結(jié)合的分子(例如，非特異性的捕獲試劑)結(jié)合到固相支持物上(例如，包被到微量滴定板的孔上)，然后使用致病性朊病毒特異性的檢測(cè)試劑(例如，本文所述肽試劑)進(jìn)行檢測(cè)。
另一個(gè)示例性的試驗(yàn)是“二肽三明治”試驗(yàn)，其可以用來(lái)檢測(cè)朊病毒(例如，致病性朊病毒)。在該技術(shù)中，固相支持物與本文所述的本發(fā)明的一種或多種第一肽試劑發(fā)生反應(yīng)，洗滌以去除未反應(yīng)的第一肽試劑，然后將其暴露在懷疑含有致病性朊病毒蛋白的待測(cè)樣品中(例如，生物樣品)，所處的條件允許第一肽試劑與任何存在于樣品中的致病性朊病毒蛋白之間發(fā)生相互作用。去除未反應(yīng)的樣品組分，并加入一種或多種本發(fā)明的第二肽試劑，所處的條件允許第二肽試劑與任何存在的致病性朊病毒蛋白之間發(fā)生相互作用?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)第一肽試劑-朊病毒蛋白-第二肽試劑之間發(fā)生的相互作用。通常，第二肽試劑含有可檢測(cè)的標(biāo)記。用于該試驗(yàn)，第一肽試劑和/或第二肽試劑優(yōu)先與致病性朊病毒蛋白發(fā)生相互作用。
在某些實(shí)施方式中，使用抗-PrP抗體來(lái)檢測(cè)朊病毒蛋白。與朊病毒結(jié)合，尤其是與PrPC或與變性的PrP結(jié)合的抗體、經(jīng)修飾的抗體和其它試劑已在本文中做了描述，其中的一些是可以購(gòu)買到的。(參見，例如，Peretz等1997 J.Mol.Biol.273614；Peretz等2001 Nature 412739；Williamson等1998 J.Virol.729413；美國(guó)專利號(hào)6,765,088中所描述的抗朊病毒抗體)。其中的一些及其它一些可以購(gòu)自，特別是，InPro Biotechnology，南圣弗蘭西斯科，CA，Cayman Chemicals，Ann Arbor MI；Prionics AG，Zurich等；也可以參見，WO03/085086中有關(guān)經(jīng)修飾的抗體的描述)。
本發(fā)明的肽試劑也可以用在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中。當(dāng)與PrPSc弱結(jié)合的配體由本文所述的PrPSc特異性肽試劑取代時(shí)，可以使用檢測(cè)方法加以識(shí)別。例如，可以將懷疑含有PrPSc的樣品吸附到固相支持物上。此后，使固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的與PrPSc結(jié)合的配體相混合(例如，纖維蛋白溶酶原、層粘連蛋白受體和硫酸乙酰肝素)，所處的條件允許攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的配體與PrPSc相結(jié)合。檢測(cè)配體-PrPSc復(fù)合物。然后，加入如本文所述的PrPSc結(jié)合肽試劑。攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的配體對(duì)致病性朊病毒的結(jié)合親和力弱于肽試劑對(duì)致病性朊病毒的結(jié)合親和力。這樣，PrPSc-結(jié)合肽試劑就會(huì)取代攜帶標(biāo)記的配體，標(biāo)記配體數(shù)量的降低指示了肽試劑和來(lái)自生物樣品的朊病毒致病形式之間復(fù)合物的形成。
上述試驗(yàn)試劑，包括本文所述的肽試劑，可以在附帶合適的指導(dǎo)及其它所需試劑的試劑盒中提供，從而用以實(shí)施如上所述的檢測(cè)試驗(yàn)。在肽試劑吸附到固相支持物上時(shí)，該試劑盒還可以額外含有或任選含有吸附到一種或多種固相支持物上的肽試劑。該試劑盒可進(jìn)一步含有合適的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照(如上文所述)。根據(jù)所使用的具體檢測(cè)試驗(yàn)，試劑盒也可以含有合適的標(biāo)記和其它包裝的試劑和材料(也就是，洗滌緩沖液等等)。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有致病性朊病毒特異性肽試劑的固相支持物。也提供了生產(chǎn)這些固相支持物的方法，例如，通過(guò)(a)提供固相支持物；和(b)在其上結(jié)合一種或多種致病性朊病毒特異性的肽試劑。
也可以使用親和性支持物利用朊病毒特異性的肽試劑來(lái)分離致病性朊病毒蛋白?？梢詫㈦脑噭┎捎?，例如，吸附、共價(jià)連接等等方法，粘附到固相支持物上，從而使得肽試劑保留其朊病毒選擇性結(jié)合活性。任選地，可以包括間隔基團(tuán)，例如以使肽試劑的結(jié)合位點(diǎn)仍舊保留其可接近性。然后，可以使用固定化的分子結(jié)合來(lái)自生物樣品的致病性朊病毒蛋白，這樣的生物樣品如，血液、血漿、腦、脊髓、其它組織。可以用例如，pH的改變，從支持物上回收結(jié)合的肽試劑或復(fù)合物，或者可以將致病性朊病毒從復(fù)合物上解離下來(lái)。
可以根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)的樣品包括任何可以使用抗體試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)的樣品，包括來(lái)自神經(jīng)系統(tǒng)組織(例如，腦、脊髓、CSF，等等)的樣品、血液和/或來(lái)自活體或死亡對(duì)象的其它組織樣品。如上所述，在優(yōu)選實(shí)施方式中，樣品是血液、血制品或來(lái)自活體對(duì)象的組織樣品。
VI.其它應(yīng)用A.檢測(cè)如上所述，本文所述的肽試劑也可用于診斷對(duì)象中的朊病毒疾病。此外，上文所述的肽試劑也可用于檢測(cè)血液和/或食物供給中的致病性朊病毒污染。因此，可用制備基本上不含有致病性朊病毒的供血，其方法是使用任何本文所述的檢測(cè)試驗(yàn)篩選采集自個(gè)體的樣品或集中在一起的樣品庫(kù)。棄去受到致病性朊病毒污染的樣品或樣品庫(kù)，再合并其余樣品。這樣，就可以提供基本上不含有致病性朊病毒污染的供血?！盎旧喜缓兄虏⌒噪貌《尽笔侵甘褂萌魏伪疚乃龅脑囼?yàn)都不能檢測(cè)到致病性朊病毒的存在。重要的是，已經(jīng)證實(shí)本文所述的肽試劑能在用正常組織稀釋了106倍的腦組織中檢測(cè)到致病性蛋白形式，且本文所述的肽試劑是唯一已經(jīng)證實(shí)能在血液中檢測(cè)到致病性朊病毒的試劑。
因此，本發(fā)明提供了制備基本上不含有致病性朊病毒的供血的方法，所述供血包括全血、血紅細(xì)胞、血漿、血小板或血清，所述的方法包括(a)用本文所提供的用以檢測(cè)致病性朊病毒的任何一種檢測(cè)方法篩選從采集的血液樣品中得到的全血、血紅細(xì)胞、血漿、血小板或血清的部分；
(b)棄去任何其中檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品；并(c)合并其中未檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品，以提供基本上不含有致病性朊病毒的供血。
類似地，可以篩選食物供給以檢測(cè)致病性朊病毒的存在情況，用以提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供給。因此，使用任何本文所述的方法可對(duì)打算作為人或動(dòng)物食物消耗的活的生物體獲得的樣品進(jìn)行篩選，以檢測(cè)致病性朊病毒的存在情況。也可以篩選從打算進(jìn)入食物供給的食物制品采集到的樣品。鑒定在其中檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品，并將檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品所對(duì)應(yīng)的打算進(jìn)入食物供給的活的生物體或食物從食物供給中去除。這樣，就可以提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供給。
因此，本發(fā)明提供了制備基本上不含有致病性朊病毒的食物供給的方法，所述方法包括(a)用本文所述的任何一種檢測(cè)致病性朊病毒的檢測(cè)方法篩選從將要進(jìn)入食物供給的活的生物體或從打算進(jìn)入食物供給的食物采集到的樣品；(b)清除其中檢測(cè)到致病性致病性朊病毒的樣品；并(c)合并其中未檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品，以提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供給。
B.純化為了達(dá)到分離致病性朊病毒的目的(例如，為了在檢測(cè)之前濃縮朊病毒蛋白)，以及為了達(dá)到從樣品中清除致病性朊病毒的目的(例如，作為提供基本上不含有致病性朊病毒的樣品的一種手段)，本發(fā)明的肽也可用于從樣品中去除致病性朊病毒。在這些方法中，肽試劑通常提供在供血支持物上。將含有肽試劑的固相支持物與含有致病性朊病毒的樣品相接觸，所處的條件允許朊病毒結(jié)合到肽試劑上。如果目的是分離朊病毒蛋白，則棄去未結(jié)合的樣品并收集含有朊病毒的供血支持物；如果目的是從樣品中清除朊病毒，則收集未結(jié)合的樣品。
因此，本發(fā)明提供了從樣品中分離致病性朊病毒的方法，該方法包括(a)提供含有本發(fā)明所述的肽試劑的固相支持物；(b)將所述樣品與所述固相支持物相接觸，所處的條件為在所述樣品中存在致病性朊病毒的情況下，允許致病性朊病毒蛋白與所述第一肽試劑結(jié)合，以形成第一復(fù)合物；以及
(c)去除未結(jié)合的樣品材料。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以將所述致病性朊病毒從所述第一復(fù)合物中解離下來(lái)。可以用蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域所熟知的技術(shù)來(lái)達(dá)到解離目的。
本發(fā)明還提供了從樣品中清除致病性朊病毒的方法，該方法包括(a)提供含有本發(fā)明的肽試劑的固相支持物；(b)將所述固相支持物與懷疑含有致病性朊病毒的樣品相接觸，所處的條件允許致病性朊病毒與肽試劑的結(jié)合(如果有致病性朊病毒存在)；并(c)回收未結(jié)合的樣品材料。
C.組合物本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本文所述肽試劑和/或抗體(以及編碼這些肽試劑和/或抗體的多核苷酸)的組合物，本發(fā)明還涉及將這些組合物用在治療或預(yù)防性組合物中，用于治療或預(yù)防朊病毒相關(guān)疾病。此外，也可將抗體、肽試劑(和編碼這些抗體和/或肽試劑的多核苷酸)單獨(dú)或以組合形式用于組合物中，用于預(yù)防目的(即，預(yù)防疾病發(fā)生)或治療目的(即，在感染后治療疾病)。
本文所述組合物能夠治療或預(yù)防疾病的精確機(jī)制并非決定性的。不希望被一種理論所束縛，本文所述組合物能夠治療或預(yù)防構(gòu)象病可能出于以下的一種或多種機(jī)制在對(duì)象中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，然后所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可治療或預(yù)防疾病狀態(tài)；與非致病形式的蛋白發(fā)生相互作用(例如，結(jié)合)，這可能會(huì)防止非致病形式的轉(zhuǎn)化；與致病形式結(jié)合，這可能會(huì)預(yù)防其造成致病性的后果；和/或與致病形式結(jié)合，這可能會(huì)防止該致病形式將更多的非致病形式轉(zhuǎn)化為疾病形式。(參見，例如，Peretz等(2001)Nature 412739-743，測(cè)試某些Fab抑制朊病毒增殖的能力)。
組合物可以含有一種或多種肽試劑、抗體和/或寡核苷酸的混合物。這些分子可以有多種來(lái)源，例如，重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、人工合成的蛋白質(zhì)，等等。組合物也可以和其它分子一起施用，例如，抗原和免疫調(diào)節(jié)劑，如免疫球蛋白、細(xì)胞因子、淋巴因子、和趨化因子，包括，但不僅限于，IL-2、經(jīng)修飾的IL-2(cys125-ser125)、GM-CSF、IL-12、α-或γ-干擾素、IP-10、MIP1和RANTES。組合物可以有多種施用形式，作為多肽、或者作為裸露核酸(例如，DNA)、使用病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、甲病毒載體)、或者使用非病毒載體(例如，脂質(zhì)體、包被核酸或蛋白質(zhì)的顆粒)。
組合物也可以含有肽試劑和核酸的混合物，其可以使用相同或不同的形式和/或載體。相同或不同的組合物可以施用多次(例如，施用“首劑”施用以后再施用一次或多次“增強(qiáng)劑”)，以達(dá)到所需的效果。相同的組合物可以作為首劑以及作為一次或多次增強(qiáng)劑施用?；蛘?，可以使用不同的組合物作為首劑和增強(qiáng)劑。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選地為藥學(xué)可接受制劑以及藥理學(xué)可接受制劑。具體而言，組合物優(yōu)選地不會(huì)在生物或其它方面造成不良影響，也就是可以將該物質(zhì)以制劑或組合物的形式施用給個(gè)體而不會(huì)引起任何不希望得到的生物學(xué)效應(yīng)或與組合物中含有的任何組分以有害的方式發(fā)生相互作用。
如本文所述的組合物通常按需要含有治療有效量的分子(肽試劑)或編碼其的核苷酸序列、針對(duì)這些分子的抗體以及上述任何其它組分?！爸委熡行Я俊笔侵改軌蛟谖锤腥?、感染或未暴露的施藥對(duì)象中誘導(dǎo)出保護(hù)性和/或治療性應(yīng)答的用量。“治療有效量”落在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，其可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)加以確定。確切的所需計(jì)量會(huì)根據(jù)所治療的對(duì)象、所治療個(gè)體的年齡和總體狀況、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需達(dá)到的保護(hù)程度、治療的病癥嚴(yán)重性、所選擇的具體組合物及其給藥模式，等等因素而有所不同。
在某些實(shí)施方式中，肽試劑具有免疫原性，而本發(fā)明的方法包括給動(dòng)物施用含有如本文所述的肽試劑、對(duì)致病性朊病毒特異性的抗體和/或編碼這些肽試劑或抗體的多核苷酸的免疫原性組合物。用于本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選地含有這些組分的免疫學(xué)有效量?！懊庖邔W(xué)有效量”是指足以使哺乳動(dòng)物對(duì)朊病毒蛋白(優(yōu)選地，致病性朊病毒)激發(fā)出免疫應(yīng)答的用量。該免疫應(yīng)答通常在對(duì)象中引發(fā)分泌的、細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，這樣的免疫應(yīng)答包括，但不僅限于以下的一種或多種效應(yīng)從任何免疫類型產(chǎn)生抗體，如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴細(xì)胞的增殖；給免疫細(xì)胞提供活化、生長(zhǎng)和分化信號(hào)；輔助性T淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞、和/或細(xì)胞毒T細(xì)胞的擴(kuò)增。產(chǎn)生的抗體數(shù)量會(huì)隨多種不同的因素而發(fā)生改變，這些因素包括所使用的動(dòng)物、佐劑的存在，等等。
本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含一種或多種佐劑。適用于本發(fā)明的佐劑包括以下的一種或多種-大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(″LT″)，或其去毒突變體，如K63或R72突變體；-霍亂毒素(″CT″)，或其去毒突變體；-微粒體(即，直徑在～100nm至～150μm的顆粒，更優(yōu)選地，直徑在～200nm至～30μm的顆粒，最優(yōu)選地，直徑在～500nm至～10μm的顆粒)，形成微粒體的材料是生物可降解的且無(wú)毒的(例如，聚(α-羥基酸)、聚羥丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯，等)；-聚氧乙烯酯或聚氧乙烯醚(參見，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 99/52549)；-聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯昔醇的組合(參見，國(guó)際專利申請(qǐng)WO01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其它的非離子表面活性劑(如辛苯昔醇(octoxynol))的組合(參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO01/21152)；-殼聚糖(例如，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 99/27960)-免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)和皂甙(參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO00/62800)-免疫刺激雙鏈RNA。
-鋁化合物(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸氫氧化鋁、氫氧化物、正磷酸鹽、硫酸鹽，等等(例如，參見疫苗設(shè)計(jì)(“Vaccine design”)的第8和9章亞單位和佐劑途徑(the subunit and adjuvant approach)，Powell & Newman編，Plenum Press 1995(ISBN 0-306-44867-X)(下文中稱為“疫苗設(shè)計(jì)”)，或不同鋁化合物的混合物，各種化合物可以具有任何合適的形式(例如，凝膠、結(jié)晶、無(wú)定型態(tài)，等等)，優(yōu)選的是吸附的形式；-MF59(5％角鯊?fù)椤?.5％吐溫80、和0.5％司盤85，使用微流化裝置制成亞微粒)(參見疫苗設(shè)計(jì)第10章；也可以參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO90/14837)；-脂質(zhì)體(參見疫苗設(shè)計(jì)第13和14章)；-ISCOM(參見疫苗設(shè)計(jì)第23章)；-SAF，它含有10％角鯊?fù)椤?.4％吐溫80、5％普魯蘭尼克嵌段同聚物L(fēng)121、和thr-MDP，或者通過(guò)微流化制成為亞微粒乳劑，或渦旋振蕩以產(chǎn)生更大粒徑的乳劑(參見疫苗設(shè)計(jì)第12章)；-RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi Immunochem)，含有2％角鯊?fù)椤?.2％吐溫80、和選自下組的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分單磷酸脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimyxolate，TDM)，以及細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選地是MPL+CWS(DetoxTM)；-皂甙佐劑，如QuilA或QS21(參見疫苗設(shè)計(jì)第22章)，也稱為StimulonTM；-ISCOM，去可能不含有其它的去污劑(國(guó)際專利申請(qǐng)WO00/07621)；-完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；
-細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12，等等)、干擾素(例如，干擾素-γ)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子，等等(參見疫苗設(shè)計(jì)第27和28章)；-單磷酸脂A(MPL)或3-O-脫酰化MPL(3dMPL)(例如，疫苗設(shè)計(jì)第21章)；-3dMPL與例如，QS21和/或水包油乳劑的組合(歐洲專利申請(qǐng)0835318、0735898和0761231)；-含有CpG基序的寡核苷酸(參見，Krieg(2000)疫苗(Vaccine)，19618-622；Krieg(2001)Curr.Opin.Mol.Ther.，2001，315-24；WO96/02555，WO98/16247，WO98/18810，WO98/40100，WO98/55495，WO98/37919和WO98/52581，等等)，也就是至少含有一個(gè)CG二核苷酸-聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/52549)；-聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯昔醇的組合(參見，國(guó)際專利申請(qǐng)WO01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其它的非離子表面活性劑(如辛苯昔醇)的組合(參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO01/21152)；-免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)和皂甙(參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO00/62800)；-免疫刺激劑和金屬鹽顆粒(國(guó)際專利申請(qǐng)WO00/23105)；-皂甙和水包油乳劑(國(guó)際專利申請(qǐng)WO99/11241)；以及-皂甙(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選地+甾醇)(國(guó)際專利申請(qǐng)WO98/57659)。
胞壁酰肽包括，但不僅限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酰-2-(1′-2′-二軟脂酰-sn-甘油-3-羥基磷酸基氧)-乙胺(MTP-PE)，等等。
也可以獲得其它適用于粘膜或胃腸道外給藥的佐劑(參見，例如疫苗設(shè)計(jì)第7章亞單位和佐劑途徑“the subunit and adjuvant approach”，Powell &Newman編，Plenum Press 1995(ISBN 0-306-44867-X)。
LT的突變體是優(yōu)選的佐劑(例如，粘膜佐劑)，尤其是″K63″和″R72″突變體(例如，參見國(guó)際專利申請(qǐng)WO98/18928)，因?yàn)檫@些能導(dǎo)致免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。
也可以使用微粒體，優(yōu)選地，這些微粒體由以下物質(zhì)衍生而來(lái)聚(α-羥基酸)，尤其是從聚(丙交酯)(″PLA″)衍生而來(lái)、D，L-丙交酯和乙交酯或羥乙酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(″PLG″或″PLGA″)，或D，L-丙交酯與己酰內(nèi)酯的共聚物。微粒體可以衍生自多種具有不同分子量的聚合起始材料的任何一種，在共聚物(如PLG)的情況下，丙交酯∶乙交酯的各種比例也都可以應(yīng)用，其選擇大多是選擇的問(wèn)題。朊病毒、本發(fā)明的抗體和/或聚核苷酸可以包裹在微粒體中，或可以吸附到微粒體上。優(yōu)選的是將其包裹在PLG微粒體中。PLG微粒體在以下文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的描述Morris等，(1994)，疫苗(Vaccine)，125-11，在粘膜疫苗(Mucosal Vaccine)的第13章，Kiyono等編，Academic Press1996(ISBN 012410587)，以及在疫苗設(shè)計(jì)的第16和18章亞單位和佐劑途徑“the subunit and adjuvant approach”，Powell & Newman編，Plenum Press 1995(ISBN 0-306-44867-X)。
可以將LT突變體有利地與微粒體包裹的抗原聯(lián)合使用，以達(dá)到顯著增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果。
鋁化合物和MF59是胃腸道外使用的優(yōu)選佐劑。
通常，將組合物制備成可注射的制劑，液體溶液或懸浮液均可；也可以制備合適的固體形式，其在注射前可以在液相載體中形成溶液或懸浮液。也可以將制劑乳化或包裹在脂質(zhì)體中，以增強(qiáng)佐劑的效果，如上所述。
藥學(xué)可接受的鹽也可以用于本發(fā)明的組合物中，例如，礦物鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、或硫酸鹽，以及有機(jī)酸的鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽(proprionate)、丙二酸鹽、或苯甲酸鹽。尤其有用的蛋白質(zhì)底物是血清白蛋白、鎖眼型血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵清蛋白、破傷風(fēng)類毒素，以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的組合物也可以含有脂類或賦形劑，如水、鹽水、甘油、葡聚糖、乙醇，等等，單獨(dú)使用或聯(lián)合使用，以及其它物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑、乳化劑、或pH緩沖劑?？扇芜x存在載體，載體是指其本身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體的分子。合適的載體通常是大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂類聚集體(如油滴或脂質(zhì)體)，以及非活性病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的。此外，可以將組合物中的一種或多種多肽接合到細(xì)菌類毒素上，如來(lái)自白喉、破傷風(fēng)、霍亂等的毒素。
D.遞送本發(fā)明的組合物可以以單一劑量施用，或作為治療方案中的一部分。可以用任何合適的形式施用核酸和/或肽，形式包括但不僅限于，肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服和/或靜脈內(nèi)。劑量方案可以包括首劑和增強(qiáng)劑，這些可以通過(guò)粘膜、胃腸道外形式給藥，或其各種組合形式給藥。
在某些實(shí)施方式中，組合物的一種或多種組分通過(guò)胃腸道外或粘膜給藥。合適的胃腸道外給藥途徑包括肌肉內(nèi)(IM)、皮下、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮膚、和透皮途徑(參見，例如國(guó)際專利申請(qǐng)WO98/20734)，以及遞送至組織間隙空間。合適的粘膜給藥途徑包括，口服、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、肺部、腸道、直腸、眼部和陰道給藥途徑。可以使組合物適用于粘膜給藥。例如，當(dāng)組合物用于口服給藥時(shí)，其可以是片劑或膠囊的形式，任選地，通過(guò)經(jīng)腸溶包衣、液態(tài)、轉(zhuǎn)基因植物，等等形式。當(dāng)組合物用于鼻內(nèi)給藥時(shí)，其可以是鼻噴霧、鼻滴劑、凝膠或粉末。劑量治療可以是單一劑量方案或多劑量方案。
也可以將組合物(或其組分)包裹在顆粒載體中、吸附到顆粒載體上、或與顆粒載體相連接。這樣的載體可向免疫系統(tǒng)呈遞所選擇抗原的多個(gè)拷貝，并促進(jìn)抗原在局部淋巴結(jié)的捕獲和滯留。顆粒可以被巨噬細(xì)胞吞噬，并可通過(guò)細(xì)胞因子的釋放而促進(jìn)抗原遞呈。顆粒載體的實(shí)例包括從聚甲基丙烯酸甲酯聚合物衍生而來(lái)的物質(zhì)，以及由聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)衍生而來(lái)的微粒體，稱為PLG。參見，例如，Jeffery等，Phann.Res.(1993)10362-368；McGee JP，等，J Microencapsul.14(2)197-210，1997；O′Hagan DT，等，疫苗11(2)149-54，1993。也可在帶電荷去污劑(如陽(yáng)離子或陰離子去污劑)存在的情況下生產(chǎn)合適的微粒體，以產(chǎn)生表面攜帶凈負(fù)電荷或凈正電荷的微粒體。例如，在陽(yáng)離子去污劑(如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB))存在的情況下制備的微粒體，即CTAB-PLG微粒體，可以吸附帶負(fù)電的大分子，如DNA。(參見，例如，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US99/17308)。
此外，也可以使用其它顆粒系統(tǒng)和聚合物來(lái)進(jìn)行體內(nèi)或離體遞送。例如，聚合物，如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、精胺、精脒，以及這些分子的接合物可以用于轉(zhuǎn)移感興趣的核酸。類似地，DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀或使用其它不溶性無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行的沉淀，如磷酸鍶、硅酸鋁鹽(包括皂土和高嶺土)、氧化鉻、硅酸鎂、滑石等等，也可以用在本方法中。參見，例如，F(xiàn)elgner，P.L.，Advanced Drug Delivery Reviews(1990)5163-187，有關(guān)在基因轉(zhuǎn)移中有用的遞送系統(tǒng)的綜述。擬肽(Zuckerman，R.N.，等，提交于1998年11月3日的美國(guó)專利號(hào)5,831,005，引入本文作為參考)也可用于本發(fā)明構(gòu)建體的遞送。
如上所述，也可用編碼肽(或抗體)的核酸來(lái)遞送這些肽(或抗體)。將所需序列插入單順?lè)醋踊蚨囗樂(lè)醋虞d體中，該載體含有經(jīng)選擇的控制元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，等等)。一旦完成，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的基因遞送方案來(lái)遞送該構(gòu)建體，例如，用傳統(tǒng)的注射器(例如，美國(guó)專利號(hào)5,399,346,5、580,859、5,589,466)，或基因槍，如Accell基因遞送系統(tǒng)(PowderJect Technologies，Inc.，牛津，英國(guó))進(jìn)行注射；使用基于病毒的系統(tǒng)，如逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(如美國(guó)專利號(hào)5,219,740所述)、腺病毒系統(tǒng)(Barr等，Gene Therapy(1994)151-58；Berkner，K.L.BioTechniques(1988)6616-629；和Rich等，Human Gene Therapy(1993)4461-476)、腺相關(guān)病毒(AAV)系統(tǒng)(美國(guó)專利號(hào)5,173,414和5,139,941)、痘病毒系統(tǒng)、牛痘病毒遞送系統(tǒng)(參見，例如，國(guó)際公開號(hào)WO94/26911)、禽痘病毒系統(tǒng)(如家禽痘病毒和金絲雀痘病毒)、甲病毒遞送系統(tǒng)(美國(guó)專利號(hào)5,843,723；5,789,245；6,342,372；6,329,201)以及其它病毒系統(tǒng)；非病毒系統(tǒng)如帶電荷和不帶電荷的脂質(zhì)體(參見，例如，Hug和Sleight，Biochim.Biophys.Acta.(1991)10971-17；Straubinger等，在酶學(xué)方法(Methods of Enzymology)中(1983)，第101卷，512-527頁(yè)；Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)847413-7416))；和/或螺旋形脂類組合物，類似于Papahadjopoulos等，Biochem.Bioplys.Acta.(1975)394483-491所述的組合物。也可用參見，美國(guó)專利號(hào)4,663,161和4,871,488。可以將多核苷酸直接遞送到脊椎動(dòng)物對(duì)象中，或者離體遞送到來(lái)源于對(duì)象的細(xì)胞中，并將細(xì)胞重新移植入對(duì)象中。
本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含通過(guò)給動(dòng)物施用含有本發(fā)明抗體有效量的組合物治療或預(yù)防朊病毒相關(guān)疾病。
治療方法可以結(jié)合本文所述的任何組合物，例如，含有肽的組合物和/或抗體組合物。各種組分可以一起施用或分別施用。
適用于本發(fā)明方法的動(dòng)物包括人和其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如黑猩猩、以及其它猿和猴種類；農(nóng)業(yè)動(dòng)物如牛、綿羊、豬、山羊和馬，家畜如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物，如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠；鳥，包括家養(yǎng)的、野生的和獵鳥，如小雞、火雞和其它鶉雞類鳥、鴨、鵝，等等。適用于本發(fā)明的動(dòng)物可以是任何年齡的動(dòng)物，包括成年的和新生的。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用于本發(fā)明中。通常參見，Prusiner在“朊病毒”(Prions)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)9513363-13383中有關(guān)目前用于研究朊病毒相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的討論。
本發(fā)明的組合物可以用來(lái)治療或預(yù)防朊病毒相關(guān)疾病。這樣的朊病毒相關(guān)疾病包括完全或部分由致病性朊病毒蛋白(PrPSc)引起的疾病。朊病毒相關(guān)疾病包括羊瘙癢病、牛海綿樣腦病(BSE)、瘋牛病、貓海綿樣腦病、庫(kù)魯病、克-雅病(CJD)、Gerstmann-Strassler-Scheinker病(GSS)、和致命性家族性失眠癥(FFI)。
實(shí)施例以下是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方式
的實(shí)例。提供實(shí)施例僅出于說(shuō)明目的，而不在任何方面限制本發(fā)明的范圍。
我們已經(jīng)努力確保所使用數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性(例如，數(shù)量、溫度，等等)，但是應(yīng)當(dāng)允許存在某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
實(shí)施例1肽試劑的生產(chǎn)使用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)化學(xué)合成朊病毒蛋白的肽片段，基本上如以下文獻(xiàn)中所述Merrifield(1969)Advan.Enzymol.32221以及Holm和Medal(1989)，多柱肽合成(Multiple column peptide synthesis)，p.208E，Bayer和G.Jung(編)，Peptides 1988，Walter de Gruyter & Co.Berlin-N.Y.。用HPLC純化肽，并用質(zhì)譜檢驗(yàn)合成的序列。
在某些情況下，合成的肽在N或C末端含有額外的殘基，例如GGG殘基，和/或與野生型序列相比含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
A.擬肽的取代也對(duì)以下所示的肽進(jìn)行擬肽取代SEQ ID NO14(QWNKPSKPKTN，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的97至107殘基)，SEQ ID NO67(KKRPKPGGWNTGG，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的23-36殘基)以及SEQ ID NO68(KKRPKPGG，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的23-30殘基)。具體而言，用各種N-取代擬肽來(lái)取代這些肽中的一個(gè)或多個(gè)脯氨酸殘基。參見圖3，有關(guān)可用于取代任何脯氨酸的擬肽。用如美國(guó)專利號(hào)5,877,278和6,033,631(兩者都全文引入本文作為參考)和Simon等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899367中所述的方法來(lái)制備和合成擬肽。
B.多聚體化(multimerization)某些肽試劑也制備成多聚體，例如，通過(guò)制備串聯(lián)重復(fù)(通過(guò)接頭，如GGG，連接肽的多個(gè)拷貝)、多抗原性肽(MAPS)和/或線性連接的肽。
具體而言，使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)制備MAPS，基本上如Wu等(2001)J Am ChemSoc.2001 123(28)6778-84；Spetzler等(1995)Int J Pept Protein Res.45(1)78-85中所述。
也可使用聚乙二醇(PEG)接頭采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)制備線性和分支的肽(例如，PEG接頭多聚體化)。具體而言，用以下結(jié)構(gòu)來(lái)產(chǎn)生分支的多聚肽PEG支架生物素-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys-PEG-Lys(不含有肽的對(duì)照)和生物素-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)-PEG-Lys(肽)。此外，肽和Lys的連接的制備是Lys-ε-NH-CO-(CH2)3-Mal-S-Cys-肽。參見，圖5。
C.生物素化在合成和純化后，使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)對(duì)肽進(jìn)行生物素化。將生物素添加到肽的N-或C-末端。
實(shí)施例2結(jié)合試驗(yàn)A.下拉(pull-down)使用磁珠分離試驗(yàn)測(cè)試本文所述的肽試劑與朊病毒蛋白特異性結(jié)合的能力。對(duì)于本試驗(yàn)，用生物素標(biāo)記肽試劑，這就允許其粘附到鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。
從RMLPrPSc+和PrPc+Balb-c小鼠中制備腦勻漿。簡(jiǎn)言之，將5mL TBS緩沖液(50mMTris-HCl pH7.5和37.5mM NaCl)以及1％TW20和1％triton 100加到稱重為～0.5g的腦組織中，以產(chǎn)生10％的勻漿。對(duì)腦漿進(jìn)行勻漿直至大顆粒消失。取200μl的勻漿，以緩沖液1∶1稀釋，加入預(yù)冷的微量離心管中，對(duì)樣品超聲數(shù)次，每次幾秒鐘。樣品在500x條件下離心10-15分鐘，并除去上清液。
為了檢測(cè)蛋白酶K消化的效果，將一部分上清液分成兩份樣品，在一份樣品中加入4μl蛋白酶K并在37℃條件下振蕩1小時(shí)。往蛋白酶K試管中加入8微升的PMSF，以終止消化，并將試管在4℃條件下孵育至少1小時(shí)。
將勻漿儲(chǔ)存在4℃條件下直至再次使用，如果需要的話可以再次用如上所述方法進(jìn)行超聲。將10％w/v放入PrPc+或PrPSc+腦勻漿制備物在4℃條件下與生物素標(biāo)記的肽試劑一起孵育過(guò)夜，如下所述。準(zhǔn)備含有400μl緩沖液、50μl提取物和5μl生物素標(biāo)記肽試劑的試管(10mM的原料)。將試管置于室溫中至少孵育2小時(shí)，或在4℃條件下在平板振蕩器中孵育過(guò)夜。
孵育后，加入50μl的SA-珠(Dynal M280 Streptavidin 112.06)，并用渦旋振蕩試管進(jìn)行混合。在振蕩情況下(VWR，Rocking platform，Model 100)孵育試管，室溫下1小時(shí)或4℃條件下過(guò)夜。
從振蕩器中取出樣品，置于磁場(chǎng)中收集附著了肽試劑和朊病毒的磁珠，并用1ml的試驗(yàn)緩沖液洗滌5-6次?？梢粤⒓词褂脴悠?，或儲(chǔ)存在-20℃條件下直到進(jìn)行Western印跡或ELISA，如下文所述。
B.Western印跡Western印跡分析以如下所述方式進(jìn)行。將如上文所述沉淀的珠-肽-朊病毒復(fù)合物，在最后一次洗滌以后，通過(guò)向每支試管中加入25-30μl的SDS緩沖液(Novex Tris-Glycine SDS-Sample Buffer 2X)，使其變性。用渦旋振蕩使試管混合，直至所有的珠子都懸浮起來(lái)。煮沸試管，直至頂部開始彈開(come open)，在標(biāo)準(zhǔn)的SDS-PAGE凝膠中跑樣，并轉(zhuǎn)移到固相膜上用于WB分析。
在室溫條件下，在5％牛奶/TBS-T[50ml 1M Tris pH7.5；37.5ml 4M NaCl，1-10mL吐溫，加入牛奶使總體積達(dá)到1L]中對(duì)膜封閉30分鐘。如國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US03/31057所述(該申請(qǐng)?zhí)峤挥?003年9月30日，名為“朊病毒嵌合體及其用途”“Prion Chimeras and Uses Thereof”)，向膜加入10-15ml以1∶50比例稀釋的抗朊病毒多克隆抗體，并在室溫條件下孵育1小時(shí)。在TBS-T中多次洗膜。洗滌后，加入以1∶1000比例稀釋(在TBS-T中)的接合有堿性磷酸酶(AP)的二抗(羊抗兔IgG(H+L)抗體(Pierce))，并在室溫條件下孵育20分鐘。在TBS-T中多次洗膜。加入堿性磷酸酶沉淀劑(1-步NBT/BCIP(Pierce))，并顯影直至背景出現(xiàn)或信號(hào)明顯。
C.ELISA最后一次洗滌以后，用胍硫氰酸鹽使上文所述的珠-肽復(fù)合物變性，并對(duì)變性的蛋白質(zhì)實(shí)施ELISA，方法如先前Ryou等(2003)Lab I7svest.83(6)837-43中所描述的。高于空白對(duì)照的O.D.值(在.172-.259之間)被認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果。
D.結(jié)果表2中歸納了Western印跡和ELISA結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。簡(jiǎn)言之，要檢測(cè)如本文所述的肽試劑與PrPSc的特異性結(jié)合，蛋白酶K消化腦勻漿步驟并不是必需的。如圖4中所示，從未觀察到肽試劑與野生型腦勻漿的結(jié)合，這就表明肽試劑特異性地結(jié)合PrPSc。此外，上文所述的Western印跡分析在高于4個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)稀釋的樣品中仍能檢測(cè)到PrPSc，而ELISA則比Western印跡至少靈敏10倍。
表2


1目測(cè)評(píng)估的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度2環(huán)化的3在所示位置加入/插入GGGG殘基
4在所示位置加入/插入GGG殘基5在所示位置加入/插入GG殘基6在所示位置加入/插入KKK殘基ND＝?jīng)]有測(cè)定也實(shí)施了丙氨酸掃描以鑒定參與結(jié)合的殘基。
結(jié)果顯示于表3中。
表3

此外，如表4所示，具有SEQ ID NO14、SEQ ID NO67和SEQ ID NO68的肽試劑，在其脯氨酸殘基被多個(gè)N-取代甘氨酸(擬肽)替換后，其與PrPSc的結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)。
表4



1在該表所示實(shí)驗(yàn)中，任選的GGG接頭并未存在于肽試劑中。
此外，PrPSc-結(jié)合肽試劑的多聚體化也能改善其與PrPSc的親和性。具體而言，串聯(lián)重復(fù)比單拷貝給出更強(qiáng)的信號(hào)(如Western印跡分析中所測(cè)定的)。在某些情況下，珠上的預(yù)衍生MAP形式可將結(jié)合提高至2倍。然而，MAP形式會(huì)在溶液中引起肽的沉淀。同樣檢測(cè)了線性連接的肽在不引發(fā)沉淀的情況下增強(qiáng)結(jié)合的能力。
實(shí)施例3抗體生產(chǎn)以下提供的實(shí)施例可以用來(lái)生產(chǎn)抗本發(fā)明肽試劑的抗體。
用含有如本文所述肽試劑(例如，SEQ ID NO12-108中的任一種，優(yōu)選地，SEQ ID NO14、35、50、51、56、57、65、66、67、68、72、73、77、81、82中的任一種)的組合物對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，在第0天進(jìn)行IM(肌肉內(nèi))或IP(腹腔內(nèi))免疫，隨后施用2-5劑增強(qiáng)劑，其施用間隔不超過(guò)每?jī)芍芤淮蔚念l度。在第一次免疫前以及每次施用增強(qiáng)劑后的7天采集血液，以監(jiān)測(cè)對(duì)抗原的體液反應(yīng)。對(duì)每只動(dòng)物采集6次眼窩血液(每只眼睛3次)，每次采集的血液約為0.2ml，或更少。最后一劑增強(qiáng)劑采用IV(靜脈內(nèi))注射。施用最后一劑增強(qiáng)劑后的三天，通過(guò)將小鼠暴露在CO2或異熒烷(isofluorane)中而對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死，隨后進(jìn)行脫頸椎。然后，采集脾臟用于產(chǎn)生雜交瘤。
使用完全弗氏佐劑作為第一次注射的佐劑，而對(duì)其余的注射則使用不完全弗氏佐劑(除了IV注射)。IV注射液在鹽水中制備。
盡管已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式做了具體描述，可以理解的是，可以在不脫離如本文所述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下對(duì)其進(jìn)行明顯的變化。
權(quán)利要求
1.一種分離的肽試劑，其特征在于，較之構(gòu)象病蛋白的非致病性形式，該肽試劑優(yōu)先與構(gòu)象病蛋白的致病性形式發(fā)生相互作用。
2.如權(quán)利要求1所述的肽試劑，其特征在于，所述構(gòu)象病是朊病毒相關(guān)疾病，致病性蛋白質(zhì)是PrPSC，而非致病性形式為PrPC。
3.如權(quán)利要求2所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于朊病毒蛋白的片段。
4.如權(quán)利要求3所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑含有聚脯氨酸II型螺基序。
5.如權(quán)利要求1所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑含有序列基序PXXP，其中P是脯氨酸或N-取代的甘氨酸，而X是任何氨基酸。
6.如權(quán)利要求2所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑含有序列基序PXXP，其中P是脯氨酸或N-取代甘氨酸，而X是任何氨基酸。
7.如權(quán)利要求1所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑是遺傳編碼的。
8.如權(quán)利要求2所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于具有SEQ IDNOs12-132的肽。
9.如權(quán)利要求8所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于選自以下組的肽具有SEQ ID NOs66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126，127，14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，128，129，130，131，132，56，57，65，82，和84的肽。
10.如權(quán)利要求8所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于選自以下組的肽具有SEQ ID Nos66，67，68，72，81，96，97，98，107，108，119，120，121，122，123，124，125，126和127的肽。
11.如權(quán)利要求8所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑包含氨基酸序列(G)n，其中n＝1，2，3，或4，該序列位于N末端和/或C末端。
12.如權(quán)利要求9或10所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑是生物素化的。
13.如權(quán)利要求8所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于選自以下組的肽具有SEQ ID Nos14，35，36，37，40，50，51，77，89，100，101，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，128，129，130，131，和132的肽。
14.如權(quán)利要求13所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑包含氨基酸序列(G)n，其中n＝1，2，3，或4，該序列位于N末端和/或C末端。
15.如權(quán)利要求13或14所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑是生物素化的。
16.如權(quán)利要求8所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于選自以下組的肽具有SEQ ID Nos109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，129，130，131，和132的肽。
17.如權(quán)利要求16所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑是生物素化的。
18.如權(quán)利要求8所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑來(lái)源于選自以下組的肽具有SEQ ID Nos56，57，65，82，和84的肽。
19.如權(quán)利要求18所述的肽試劑，其特征在于，該肽試劑是生物素化的。
20.一種編碼如權(quán)利要求7所述的肽試劑的多核苷酸。
21.一種復(fù)合物，其特征在于，該復(fù)合物包含如權(quán)利要求2-19中任一項(xiàng)所述的肽試劑以及致病性朊病毒蛋白。
22.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑相接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒，如果有致病性朊病毒存在，以形成第一復(fù)合物，其中第一肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；和(b)通過(guò)致病性朊病毒與第一肽試劑的結(jié)合，如果樣品中含有致病性朊病毒，來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑是可檢測(cè)標(biāo)記的。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑是生物素化的。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑連接在固相支持物上。
26.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑相接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒，如果樣品中存在致病性朊病毒，以形成第一復(fù)合物，其中所述第一肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；(b)將所述第一復(fù)合物與第二肽試劑相接觸，所處的條件允許第二肽試劑結(jié)合到所述第一復(fù)合物中的致病性朊病毒上，其中所述的第二肽試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記，并且第二肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；和(c)通過(guò)致病性朊病毒與第二肽試劑的結(jié)合，如果存在致病性朊病毒，來(lái)檢測(cè)致病性朊病毒的存在情況。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑和所述第二肽試劑是不同的。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑和所述第二肽試劑是相同的。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑連接在固相支持物上。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述第一肽試劑是生物素化的。
31.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒，如果有致病性朊病毒存在，以形成第一復(fù)合物，其中第一肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；(b)去除未結(jié)合的樣品材料；(c)將所述致病性朊病毒從所述第一復(fù)合物上解離下來(lái)；(d)將所述解離的致病性朊病毒與第二肽試劑接觸，所處的條件允許第二肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒，其中所述的第二肽試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記，并且第二肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；以及(e)通過(guò)致病性朊病毒與第二肽試劑的結(jié)合，如果有致病性朊病毒存在，來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
32.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與第一肽試劑接觸，所處的條件允許第一肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒，如果有致病性朊病毒存在，以形成第一復(fù)合物，其中第一肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；(b)去除未結(jié)合的樣品材料；(c)將所述致病性朊病毒從所述第一復(fù)合物上解離下來(lái)；(d)將所述解離的致病性朊病毒與朊病毒結(jié)合試劑接觸，所處的條件允許朊病毒結(jié)合試劑結(jié)合到致病性朊病毒，其中所述的朊病毒結(jié)合試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記；以及(e)通過(guò)致病性朊病毒與朊病毒結(jié)合試劑的結(jié)合，如果有致病性朊病毒存在，來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述朊病毒結(jié)合試劑選自抗朊病毒抗體、基序移植雜交多肽、陽(yáng)離子或陰離子聚合物、增殖催化劑和纖維蛋白溶酶原。
34.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)將懷疑含有致病性朊病毒的樣品與朊病毒結(jié)合試劑接觸，所處的條件允許朊病毒結(jié)合試劑結(jié)合到致病性朊病毒，如果有致病性朊病毒存在，以形成第一復(fù)合物；(b)去除未結(jié)合的樣品材料；(c)將所述第一復(fù)合物與如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述的肽試劑接觸，所處的條件允許肽試劑結(jié)合到致病性朊病毒，其中所述肽試劑含有可檢測(cè)標(biāo)記；(d)通過(guò)致病性朊病毒與肽試劑的結(jié)合，如果有致病性朊病毒存在，來(lái)檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
35.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的方法，該方法包括(a)提供含有第一肽試劑的固相支持物，其中第一肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；(b)將樣品與固相支持物接觸，所處的條件允許致病性朊病毒，當(dāng)其存在時(shí)，結(jié)合到第一肽試劑上；將固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的第二肽試劑接觸，所處的條件允許第二肽試劑結(jié)合到與第一肽試劑結(jié)合的致病性朊病毒，其中第二肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；以及，(c)檢測(cè)由第一肽試劑、來(lái)自樣品的致病性朊病毒和第二肽試劑形成的復(fù)合物，從而檢測(cè)樣品中致病性朊病毒的存在情況。
36.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)提供含有朊病毒結(jié)合試劑的固相支持物；(b)將樣品與固相支持物接觸，所處的條件允許致病性朊病毒，當(dāng)其存在時(shí)，結(jié)合到朊病毒結(jié)合試劑上；(c)將固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的第二肽試劑接觸，其中第二肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；以及，(d)檢測(cè)由朊病毒結(jié)合試劑、來(lái)自樣品的致病性朊病毒和第二肽試劑形成的復(fù)合物。
37.一種檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的方法，該方法包括(a)提供含有第一肽試劑的固相支持物，其中第一肽試劑如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述；(b)將固相支持物與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的第一配體混合，其中第一肽試劑與帶有可檢測(cè)標(biāo)記的第一配體的結(jié)合親和力弱于第一肽試劑與致病性朊病毒的結(jié)合親和力；(c)將樣品與固相支持物相混合，所處的條件允許在樣品中存在致病性朊病毒的情況下，致病性朊病毒取代第一配體而與第一肽試劑結(jié)合；(d)檢測(cè)由第一肽試劑和來(lái)自樣品的致病性朊病毒之間形成的復(fù)合物。
38.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述固相支持物選自硝化纖維素、聚苯乙烯、乳膠、聚氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、活化珠和磁感應(yīng)珠。
39.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述樣品是生物樣品。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物樣品選自器官、全血、血液部分、血液組分、血漿、血小板、血清、腦脊液(CSF)、腦組織、神經(jīng)系統(tǒng)組織、肌肉組織、骨髓、尿、淚液、非神經(jīng)系統(tǒng)組織、器官、和/或活組織檢查或尸體剖檢。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述生物樣品是全血、血漿、血小板、血液部分或血清。
42.一種固相支持物，其特征在于，所述固相支持物含有至少一種如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述的肽試劑。
43.一種用以檢測(cè)樣品中致病性朊病毒存在情況的試劑盒，該試劑盒含有a)如權(quán)利要求42所述的一種固相支持物；和其它所需試劑，以及任選地，陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
44.含有如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述的肽試劑的組合物。
45.含有如權(quán)利要求20所述多核苷酸的組合物。
46.一種治療或預(yù)防朊病毒疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給動(dòng)物施用如權(quán)利要求44所述的一種或多種組合物。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
49.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，使用如下方法施用所述組合物肌肉內(nèi)、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、透皮、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、口服或靜脈內(nèi)。
50.一種治療或預(yù)防朊病毒疾病的方法，該方法包括(a)在引發(fā)步驟中施用含有如權(quán)利要求44所述組合物的第一種組合物，并(b)施用含有如權(quán)利要求44所述組合物的第二種組合物，作為增強(qiáng)劑，其用量足以在對(duì)象中誘發(fā)免疫反應(yīng)。
51.一種從樣品中分離致病性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)提供含有如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述的肽試劑的固相支持物；(b)將所述樣品與所述固相支持物相接觸，所處的條件允許在樣品中存在致病性朊病毒蛋白的情況下，致病性朊病毒蛋白與所述第一肽試劑結(jié)合，以形成第一復(fù)合物；(c)去除未結(jié)合的樣品材料。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，該方法進(jìn)一步包括將所述致病性朊病毒蛋白從所述第一復(fù)合物中解離下來(lái)的步驟。
53.從樣品中清除致病性朊病毒蛋白的方法，該方法包括(a)提供含有如權(quán)利要求2，8，9，10，13或16中任一項(xiàng)所述的肽試劑的固相支持物；(b)將所述固相支持物與懷疑含有致病性朊病毒蛋白的樣品相接觸，所處的條件允許致病性朊病毒蛋白與肽試劑的結(jié)合，如果有致病性朊病毒蛋白存在；并(c)回收未結(jié)合的樣品材料。
54.一種制備基本上不含有致病性朊病毒的血液供給的方法，所述血液供給包括全血、血漿、血小板或血清，該方法包括(a)用如權(quán)利要求22所述的方法篩選從采集的血液樣品中得到的全血、血漿、血小板或血清的部分；(b)棄取其中檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品；并(c)合并其中未檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品，以提供基本上不含有致病性朊病毒的血液供給。
55.一種制備基本上不含有致病性朊病毒的食物供給的方法，該方法包括用如權(quán)利要求22所述的方法篩選采集自將要進(jìn)入食物供給的活生物體的樣品或采集自意圖進(jìn)入食物供給的食物的樣品；(b)棄取其中檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品；并(c)合并其中未檢測(cè)到致病性朊病毒的樣品，以提供基本上不含有致病性朊病毒的食物供給。
全文摘要
描述了優(yōu)先與PrP
文檔編號(hào)C07H23/00GK1984669SQ200480023132
公開日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者M·D·米切爾切希, C·胡 申請(qǐng)人:希龍公司