專利名稱：乳腺特異性表達水牛prl基因載體、構(gòu)建及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其是涉及一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體、 構(gòu)建及其應用。
背景技術：
催乳素(prolactin，PRL)是腦垂體分泌的一種單鏈多肽類激素，在動物體內(nèi)具有多種重要的生物學功能，目前已發(fā)現(xiàn)的生物學功能超過300種，其中對啟動和維持泌乳具有重要意義，對乳蛋白、乳糖和乳脂等重要乳成分的合成起主要調(diào)控作用，因而PRL基因是與產(chǎn)奶量密切相關的基因之一。Brym等研究表明，PRL-RsaI位點對奶牛的產(chǎn)奶量和乳脂率具有顯著影響。PRL基因缺陷性小鼠中，純合體雌性小鼠乳腺不發(fā)育，切片結(jié)果顯示，其乳腺腺泡未得到正常發(fā)育。假孕兔注射PRL，能引起乳腺腺泡分化，高爾基氏囊泡膨大，腺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪球和蛋白質(zhì)膠粒。體外實驗表明，PRL有促進未分化的乳腺細胞分裂的作用。而乳腺腺泡細胞的發(fā)育則需要雌二醇、孕酮與催乳素的協(xié)同作用。由此可見，催乳素 PRL基因?qū)δ膛Ｃ谌樾阅芫哂兄匾{(diào)節(jié)作用。
目前，對PRL的有關研究日益增多，開展實驗需要大量PRL蛋白，例如Elisa試劑盒需要標準品；生產(chǎn)各類抗體過程中，也需要PRL蛋白作為抗原。然而，由于PRL僅在垂體組織中大量表達，而垂體是一個很小的內(nèi)分泌腺(例如成人垂體大小約為1x1. 5x0. 5cm3，重僅約0. 5 0. 6克)，從垂體中提取純化的催乳素價格極其昂貴，遠不能滿足市場需求。通過原核表達方法純化出的PRL蛋白，由于無法確保其序列空間折疊的正確性，生產(chǎn)的蛋白難以保證具有生理活性。市場上的PRL蛋白主要依靠細胞系表達法生產(chǎn)，可是生產(chǎn)成本依然昂貴。因此，急需發(fā)展一種可以大量獲得廉價RPL蛋白的方法。
此外，2004年中國人均奶類年占有量僅18. 4公斤，在世界上排在百名之后，不及世界平均水平的1/5、亞洲平均水平的1/2。因而，現(xiàn)階段急需一種可提高動物產(chǎn)奶量的方法，以滿足市場對奶制品的需求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體、構(gòu)建及其應用，利用該乳腺特異性表達水牛PRL基因載體可生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，用于生產(chǎn)水牛PRL蛋白并能提高轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)奶量，以滿足市場對廉價RPL蛋白和奶制品的大量需求。
為解決上述技術問題本發(fā)明采用如下技術方案乳腺特異性表達水牛PRL基因載體，該載體是
載體一pMD18T-BCN-PRL/Hi s-BCNpo lyA-cmv-EGFP-SV40polyA，
或載體二pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA。
上述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟
<1>提取水牛垂體總mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，采用特異性引物進行PCR擴增得到全長水牛PRL的cDNA序列，經(jīng)膠回收純化PCR產(chǎn)物后，將其TA克隆插入到pMD18T載體中，得到PMD18T-PRL 載體；
<2>以步驟<1>中得到的載體為模板，用加有酶切位點和His標簽的引物進行PCR 擴增，得到水牛PRL基因的CDS片段，并將其TA克隆到pMD18T載體中，得到pMD18T_PRL/ His載體；
<3> 以 pMD18T 為載體骨架，依次酶切連入 Kpnl-BCNpolyA-SacI、BamHI-PRL/ His-KpnI, SalI-NotI-BCN-BamHI, SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI 或 Sal I-EF3 21-EGFP-1 RES-NE0-SV40polyA-NotI四個片段，得到載體一或載體二。
步驟<1> 引物為上游引物 5，-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，，下游引物 5，-GGGGTACC GATTTTGACATCGCTACAGAGT-3‘；
步驟<2> 引物為上游引物 5，-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGG TTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，，下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。
上述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物中的應用。
采用原核注射法，將載體一或載體二轉(zhuǎn)移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠或水牛。
SalI和PvuI酶切載體一，回收片段溶于TE溶液中，線性化載體質(zhì)粒經(jīng)稀釋后注入到小鼠的受精卵原核中，再將受精卵移植入同期發(fā)情的代孕母鼠的輸卵管處，待產(chǎn)出子鼠， 經(jīng)鑒定得到轉(zhuǎn)基因小鼠。
上述轉(zhuǎn)基因動物在生產(chǎn)水牛PRL蛋白中的應用。
本發(fā)明利用β-酪蛋白啟動子啟動水牛PRL基因，構(gòu)建了乳腺特異性表達水牛PRL 基因載體，并采用原核注射法，將乳腺特異性表達水牛PRL基因載體轉(zhuǎn)入動物基因組中，使 PRL基因僅在乳腺中表達，建立乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉(zhuǎn)基因動物。通過對轉(zhuǎn)水牛 PRL基因小鼠的分析檢測，確定小鼠乳汁中表達水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表達可以顯著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1，4-半乳糖甘轉(zhuǎn)移酶的表達水平。本發(fā)明既保證了在乳腺中表達PRL基因，以增加轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)奶量，又避免了全身表達PRL基因?qū)D(zhuǎn)基因動物的嚴重傷害；同時乳腺中表達的PRL蛋白隨乳汁排出，可在奶水中純化得到PRL蛋白，由于生產(chǎn)的PRL蛋白帶有His標簽，可為后期提純PRL蛋白提供便利，節(jié)約成本。因此，應用本發(fā)明可望通過轉(zhuǎn)PRL水牛的制備，獲得有大量廉價的的PRL蛋白，并提高水牛的產(chǎn)奶量和乳液中的酪蛋白水平，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。


圖1是本發(fā)明乳腺特異性表達水牛PRL基因載體圖，圖中雙標為 cmv-EGFP-SV40polyA 或 EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA，BCN 為 β-酪蛋白啟動子，PRL 為牛催乳素⑶S，polyA為β-酪蛋白3 ‘非翻譯區(qū)。
圖2是本發(fā)明乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構(gòu)建路線圖。
圖3是水牛PRL基因⑶S序列PCR擴增片段電泳圖。
圖4是本發(fā)明乳腺特異性表達水牛PRL基因載體一瞬時轉(zhuǎn)染Bcap37細胞系4 后熒光檢測圖，圖中A為常光，B為熒光。
圖5是瞬時轉(zhuǎn)染Bcap37細胞系后RT-PCR檢測電泳圖，圖中3. 8kb和5. 2kb分別是由不同長度的BCN啟動子構(gòu)建的質(zhì)粒。4
圖6是FO代轉(zhuǎn)PRL基因小鼠尾尖基因組DNA PCR檢測電泳圖，圖中1為陰性對照，18道為陽性對照。
圖7是轉(zhuǎn)PRL基因母鼠乳汁中PRL濃度Elisa檢測中的標準曲線圖。
圖8是乳腺特異性表達PRL基因?qū)γ谌橄嚓P基因表達水平的QRT-PCR檢測圖。
具體實施方式
一、實驗材料和方法
所用載體、細胞系和試劑來源pMD18T載體(購自Takara公司)， PHC79-EF321-EGF P-IRES-NE0 由中國農(nóng)大提供，pMD18T-BCNpolyA、pMD18T_BCN為發(fā)明人自行制備。引物合成以及序列測定由華大基因有限公司完成，Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶、 QPT-PCR相關試劑均購自Takara公司，小提質(zhì)粒以及膠回收試劑盒購自TIANGEN公司，去內(nèi)毒小提質(zhì)粒試劑盒購自OMEGA公司，細胞轉(zhuǎn)染以及胞質(zhì)內(nèi)注射用外源基因膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，細胞轉(zhuǎn)染作用的Bcap37細胞系為申請人保存，體細胞克隆所用試劑均來自 Sigma公司，Western Blot所用抗體來自康為公司，牛PRL Elisa檢測試劑盒購自Cusabio 公司。
所用基因組提取、總RNA提取、總蛋白提取、PCR擴增、反轉(zhuǎn)錄、酶切、膠回收、連接、 轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、顯微注射法、精子介導法、Western Blot、Southe rnBlot, Elisa、QRT-PCR等實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》(2000年，科學出版社)或相應的試劑盒說明書。轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)由廣州賽業(yè)公司代理。
二、乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構(gòu)建
如圖1和圖2所示，根據(jù)NCBI上公布的牛PRL的mRNA序列(NM_173953. 2)設計合成的特異性引物，上游引物5’ -AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，(見序列表SEQ. ID. No. 2的堿基序列)，下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，(見序列表 SEQ. ID. No. 3 的堿基序列)。從屠宰場取新鮮的水牛垂體組織，保存于液氮中運回到實驗室。采用Trizol 試劑提取總RNA，電泳檢測總RNA質(zhì)量后進行反轉(zhuǎn)錄反應。取2uL反轉(zhuǎn)產(chǎn)物為模板，用上述引物進行 PCR擴增，擴增條件:94°C,30sec ；61°C，30sec ；72°C，55sec ；共 35 個循環(huán)。1. 5% 的瓊脂糖電泳檢測到901bp的特異性片段(見序列表SEQ. ID. No. 1的堿基序列)，將該片段進行膠回收后TA克隆到pMD18T載體中，得到pMD18T-PRL載體并進行測序。
以pMD18T-PRL載體為模板，用加有酶切位點和His標簽的引物擴增得到PRL的 CDS 區(qū)。上游引物 5’ -CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGGTTCTACCCCCGTCTG TCCCAAT-3，(見序列表 SEQ. ID. No. 5 的堿基序列)；下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGC TACAGAGT-3，(見序列表 SEQ. ID. No. 6 的堿基序列)。擴增條件:94 V，30sec ；61°C，30sec ； 72°C，5kec;共35個循環(huán)。1. 5%的瓊脂糖電泳檢測到804bp的特異性片段(見圖3，見序列表SEQ. ID. No. 4的堿基序列)，將該片段進行膠回收后TA克隆插入到pMD18T載體中，得到pMD18T-PRL/His載體并測序。
將事先制備的p-BCNpolyA載體和環(huán)狀的pMD18T載體用McI和KpnI酶切連接，轉(zhuǎn)化DH5 α菌，篩選出陽性克隆，得到pMDIST-BCNpolyA載體；將該載體與上述pMD18T-PRL/His載體用BamHI和KpnI酶切連接，轉(zhuǎn)入DH5 α中篩選出陽性克隆， 得到pMD18T-PRL-BCNpolyA載體；將該載體與事先制備的p-BCN載體用BamHI和Sal酶切連接，轉(zhuǎn)入DH5 α中篩選出陽性克隆，得到pMD18T-BCN-PRL-BCNpolyA載體；將該載體分別與事先制備的p-BCNcmV-EGFP-SV40pOlyA載體和經(jīng)過酶切位點改造的 pEF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA載體用NotI和Sal酶切連接，轉(zhuǎn)入DH5 α中篩選出陽性克隆,得到供原核注射的 pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40poIyA 載體(載體一)和可供篩選的 pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA 載體 (載體二)。
三、細胞水平上檢測乳腺特異性表達水牛PRL基因載體
將pMD18T-BCN-PRL/Hi s-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40poIyA 載體用 Lipo2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染Bcap37細胞系。如圖4所示，4 后觀察熒光，可見綠色熒光表達，收集細胞提取總RNA和總蛋白?？俁NA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，PCR方法檢測PRL基因的表達情況，檢測引物 上游引物 5，-ACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，；下游引物 5，-GATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。擴增條件:94°C,30sec ；6rC,30sec ；72°C,55sec ；共35個循環(huán)。1. 5%的瓊脂糖電泳檢測證明 (如圖5所示，將Bcap37細胞系分為四組，用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染這3. 81ABCN啟動的PRL 載體、5. 21ABCN啟動的PRL載體、EGFP-Nl載體以及空白對照(只加脂質(zhì)體2000)；圖中A 顯示，3. 81ABCN啟動子與5. 21Λ啟動子啟動的水牛PRL兩個載體RT-PCR擴增得到與相應質(zhì)粒PCR擴增相同的804bp的PRL陽性片段，而EGFP-Nl以及空白對照則沒有擴增得到陽性片段；圖中B顯示，四組細胞均可擴增得到190bp的β -action內(nèi)參基因的陽性片段)，BCN 可啟動PRL基因在Bcap37中轉(zhuǎn)錄?？偟鞍走M行^festern Blot檢測，一抗為小鼠抗6XHis 蛋白抗體，二抗為羊抗鼠抗體，檢測結(jié)果呈陽性。以上結(jié)果表明，BCN啟動子可在Bcap37細胞系中啟動PRL/His的表達。
四、乳腺特異性表達水牛PRL蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)與檢測
采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pMD18T-BCN-PRL/ His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA質(zhì)粒，用SalI和PvuI雙酶切該質(zhì)粒，進行膠回收，回收片段溶于TE溶液中。線性化質(zhì)粒載體稀釋后注入到小鼠的受精卵原核中，將受精卵移植入同期發(fā)情的代孕母鼠的輸卵管處，待產(chǎn)出子鼠。取產(chǎn)出的子鼠尾尖組織，提基因組DNA后進行PCR檢測，得到8只陽性小鼠(如圖6所示，2、3、7、9、10、12、14和15道)。將經(jīng)鑒定得到的轉(zhuǎn)基因小鼠進行EGFP熒光檢測，發(fā)射光525nm，激發(fā)光488nm，添加了熒光背景濾光片425nm，曝光時間為^ec,其中4只小鼠中檢測明顯的綠色熒光，1只檢測到微弱的綠色熒光，3只未檢測綠色熒光。
將FO代轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠交配，得到Fl代轉(zhuǎn)基因小鼠。提取其尾尖組織基因組DNA進行PCR檢測篩選，為避免假陽性，選擇兩對引物進行擴增，電泳檢測均為陽性的小鼠留種傳代。
將哺乳期轉(zhuǎn)PRL基因母鼠與仔鼠隔離4小時后，腹腔注射0. 3IU的縮宮素，IOmin 后腹腔注射速眠新麻醉小鼠，用蘸有溫水的棉球輕敷乳頭周圍后采奶。將采集到的奶水按 1 10的體積加ddH20稀釋后，4°C 5000g離心lOmin，取中間溶液層做狗8丨6111 Blot檢測。 一抗為小鼠抗6XHis蛋白抗體，二抗為羊抗鼠抗體，檢測結(jié)果呈陽性。由此證明，BCN啟動子可在活體小鼠乳腺中啟動PRL/His的表達，并在奶水中檢測到PRL/His蛋白。
五、轉(zhuǎn)基因小鼠奶水中水牛PRL蛋白濃度檢測
將產(chǎn)仔第十天的母鼠與仔鼠隔離4小時后，腹腔注射0. 3IU的縮宮素，IOmin后腹腔注射速眠新麻醉小鼠，用蘸有溫水的棉球輕敷乳頭周圍后采奶。將采集到的奶水按 1 10的體積加ddH20稀釋后，4°C 5000g離心lOmin，取中間溶液層用作水牛PRL Elisa 檢測。如圖7所示，將標準品組數(shù)據(jù)做擬合曲線分析，y = 51091Xe(-6 1022x), R2 = 0.9991， 計算得到小鼠奶水中水牛PRL的平均濃度為56. 71ng/ml，個體最高濃度為104. 8ng/ml。
六、乳腺特異性表達PRL基因?qū)γ谌橄嚓P基因表達的影響
提取產(chǎn)仔第十天的母鼠的乳腺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，用去離子水稀釋到lOOng/μΙ左右，作為實時定量的模板。檢測引物乳脂合成相關基因——乙酰輔酶A羧化酶ACACA的上游引物5’ -GAGGAGAACATCAAATACATCAG-3’，下游引物 5，-ATCCTTACAACTTCT GCTCG-3，；乳糖合成相關基因——β -1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶B4galtl 的上游引物5，-CGGCATTCAAGAGACAAGA-3，，下游引物5，-CGCATCGTTTCCTTTGTA-3，； 乳蛋白相關基因——β酪蛋白CSN2的上游引物5，-TAGCACCCTTCCTTCCAC-3，，下游引物5，-GTACATTTCCAGTTTCAGTCAG-3，；PRL 的上游引物5，-GCTGCCATACCTCCTCC, 下游引物5，-GGTGACTAGGTGATACAGAGG-3，；內(nèi)參基因β-actin的上游引物 5，-CATCCGTAAAGACCTCTATGC-3，，下游引物 5，-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，。擴增條件 95°C,20sec ；60°C,20sec ；72°C,30sec ；共40個循環(huán)。實驗結(jié)果表明(見圖8，小鼠分為四組第一組為奶水中檢測到PRL蛋白，紫外燈下見綠色熒光，尾尖組織基因組檢測PRL與 EGFP基因為陽性的轉(zhuǎn)PRL基因小鼠；第二組為奶水中未檢測到PRL蛋白，紫外燈下見綠色熒光，尾尖組織基因組檢測PRL與EGFP基因為陽性的轉(zhuǎn)PRL基因小鼠；第三組為奶水中未檢測到PRL蛋白，紫外燈下未見綠色熒光，尾尖組織基因組檢測PRL與EGFP基因為陽性的轉(zhuǎn)PRL基因小鼠；第四組為非轉(zhuǎn)基因小鼠。取以上四組泌乳第10天母鼠乳腺，QRT-PCR檢測 ACACA、B4galtl、CSN2、PRL基因的表達水平，結(jié)果顯示PRL基因表達的小鼠乳腺中B4galtl 和CSN2基因的表達水平較其他組顯著提高，其中CSN2基因的表達水平極顯著提高)，與對照組相比，水牛PRL基因的表達顯著提高了乳糖合成相關基因和乳蛋白中β酪蛋白基因的表達水平，而對乳脂相關基因的表達無顯著影響。
權利要求
1.一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體，其特征在于該載體是載體一 pMDIST-BCN-PRL/Hi s-BCNpo IyA-Cmv-EGFP-SV4OpolyA,或載體二 pMD18T-BCN-raL/His-BCNpolyA-EF32l-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA。
2.根據(jù)權利要求1所述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于主要包括以下步驟<1>提取水牛垂體總mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，采用特異性引物進行PCR擴增得到全長水牛PRL的cDNA序列，經(jīng)膠回收純化PCR產(chǎn)物后，將其TA克隆插入到pMD18T載體中，得到 PMD18T-PRL 載體；<2>以步驟<1>中得到的載體為模板，用加有酶切位點和His標簽的引物進行PCR擴增，得到水牛PRL基因的CDS片段，并將其TA克隆到pMD18T載體中，得到pMD18T_PRL/His 載體；<3> 以 pMD18T 為載體骨架，依次酶切連入 Kpnl-BCNpolyA-SacI、BamHI-raL/His-KpnI、 SalI-NotI-BCN-BamHI、SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI 或 SalI-EF321-EGFP-IRES-NE0_S V40polyA-NotI四個片段，得到所述載體一或載體二。
3.根據(jù)權利要求2所述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于 步驟<1>所述引物為上游引物5，-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，，下游引物5，-GGGGTACCGATT TTGACATCGCTACAGAGT-3 ‘；步驟 <2> 所述引物為上游引物 5，-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGG TTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，，下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。
4.根據(jù)權利要求1所述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物中的應用。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于采用原核注射法，將所述載體一或載體二轉(zhuǎn)移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠或水牛。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于Aall和PvuI酶切所述載體一，回收片段溶于TE溶液中，線性化載體質(zhì)粒經(jīng)稀釋后注入到小鼠的受精卵原核中，再將受精卵移植入同期發(fā)情的代孕母鼠的輸卵管處，待產(chǎn)出子鼠，經(jīng)鑒定得到所述轉(zhuǎn)基因小鼠。
7.根據(jù)權利要求4所述轉(zhuǎn)基因動物在生產(chǎn)水牛PRL蛋白中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體、構(gòu)建及其應用，利用β-酪蛋白啟動子啟動水牛PRL基因，構(gòu)建了乳腺特異性表達水牛PRL基因載體，并將該載體轉(zhuǎn)入動物基因組中獲得乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，其乳汁特異性表達水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表達可以顯著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1,4-半乳糖甘轉(zhuǎn)移酶的表達水平。因此，應用本發(fā)明可望通過轉(zhuǎn)PRL水牛的制備，獲得有大量廉價的的PRL蛋白，并提高水牛的產(chǎn)奶量和乳液中的酪蛋白水平，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C07K14/575GK102492722SQ20111040087
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月6日
發(fā)明者任艷萍, 劉慶友, 李湘萍, 石德順, 陸鳳花 申請人:廣西大學