專利名稱：自然偶聯(lián)法制備艾塞那肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽藥物的制備方法，尤其涉及自然偶聯(lián)法制備艾塞那肽的方法。
背景技術(shù)：
艾塞那肽，英文名為exenatide，其分子結(jié)構(gòu)為 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-S er-Asp-Leu-Ser-LyS-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Ly s-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽是由美國禮來公司與Amylin公司共同研發(fā)的第一個腸降血糖素類似物，是人工合成的由39個氨基酸組成的多肽，與內(nèi)源性腸降血糖素如胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)作用相似，具有促進葡萄糖依賴的胰島素分泌，恢復(fù)第一時相胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，減慢胃內(nèi)容物的排空，改善胰腺β細胞的功能等作用。現(xiàn)有技術(shù)US69M^4、US7157555、US6902744中，艾塞那肽的制備均采用固相合成的方法。此種方法由于艾塞那肽是含有39個氨基酸的長肽，存在技術(shù)難度大、合成周期長、 生產(chǎn)成本高、過程中間體因為不能純化帶來的產(chǎn)物純度不高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)等問題。W02011006644A2專利中報道了采用固液結(jié)合的方法進行艾塞那肽的合成。將艾塞那肽分為1-10、11-21、22-四、30-39四個片段，固相方法分別合成出每個全保護肽片段，然后將幾個片段在液相中偶聯(lián)得到艾塞那肽。這種方法由于每個片段都是全保護肽，因此存在疏水性強、肽鏈溶解性差、片段純化困難、片段間偶聯(lián)效率低下等問題。艾塞那肽的現(xiàn)有合成方法存在操作繁瑣，合成周期長，廢液多，不利于環(huán)保，成本高昂以及不利于大規(guī)模生產(chǎn)的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
1)將艾塞那肽分成M條肽片段，M = 2或3 ；其中有L條N端為Thr或Ser肽片段， L = 1或2，T條構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段，L+T = M ；用固相合成方法獲得所述的M 條側(cè)鏈全保護的肽片段；2)將偶聯(lián)于步驟1) N端為Thr或kr肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)； 脫除側(cè)鏈保護基團，形成肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)；3)脫除N端為Thr或Ser肽片段的側(cè)鏈保護基團和N段保護基團，得N端為Thr 或Ser肽片段；4)利用步驟2)所述的肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)以及步驟3)所述的N端為Thr或 Ser肽片段在液相中偶聯(lián)得到N端保護的艾塞那肽；5)除去N端氨基保護基，純化處理得艾塞那肽。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟1)所述固相合成方法，所使用的樹脂為氨基樹脂或2-CTC樹脂，其中氨基樹脂適用于含有艾塞那肽C端酰胺結(jié)構(gòu)的固相合成，氨基樹脂包括 Sieber 樹脂、Rink Amide 樹脂或 Rink Amide-MBHA 樹脂。
2-CTC樹脂適用于C端為羧基結(jié)構(gòu)的肽片段固相合成。在片段肽合成過程中需要在弱酸情況下將肽鏈片段從樹脂裂解下來而不影響氨基酸側(cè)鏈保護基團。而這些側(cè)鏈保護基團在C端的羧基結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為乙縮醛結(jié)構(gòu)以前是必須存在的，用來保證乙酸醛結(jié)構(gòu)產(chǎn)生在C端羧基而不是在側(cè)鏈羧基上。申請人意外的發(fā)現(xiàn)， 2-CTC樹脂能夠滿足該合成反應(yīng)的要求。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟1)中，參與片段偶聯(lián)的Thr或Ser使用氨基保護基團，氨基保護基團為Boc。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟將1)中，將肽片段從樹脂上裂解下來所用的弱酸為TFE。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟2)中，肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)，所使用的醛為水楊醛。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟2)包括如下步驟2a)將偶聯(lián)于步驟1)N端為Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)； 其中，肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)，所使用的醛為水楊醛。2b)采用酸裂解將所有片段的側(cè)鏈保護基脫除，形成側(cè)鏈未保護肽片段。其中，將保護基脫除的酸為TFA。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟4)中，在液相中偶聯(lián)得到N端保護的艾塞那肽，溶劑為吡啶/醋酸。本發(fā)明中M條肽片段選自以下肽片段結(jié)構(gòu)SEQ ID No. 1 =His-Gly-Glu-Gly-OHSEQ ID No. 2 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-V al-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 3 =Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 4=His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-OHSEQ ID No. 5 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-L eu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No6 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va I-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 7 =Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 8 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-OHSEQ ID No. 9 :Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 10 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 11 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OHSEQ ID No. 12 =Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 13 =Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OH
SEQ ID No. 14=Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 15 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-N H2SEQ ID No. 16 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH20作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟5)中，除去N端氨基保護基，純化處理得艾塞那肽；N端氨基保護基為Fmoc，采用DBLK脫除，所述DBLK由體積比為1 4的哌啶和DMF 組成。純化處理為本領(lǐng)域常用的技術(shù)手段，必要時可以包括凍干?，F(xiàn)有技術(shù)多肽液相片段偶聯(lián)時，由于合成時選擇性的問題，肽鏈片段的氨基酸側(cè)鏈必須保護以防止偶聯(lián)位點出現(xiàn)差錯。由于片段的氨基酸側(cè)鏈是需要保護的，肽片段溶解度很低；如果側(cè)鏈不保護進行合成，必須是肽鏈含有Cys這個偶聯(lián)位點，由于含有Cys的肽鏈相對較少，限制了技術(shù)的使用。艾塞那肽肽鏈中含有多fkr/Thr，本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，采用N端含有Ser或Thr的肽鏈可以在不保護側(cè)鏈的情況下選擇性的進行片段偶聯(lián)，乙縮醛結(jié)構(gòu)主要的作用在于保證片段偶聯(lián)時的選擇性。進行側(cè)鏈不保護合成的優(yōu)點在于，解決了片段的溶解、純化等問題，提高了收率。并且對偶聯(lián)時的效率有了極大的提高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是操作簡單，合成周期短，成本低，中間體易純化，后處理容易，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，最終產(chǎn)品純度高，利于艾塞那肽的大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1 本發(fā)明總的工藝流程圖
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。氨基樹脂和2-CTC樹脂購自天津南開和成有限公司，各種保護氨基酸購自吉爾生化有限公司。說明書和權(quán)利要求書中所使用英文縮寫的含義列于下表中說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列于下表中
權(quán)利要求
1.一種艾塞那肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將艾塞那肽分成M條肽片段，M=2或3；其中有L條N端為Thr或Ser肽片段，L=I或 2，T條構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段，L+T=M ；用固相合成方法獲得所述的M條側(cè)鏈全保護的肽片段；2)將偶聯(lián)于步驟1)N端為Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)；脫除側(cè)鏈保護基團，形成肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)；3)脫除N端為Thr或Ser肽片段的側(cè)鏈保護基團和N段保護基團，得N端為Thr或kr 肽片段；4)利用步驟2)所述的肽片段C端乙縮醛結(jié)構(gòu)以及步驟3)所述的N端為Thr或Ser肽片段在液相中偶聯(lián)得到N端氨基保護的艾塞那肽；5)除去N端氨基保護基，純化處理得艾塞那肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述固相合成方法，所使用的樹脂為氨基樹脂或2-CTC樹脂，其中氨基樹脂適用于含有艾塞那肽C端酰胺結(jié)構(gòu)的固相合成，2-CTC樹脂適用于C端為羧基結(jié)構(gòu)的肽片段固相合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于氨基樹脂包括Sieber樹脂、Rink Amide 樹脂或 Rink Amide-MBHA 樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于參與片段偶聯(lián)的Thr或Ser使用氨基保護基團，氨基保護基團為Boc。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)，所使用的醛為水楊醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟5)所述N端氨基保護基為 Fmoc，脫除試劑為DBLK。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于M條肽片段選自以下肽片段結(jié)構(gòu) SEQ ID No. 1 =His-Gly-Glu-Gly-OHSEQ ID No. 2 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-A rg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OH SEQ ID No. 3 =Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID No. 4 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-OHSEQ ID No. 5 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No6 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ar g-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OH SEQ ID No. 7 =Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID No. 8 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-OHSEQ ID No. 9 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-I Ie-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 10 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 11 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OHSEQ ID No. 12 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 13 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 14 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 15 Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 16 :Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 O
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的制備方法，其特征在于N端為Thr或Ser肽片段為SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 12，構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段SEQ ID No. 11。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種制備艾塞那肽的方法，包括以下步驟1)將艾塞那肽分成若干條肽片段，其中有N端為Thr或Ser肽片段以及構(gòu)成艾塞那肽所需的其他肽片段，用固相合成方法獲得；2)將偶聯(lián)于步驟1)N端為Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙縮醛結(jié)構(gòu)；脫除側(cè)鏈保護基團；3)脫除N端為Thr或Ser肽片段的側(cè)鏈保護基團和N段保護基團；4)利用步驟2)所述的肽片段以及步驟3)所述肽片段在液相中偶聯(lián)得到N端保護的艾塞那肽；5)除去N端氨基保護基，純化處理得艾塞那肽；該工藝具有反應(yīng)操作簡單、中間體可控、反應(yīng)周期短、收率高、成本低等特點，具有可觀的經(jīng)濟實用價值和廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C07K1/06GK102532302SQ201110396050
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者劉建, 唐洋明, 宓鵬程, 袁建成, 馬亞平 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司