專利名稱：組織因子途徑抑制物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)是一種天然抗 凝蛋白，能夠抑制組織因子(tissue factor, TF)介導(dǎo)的凝血激活。TFPI的作用機(jī)制在于 它能與)(a因子形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物TFPI-Xa，從而使失活。TFPI-Xa還能夠抑制TF 與VIIa因子的復(fù)合物，從而阻礙)(a的產(chǎn)生。TFPI包括兩種類型，即TFPI-I和TFPI-2，二 者均有抑制凝血作用。研究表明，人類TFPI-I參與天然免疫以及炎癥反應(yīng)過程，TFPI-2則 具有絲氨酸蛋白酶抑制因子活性并且在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。最近動(dòng)物 模型研究發(fā)現(xiàn)，純化的重組人類TFPI-I能夠緩解人工感染引起的敗血癥癥狀，但其具體機(jī) 制尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供組織因子途徑抑制物TFPI及其制備和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種組織因子途徑抑制物組織因子途徑抑制物TFPI-I如序列表SEQID No. 1中 氨基酸序列所示；組織因子途徑抑制物TFPI-2如序列表SEQ IDNo. 2中氨基酸序列所示。組織因子途徑抑制物的構(gòu)建方法1)質(zhì)粒 pE15TFPIl 的構(gòu)建以美國(guó)紅魚cDNA為模板，用引物TPlFl和TPlRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后 與載體pBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為 質(zhì)粒 pBSTPl ；將上述質(zhì)粒pBSTPl和質(zhì)粒pET259分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV和SwaI酶切后回 收0. 78kb和5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn) 化子提取質(zhì)粒，即為PE15TFPI1 ；2)質(zhì)粒 PE15TFPI2 的構(gòu)建以美國(guó)紅魚cDNA為模板，用引物TP2F1和TP2R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后 與載體pBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為 質(zhì)粒 pBSTP2 ；將上述質(zhì)粒pBSTP2和質(zhì)粒pET259分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV和SwaI酶切后回 收0. 6kb和5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn) 化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE15TFPI2 ；3)組織因子途徑抑制物TFPI-I和TFPI-2的制備將上述步驟1)和2~)的質(zhì)粒pE15TFPIl和pE15TFPI2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選轉(zhuǎn)化子即為 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI2。將 BL21/pE15TFPIl 和BL21/pE15TFPI分別于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37 °C培養(yǎng)0D600為0. 6，并加 入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，再以37°C繼續(xù)培養(yǎng)4_5小時(shí)，而后用 nickel-nitrilotriaceticacid親和層析柱純化重組蛋白，即分別為序列表SEQ ID No. 1中 氨基酸序列所示的組織因子途徑抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示的 組織因子途徑抑制物TFPI-2。所述步驟1)中弓I 物TPlFl和TPlRl分另Ij % TPlFl 5，-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3’ 和 TP1R15，-GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3，。所述步驟2)中引物 TP2F1 和 TP2R1 分別為 TP2F15，-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTG T-3，和 TP2R1 5， -GATATCAGCCTGCAAGAAAGTGATG-3，。組織因子途徑抑制物的應(yīng)用所述序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列組織因子途 徑抑制物TFPI-I和序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列組織因子途徑抑制物TFPI-2可作為 魚類細(xì)菌的殺菌劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可以穩(wěn)定高效地表達(dá)TFPI。2.高效抑菌作用。本發(fā)明的TFPI可以有效裂解多種致病菌，從而抑制細(xì)菌感染。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例純化得到的TFPI-I電泳圖譜，(其中純化得到的TFPI-I為 泳道2，泳道1為分子量marker。)。圖2.本發(fā)明實(shí)施例純化得到的TFPI-I電泳圖譜，(其中純化得到的TFPI-2為泳 道2,泳道1為分子量marker。)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。實(shí)施例1組織因子途徑抑制物TFPI-I如序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示；組織因子 途徑抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。序列表SEQ ID No. 1 為:MAPVKWWILCAVLLCCVPRFGSCRRDRQADGPLPELFIFNELCALKDEPGPCKAIKDRFFFNVDTGHCE LFEYGGCGGNA
NNFETLEDCEETCVVSDNKNPCHLAEAPGPCRGLVTRYFFDSGSQQCKHFYYGGCFGNANNFKSMAECQ AKCQNPENPTKAPEVHTQPAGKSNVVQPTILTGEMTVSEPQVQTNETHKNPKVLRPTELCFDPVDRGTCQGSEKRFAYNP ITKRCHAFSYSGCGGNRNNFAYRKDCMIKCRRRKVHGPMIRIRKKNLDNILHRSI(a)序列特征 長(zhǎng)度284 類型氨基酸序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源美國(guó)紅魚結(jié)構(gòu)特征該蛋白的最明顯結(jié)構(gòu)特征是含有3個(gè)Kimitz結(jié)構(gòu)，分別由氨基酸 41-94，100-153，以及 207-260 構(gòu)成。序列表SEQ ID No. 2 為:MEFCTLTLVALFSTFYNVLALSPKGVCLLQVDEGPCRGEIERYYYNTITQKCEIFYYGGCQGNANNFKS YQECQKTCFRIPKIPQICRFPKEEGPCRALLHRYFF匪TTMQCESFSYGGCQGNMNRFQDLTSCMEYCSPRKTVPVLCLD PLDKGRCSASIPRYYYNTATKMCEEFIYSGCGGSSNNFVSRQSCMDVCVKGGKKYKRQGKGHRMRRYRNNHITFLQA(a)序列特征 長(zhǎng)度2 類型氨基酸序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型蛋白質(zhì)(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源美國(guó)紅魚結(jié)構(gòu)特征該蛋白的最明顯結(jié)構(gòu)特征是含有3個(gè)Kimitz結(jié)構(gòu)，分別由氨基酸 25-78,85-138,以及 145-198 構(gòu)成。實(shí)施例2組織因子途徑抑制物TFPI-I和TFPI-2的制備方法1)質(zhì)粒 pE15TFPIl 的構(gòu)建以美國(guó)紅魚cDNA為模板，用引物TPlFl和TPlRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94°C 60s 預(yù)變性模板 DNA，然后 94°C 40s, 52°C 60s, 72°C 60s，5 個(gè)循環(huán)后改為 94°C 40s, 58°C 60s, 72°C 608，25個(gè)循環(huán)后再在721延伸反應(yīng)7-101^11。PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS_T (購(gòu)于“天根生化科技(北京)有限公司”)于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后 在含100ug/ml安卡青霉素、40ug/ml Xgal、異丙基-β _D_硫代半乳糖苷Q^g/ml)的LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)18- 小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSTPl。將上述質(zhì)粒pBSTPl和質(zhì)粒pET259 (質(zhì)粒pET259的構(gòu)建過程參見Zheng， W. J. , Hu, Y. H. , Sun, L. ,2010. Cloning and analysis of a ferritinsubunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28 (5-6), 829 836.)分另ll用限 制性內(nèi)切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0. 78kb和5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶 連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18- 小時(shí)，篩 選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為PE15TFPI1。所述引物TPlFl 和 TPlRl 分別為TP1F1 為 5，-GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA-3，， TPlRl 為 5’ -GATATCGATGGAGCGATGAAGAAT-3，。2)質(zhì)粒 pE15TFPI2 的構(gòu)建以美國(guó)紅魚cDNA為模板，用引物TP2F1和TP2R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件與步驟 1)相同。PCR產(chǎn)物純化后與載體pBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后 在含100ug/ml的安卡青霉素、40ug/ml的Xgal、2^g/ml的異丙基- β _D_硫代半乳糖苷) 的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18- 小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSTP2。將上述質(zhì)粒pBSTP2和質(zhì)粒pET259 (質(zhì)粒pET259的構(gòu)建過程參見Zheng， W. J. , Hu, Y. H. , Sun, L. ,2010. Cloning and analysis of a ferritinsubunit from turbot (Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28 (5-6), 829 836.)分另ll用限 制性內(nèi)切酶EcoRV和SwaI酶切后回收0. 6kb和5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連 接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18- 小時(shí)，篩選 轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE15TFPI2。所述引物TP2F1 為 5，-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3，，TP2R1 為 5，-GATATCAGC CTGCAAGAAAGTGATG-3’。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97. 5%蒸餾水。3)組織因子途徑抑制物TFPI-I和TFPI-2的表達(dá)和制備將步驟1)和2)的質(zhì)粒pE15TFPIl和pE15TFPI2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購(gòu) 于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含50ug/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩 選轉(zhuǎn)化子即為 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI2。將 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI 分別于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)至0D_為0. 6，加入異丙基- β -D-硫代半 乳糖苷使培養(yǎng)基中異丙基-β -D-硫代半乳糖苷終濃度達(dá)到ImM，37°C繼續(xù)搖動(dòng)培養(yǎng)4_5小 時(shí)，而后用GE Healthcare (美國(guó))公司的nickel-nitrilotriacetic acid親和層析柱純 化重組蛋白(層析條件用4-5ml Wash buffer洗柱兩次，隨后用0. 5_lml Elution buffer 洗柱，收集所有洗脫液)。將洗脫液中的重組蛋白進(jìn)行N-端氨基酸測(cè)序，證實(shí)其分別為序列 表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的組織因子途徑抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No. 2中 氨基酸序列所示的組織因子途徑抑制物TFPI-2。上述Wash buffer 成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8. 0 ； 上述 Elution buffer 成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mMimidazole, pH 8. 0.
實(shí)施例3組織因子途徑抑制物TFPI-I和TFPI-2的應(yīng)用1)遲緩愛德華氏菌制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)遲緩愛德華氏菌TXl (保存于CGMCC， 編號(hào)為CGMCC No. 2330)至OD600為0. 5，然后離心(5000g，4°C ) IOmin0收集菌體，將其懸浮 于PBS中至終濃度為lxl05cfu/ml。所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO402)組織因子途徑抑制物TFPI-I和TFPI-2殺菌效應(yīng)。將20ul上述步驟1)的菌液 分別與0. 5uM實(shí)施例2制備的TFPI-I、TFPI-2和PBS (對(duì)照)混合，于25°C保溫3_5h。隨 后將混合液涂布于LB固體平板，培養(yǎng)32-4他。菌落計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與PBS相比，TFPI-I和 TFPI-2處理導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)目減低約90%，即約90%的細(xì)菌被TFPI-I和TFPI-2殺死。另將上述實(shí)施例2制備的TFPI-I和TFPI-2處理鰻弧菌，處理過程按照上述操作， 與PBS相比，TFPI-I和TFPI-2處理導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)目減低約90%，即約90%的細(xì)菌被TFPI-I 和TFPI-2殺死。因此，TFPI-I和TFPI-2具有良好的殺菌效應(yīng)，可防止魚類細(xì)菌性病害，既 可作為魚類細(xì)菌的殺菌劑。
權(quán)利要求
1.一種組織因子途徑抑制物，其特征在于組織因子途徑抑制物TFPI-I如序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示；組織因子途徑抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No. 2中氨基酸 序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的組織因子途徑抑制物的構(gòu)建方法，其特征在于1)質(zhì)粒pE15TFPIl的構(gòu)建以美國(guó)紅魚cDNA為模板，用引物TPlFl和TPlRl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與載 體pBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 pBSTPl ；將上述質(zhì)粒PBSTPl和質(zhì)粒pET259分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV和SwaI酶切后回收 0. 78kb和5. 4kb片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化 子提取質(zhì)粒，即為PE15TFPI1 ；2)質(zhì)粒pE15TFPI2的構(gòu)建以美國(guó)紅魚cDNA為模板，用引物TP2F1和TP2R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與載 體pBS-T于室溫連接2-8小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒 PBSTP2 ；將上述質(zhì)粒PBSTP2和質(zhì)粒pET259分別用限制性內(nèi)切酶EcoRV和Swa I酶切后回收 0. 61Λ和5. 41Λ片段，將這二片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選轉(zhuǎn)化子 提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒PE15TFPI2 ；3)組織因子途徑抑制物TFPI-I和TFPI-2的制備將上述步驟1)和2、的質(zhì)粒pE15TFPIl和pE15TFPI2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，篩 選轉(zhuǎn)化子即為 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI2。將 BL21/pE15TFPIl 和 BL21/pE15TFPI 分別于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)0D_為0. 6，并加入終濃度為ImM的異丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，再以37°C繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時(shí)，而后用nickel-nitrilotriacetic acid親和層析柱純化重組蛋白，即分別為序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列所示的組織 因子途徑抑制物TFPI-1，序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示的組織因子途徑抑制物 TFPI-2。
3.按權(quán)利要求2所述的組織因子途徑抑制物的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟1)中 弓I物 TPlFl 禾口 TPlRl 分另Ij為 TPlFl :5’ 一GATATCAGAAGAGACAGACAAGCA—3’ 禾口 TP1R15’ -GATAT CGATGGAGCGATGAAGAAT-3‘。
4.按權(quán)利要求2所述的組織因子途徑抑制物的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟2)中 引物 TP2F1 和 TP2R1 分別為 TP2F15，-GATATCTTGTCACCTAAAGGCGTGT-3，TP2R1 5，-GATATCA GCCTGCAAGAAAGTGATG-3’。
5.一種權(quán)利要求1所述的組織因子途徑抑制物的應(yīng)用，其特征在于所述序列表SEQ ID No. 1中氨基酸序列組織因子途徑抑制物TFPI-I和序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列組 織因子途徑抑制物TFPI-2可作為魚類細(xì)菌的殺菌劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子微生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是組織因子途徑抑制物及其制備和應(yīng)用。組織因子途徑抑制物TFPI-1如序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列所示；組織因子途徑抑制物TFPI-2如序列表SEQ ID No.2中氨基酸序列所示。其制備方法將質(zhì)粒pE15TFPI1和pE15TFPI2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得BL21/pE15TFPI1和BL21/pE15TFPI2，將其用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后通過親和層析純化重組蛋白，即為TFPI-1和TFPI-2。所述組織因子途徑抑制物具有高效殺菌作用，因此可以抵抗細(xì)菌感染，用于疾病防治。本發(fā)明的TFPI可以有效裂解多種致病菌，從而抑制細(xì)菌感染。
文檔編號(hào)C07K14/435GK102070711SQ20101054492
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者孫黎, 張敏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所