百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Aux/IAA1及其編碼基因和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白及其編碼基因和探針，具體涉及一種 百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Aux/IAAl及其編碼基因和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)源激素對觀賞植物生長發(fā)育及觀賞性狀調(diào)控具有重要的作用，生長素在植物體 內(nèi)是唯一一種具有極性運輸特征的內(nèi)源激素。生長素的含量與分布關(guān)系到植株的生長與發(fā) 育速度及各器官組織的極性結(jié)構(gòu)與空間形態(tài)。生長素的信號傳導途徑目前研宄的較為清 楚，其中Aux/IAA是重要的生長素轉(zhuǎn)錄抑制因子，當它與生長素結(jié)合時會抑制生長素的轉(zhuǎn) 錄，降低生長素含量。
[0003] 體細胞胚胎發(fā)生（體胚）是植物分子育種與離體快繁最有效的技術(shù)體系，已有研 宄表明植物體胚誘導主要依賴于外源生長素調(diào)控，且外源生長素類物質(zhì)毒莠定對單子葉球 根花丼體胚誘導具特效性。百子蓮為熱帶多年生花丼，花量大、花期長、觀賞價值高，具有地 下塊莖組織。我們前期建立的百子蓮體胚體系表明生長素信號對百子蓮體胚誘導、體胚形 態(tài)、體胚數(shù)量與體胚成苗具有決定性作用。另外，應用外源調(diào)控物質(zhì)打斷生長素極性運輸對 百子蓮花期、植株矮化、花序形態(tài)均有明顯的調(diào)控作用。因此，生長素信號對花丼產(chǎn)業(yè)化生 產(chǎn)與育種改良工作具有至關(guān)重要的作用。
[0004] Aux/IAA的編碼基因已從多種植物中克隆出來，包括：擬南芥、水稻、玉米、葡萄、 蓖麻等。但對于觀賞植物，尤其是球根花丼中，Aux/IAA的克隆、表達模式及蛋白序列尚不 清楚。目前，未有任何與百子蓮Aux/IAAl蛋白及其編碼基因序列相關(guān)的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補百子蓮Aux/IAAl基因的克隆、表達模式分析以及百子蓮 Aux/IAAl蛋白的空白，提供一種百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Aux/IAAl，本發(fā)明還提 供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針；本發(fā)明公開了百子 蓮Aux/IAAl基因轉(zhuǎn)化擬南芥后的生理效應及表達模式，為今后利用基因工程技術(shù)對Aux/ IAAl基因表達的時空特性進行調(diào)控，從而為體胚發(fā)生、株型調(diào)控提供了理論依據(jù)，具有很大 的應用價值。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、 缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白特征的蛋白質(zhì)。
[0007] 優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經(jīng)過1~50個氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
[0008] 進一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中1~10個氨基酸被 性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0009] 第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。
[0010] 優(yōu)選的，所述核酸序列具體為：(a)堿基序列如SEQ ID NO. 3第1~693位所示； 或（b)與SEQ ID NO. 3第1~693位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c)能與 SEQ ID NO. 3第1~693位所示的核酸進行雜交的序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID NO. 3第1~693位所示的核酸序列中1~ 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在Y和/或:V端添加60個以內(nèi)核苷酸形成的 序列。
[0012] 第三方面，本發(fā)明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述 核酸序列8~100個連續(xù)核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼百子 蓮Aux/IAAl相關(guān)的核酸分子。
[0013] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位 于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開， 而且已經(jīng)與在細胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語"百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Aux/IAAl蛋白編碼序列"指 編碼具有百子蓮Aux/IAAl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示的第1~693 位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 3所示的第1~693位核苷 酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于 密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 3所示的第1~693位核苷酸序列同源性低至約70% 的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 4所示的序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO. 3所示的核 苷酸序列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0015] 該術(shù)語還包括能編碼天然百子蓮Aux/IAAl蛋白的相同功能、SEQ ID NO. 3所示序 列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~90個核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在Y和/或:V端添加為60個以內(nèi)核苷酸。
[0016] 在本發(fā)明中，術(shù)語"百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Aux/IAAl"指具有百子蓮 Aux/IAAl蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然百子蓮Aux/ IAAl蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 4序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）： 通常為1~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或 為20個以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會 改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改 變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括百子蓮Aux/IAAl蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0017] 本發(fā)明的百子蓮生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Aux/IAAl的變異形式包括：同源序列、 保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與百子蓮 Aux/IAAl相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用百子蓮Aux/IAAl蛋白的抗血清獲得 的多肽或蛋白。
[0018] 在本發(fā)明中，"百子蓮Aux/IAAl保守性變異多肽"指與SEQ ID NO. 4所示的氨基酸 序列相比，有至多10個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性 變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
[0019] 表 1
[0020]
[0021] 發(fā)明還包括百子蓮Aux/IAAl蛋白或多肽的類似物。這些類似物與百子蓮Aux/ IAAl相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差 異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技 術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分 子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似 物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的類似物。應理解，本發(fā) 明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。
[0022] 修飾（通常不改變一級結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶（如哺乳動 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0023] 在本發(fā)明中，可用實時熒光定量PCR的方法分析百子蓮Aux/IAAl基因在擬南芥中 的生理效應及表達模式，即分析百子蓮Aux/IAAl基因編碼的蛋白功能。
[0024] 本發(fā)明檢測樣品中是否存在百子蓮Aux/IAAl相關(guān)核苷酸序列的檢測方法，包括 用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。該樣品是PCR擴增后的產(chǎn) 物，其中PCR擴增引物對應于百子蓮Aux/IAAl相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列 的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15~50個核苷酸。
[0025] 此外，根據(jù)本發(fā)明的百子蓮Aux/IAAl核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源 性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選百子蓮Aux/IAAl相關(guān)同源基因或同源蛋白。
[0026] 為了得到與百子蓮Aux/IAAl