專利名稱：一種無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,涉及一種可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotentstem cell，簡稱iPS細(xì)胞)，具體涉及一種無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(豬iPS細(xì)胞)及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(ES)是哺乳動物囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)通過體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，其特性為無限增殖和發(fā)育全能性。胚胎干細(xì)胞對于生命科學(xué)研究具有十分重要的意義，其應(yīng)用前景十分廣闊(I)細(xì)胞移植治療，ES細(xì)胞在體外能夠無限擴(kuò)增并發(fā)育成為各種成體細(xì)胞，因此ES細(xì)胞是細(xì)胞 移植治療的重要細(xì)胞來源，例如ES細(xì)胞分化成為胰島細(xì)胞治療一型糖尿?。?2)研究人類疾病的細(xì)胞模型，ES細(xì)胞可以分化成為前體神經(jīng)細(xì)胞，可以用于研究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制；(3)對ES細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，通過同源重組可以對ES細(xì)胞中特定的基因進(jìn)行敲入或敲除，研究這些特定基因在生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝以及生理病理過程中的功能；(4)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人類器官移植供體、建立人類疾病模型、生產(chǎn)藥用蛋白等。雖然ES細(xì)胞具有十分重要的應(yīng)用價值，但是目前人們僅從小鼠、恒河猴、人和大鼠四個物種中建立了 ES 細(xì)胞系(Evans MJ et al. 1981 ；Thomson J A et al. 1995,1998 ；Buehr M et al. 2008 ；Li P et al. 2008)。由于體外培養(yǎng)條件等因素的限制，其他哺乳動物(如豬、牛、羊等)的ES細(xì)胞系仍然沒有成功建立起來。誘導(dǎo)性多能肝細(xì)胞(iPSC)的出現(xiàn)，使人們看到了新的希望，人類體細(xì)胞導(dǎo)入四種轉(zhuǎn)錄因子基因(0ct4, Sox2和Klf4, c-Myc或Nanog, Lin28)，表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子使細(xì)胞重新編程后，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蓄愃艵S功能的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPS)。盡管iPS細(xì)胞并非百分之百的ES細(xì)胞，但iPS細(xì)胞可運用到那些使用傳統(tǒng)方法無法建立ES細(xì)胞的物種上，比如豬、牛、羊等。豬是一種重要的經(jīng)濟(jì)動物，與人類生活密切相關(guān)。其妊娠期短，平均為114天，繁殖力強(qiáng)，平均產(chǎn)仔數(shù)為10頭，后代生長快，母豬性成熟是4到5月齡，公豬在性成熟是5到6月齡。豬在解剖、組織結(jié)構(gòu)、生理和營養(yǎng)代謝等方面與人類最為接近，因此，轉(zhuǎn)基因豬在生命科學(xué)研究中具有重要的研究價值，轉(zhuǎn)基因豬可以用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人類器官移植供體、建立人類疾病模型、生產(chǎn)藥用蛋白等。2009年，三個不同的實驗室先后成功建立了豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Wu Z etal. 2009 ；Esteban MA et al. 2009 ；Ezashi T et al. 2009)。然而，這些豬 iPS 細(xì)胞內(nèi)都整合有外源基因(0ct4，Sox2和Klf4，c-Myc或Nanog，Lin28)，外源基因的存在會增加這些iPS細(xì)胞的致癌風(fēng)險，因此，構(gòu)建無外源基因整合的iPS細(xì)胞顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于，提供一種無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第二個目的在于，提供一種無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的第一個方面，提供一種無外 源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括以下步驟a)采用CreER慢病毒載體感染豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞；b)采用40H-Tamoxifen處理上一步驟得到的干細(xì)胞,所述CreER將外源因子切除掉；c)采用FACS篩選上一步驟得到的干細(xì)胞，得到所述無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述CreER慢病毒載體為Lv_ef Ia-CreER-IRESncherry,Lv-efIa-CreER-1RES-puro,或 Lv-efla-CreER-IRES-neo。根據(jù)本發(fā)明，所述豬iPS細(xì)胞內(nèi)整合有帶Ioxp的外源誘導(dǎo)因子，所述外源誘導(dǎo)因子為0ct4、Sox2、Klf4、c-Myco根據(jù)本發(fā)明，所述步驟a)的感染復(fù)數(shù)MOI < 50。根據(jù)本發(fā)明，所述40H_Tamoxifen的濃度為0. 8 I. 2uM。根據(jù)本發(fā)明，所述步驟b)中被切除的外源因子為0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc。根據(jù)本發(fā)明，所述步驟b)中的所述將外源因子切除掉是以綠色熒光蛋白EGFP不再表達(dá)為標(biāo)志。根據(jù)本發(fā)明，所述步驟c)得到的所述無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白。在本發(fā)明的第二個方面，提供由上述構(gòu)建方法構(gòu)建的無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。本發(fā)明獲得無外源誘導(dǎo)因子整合的豬iPS細(xì)胞，可以應(yīng)用于核移植克隆豬或者轉(zhuǎn)基因豬，大大降低了外源誘導(dǎo)因子尤其是c-Myc的致癌風(fēng)險。


圖I是慢病毒載體Lv-efl a -Cre的結(jié)構(gòu)圖。圖2是慢病毒載體Lv-efl a -CreER的結(jié)構(gòu)圖。圖3是慢病毒載體Lv-efl a -CreER(Nhel)的結(jié)構(gòu)圖。圖4 是慢病毒載體 Lv-efl a -CreER-1RES-mcherry 的結(jié)構(gòu)圖。圖5是Lv-efl a -CreER-IRESncherry慢病毒感染豬iPS細(xì)胞，加藥組第6天(力口A 40H-Tamoxifen后第5天)的熒光鏡檢結(jié)果。b :明場下的細(xì)胞形態(tài)；G =EGFP的表達(dá)；R mcherry的表達(dá)。圖6是Lv-efl a -CreER-IRES-mcherry慢病毒感染豬iPS細(xì)胞,對照組第6天的熒光鏡檢結(jié)果。b :明場下的細(xì)胞形態(tài)；G =EGFP的表達(dá)；R mcherry的表達(dá)。圖7是Lv-efl a -CreER-IRES-mcherry慢病毒感染豬iPS細(xì)胞，加藥組加入40H-Tamoxifen 5天后，對照組和加藥組豬iPS細(xì)胞的EGFP表達(dá)水平比較。上半部分是熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，下半部分是對應(yīng)的豬iPS細(xì)胞被消化成單細(xì)胞后進(jìn)行FACS分析的結(jié)果，Ml表示表達(dá)EGFP的細(xì)胞，M2表示不表達(dá)EGFP的細(xì)胞。表示對照組，“ + ”表示加藥組。圖8是Lv-efl a -CreER-IRES-mcherry慢病毒感染豬iPS細(xì)胞，加藥組加入40H-Tamoxifen 5天后，對照組和加藥組豬iPS細(xì)胞的EGFP表達(dá)水平柱狀圖比較。圖 9 是用 Lv_ef la-CreER-IRES-mcherry 感染豬 iPS 細(xì)胞,加入 40H_Tamoxifen 誘導(dǎo)7天后，經(jīng)過FACS分選，得到無外源誘導(dǎo)因子的豬iPS細(xì)胞(OSKC-free pig ips)和沒有切除外源因子的豬iPS細(xì)胞。FACS分選后分別鋪在兩個24孔板的兩個孔中。b :明場下的細(xì)胞形態(tài)；G EGFP的表達(dá)；R mcherry的表達(dá)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。 在本發(fā)明中，所述豬iPS細(xì)胞是這樣的干細(xì)胞，其整合有帶Ioxp的外源誘導(dǎo)因子，所述外源誘導(dǎo)因子為0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc。且外源因子0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc所在的慢病毒載體上含有可同時表達(dá)的綠色熒光蛋白EGFP。以下實施例中，用到的培養(yǎng)基有293T細(xì)胞的培養(yǎng)基(10 % D-MEM)，具體組成為89 %的D-MEM培養(yǎng)液(購自Invitrogen, 11965) ;10% 的胎牛血清(購自 Hyclone，SH30396. 03) ；lmM L-谷氨酸(購自Invitrogen, 25030) ;1*% 的非必須氨基酸(購自 Invitrogen, 11140050)。豬iPS細(xì)胞的培養(yǎng)基(ESO)，具體組成為79%的Knockout D-MEM/F12培養(yǎng)液(購自 Invitrogen, I266O) ;2O的Knockout SR(購自 Invitrogen, IO828) ；ImM L-谷氨酸(購自 Invitrogen, 25030) ;1*% 的非必須氨基酸(購自 Invitrogen, 11140050) ；0. ImMfi-疏基乙醇(購自 Sigma，M7522)。以下實施例中所使用的慢病毒原始載體Lv-efl a -IRES-EGFP購自Invitrogen公司，具有氨節(jié)抗性。以下實施例中，通用的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品均購自Invitrogen公司。實施例I、慢病毒載體Lv-efl a -Cre的構(gòu)建I. I、根據(jù) pBluescript II SK(-)-Cre (Stratagene)的序列設(shè)計 Cre 的引物,引入酶切位點，引物序列如表I所示(其中F表示正向引物，R表示反向引物)。表I引物序列
權(quán)利要求
1.一種無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 a)采用CreER慢病毒載體感染豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞； b)采用40H-Tamoxifen處理上一步驟得到的干細(xì)胞,所述CreER將外源因子切除掉； c)采用FACS篩選上一步驟得到的干細(xì)胞，得到所述無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述CreER慢病毒載體為Lv-ef la-CreER-IRES-mcherry, Lv-efIa~CreER-1RES-puro,或 Lv-efla-CreER-IRES-neo。
3.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟a)的感染復(fù)數(shù)MOI< 50。
4.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述外源因子包括0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc。
5.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述40H-Tamoxifen的濃度為0.8 I. 2uM。
6.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟b)中的所述將外源因子切除掉是以EGFP不再表達(dá)為標(biāo)志。
7.如權(quán)利要求I所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟c)得到的所述無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白。
8.一種按權(quán)利要求I 7任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及構(gòu)建方法，包括步驟A)采用CreER慢病毒載體感染豬可誘導(dǎo)多能細(xì)胞，經(jīng)4OH-Tamoxifen誘導(dǎo)，CreER可以將帶有l(wèi)oxp的外源因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc切除掉；B)通過FACS將不表達(dá)綠色熒光蛋白即無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞篩選出來。本發(fā)明獲得的無外源誘導(dǎo)因子整合的豬可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以應(yīng)用于核移植克隆豬或者轉(zhuǎn)基因豬，大大降低了外源誘導(dǎo)因子尤其是c-Myc的致癌風(fēng)險。
文檔編號C12N15/867GK102747104SQ201110100449
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者吳璐, 朱輝, 肖磊, 陳霽君 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院