專利名稱：針對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單域抗體技術(shù)(又稱為納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別 是涉及針對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DeoXynivalenol，D0N)的單域抗體或多肽。
背景技術(shù)：
單域抗體是指僅由普通抗體可變區(qū)(VH或VL)組成的基因工程抗體。單 域重鏈抗體(又稱為納米抗體，VHH抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指僅由重鏈抗體(Heavy-chain antibodies)可變區(qū)(Variable region)組成的基因工程抗體，其中，重鏈抗體(Heavy-chain antibodies)是一種存在于 駱駝、鯊魚(yú)等動(dòng)物中天然缺失輕鏈的抗體。單域抗體和單域重鏈抗體都具有分子量小、滲透 性好等特點(diǎn)，目前已廣泛用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和檢測(cè)、抗體藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名嘔吐毒素(vomitoxin，VT)，屬 于單端孢霉烯族真菌毒素，主要是由某些鐮刀菌產(chǎn)生。該毒素常出現(xiàn)于谷物及其加工產(chǎn)品 中，許多國(guó)家和地區(qū)都檢測(cè)到了 DON的污染。DON會(huì)引起動(dòng)物增重下降、食欲減退、營(yíng)養(yǎng)吸收 率降低，并影響免疫功能。大部分國(guó)家對(duì)食品、谷物、飼料中的DON含量都做了嚴(yán)格規(guī)定。目前，已有針對(duì)DON的多克隆抗體、單克隆抗體的公開(kāi)報(bào)道。與單域重鏈抗體相 比，這些抗體存在生產(chǎn)成本相對(duì)較高，制備過(guò)程繁瑣等缺點(diǎn)。單域抗體具備分子量小、滲透 性好等性質(zhì)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供針對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體(包括含有所述單域 抗體全部或部分功能區(qū)域的蛋白質(zhì)或多肽)及其氨基酸序列，可以被用于制備檢測(cè)或抑制 DON污染的試劑和工具。本發(fā)明提供一種針對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體，具有SEQ ID NO. :1所示的 氨基酸序列，其氨基酸序列的IMGT編號(hào)和結(jié)構(gòu)域的劃分如圖1所示。本發(fā)明所提供的單域抗體包括4個(gè)框架區(qū)(Framework region,FR)和三個(gè)互補(bǔ)決 定區(qū)(Complementarity-determining region，CDR)，其中，框架區(qū)(FR1-FR4)分別選自 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :4 禾P SEQ ID NO. :5，互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1-CDR3)分別 選自SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8?；パa(bǔ)決定區(qū)主要負(fù)責(zé)抗原的識(shí)別，框 架區(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，主要起著支撐維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含SEQ ID N0. :2，SEQ ID N0. :3， SEQID NO. :4和SEQ ID NO. :5中的一個(gè)或者兩個(gè)以上的氨基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸 序列具有90%同源性。本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含SEQ ID N0. :6，SEQ ID NO. :7和 SEQ ID NO. :8中的一個(gè)或者兩個(gè)以上的氨基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸序列具有80%同 源性。
本發(fā)明還提供了一種核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO. :1，SEQ ID NO. :2， SEQID NO. 3, SEQ ID NO. :4，SEQ ID NO. :5，SEQ ID NO. :6，SEQ ID NO. :7 禾口 SEQ IDN0. 8，通過(guò)遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分序列可以通過(guò)合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá) 以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì) 胞，植物細(xì)胞，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸 序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包含所述蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種凈化或檢測(cè)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法，其特征是含有上述 蛋白質(zhì)或多肽?；诒景l(fā)明提供的蛋白質(zhì)或多肽與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇特異性結(jié)合的能 力，建立脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的凈化或檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，焚光免疫法(Fluoroimmunoassay, FIA)， 免疫芯片法和親和層析法。本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過(guò)隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造， 能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來(lái)發(fā)展進(jìn)一步用 于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。例如將FR2中的V42、G49、P50和W52分別替換為F42、 E49、R50和G52，可得到具有更好的溶解性和穩(wěn)定性的重鏈抗體化突變體。本發(fā)明中所敘述的一些術(shù)語(yǔ)具有如下含義同源性描述兩個(gè)或更多氨基酸序列的相似程度，第一個(gè)氨基酸序列和第二個(gè)氨 基酸序列之間同源性的百分比可以通過(guò)第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置 處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數(shù)量除以第一個(gè)氨基酸序列中氨基酸總數(shù)再乘以100%來(lái)計(jì)算，其中第二氨基酸序列中的某個(gè)氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一 氨基酸相比)被認(rèn)為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的 計(jì)算機(jī)運(yùn)算程序如NCBI Blast獲得。結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。IMGT Ι :IMGT(The International ImMunoGeneTics Database) ψ ^ 一種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)(Ehrenmarm， F. , Q. Kaas, et al. (2010). “ IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign :a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. “ Nucleic Acids Res 38 (Database issue) :D301-307. Lefranc, M. P.， C. Pommie, et al. (2003). " IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-Iike domains. " Dev Comp Immunol 27(1) :55-77.)中的描述。密碼子(codon)又稱為三聯(lián)體密碼(triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核 苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。


圖1氨基酸編號(hào)及結(jié)構(gòu)域示意圖。
圖2間接phage-ELISA法測(cè)定噬菌體結(jié)合活性?？v坐標(biāo)表示ELISA讀數(shù)計(jì)測(cè)定 450nm處吸光度值，橫坐標(biāo)表示按照表1加樣，其中1表示實(shí)驗(yàn)組，2表示背景對(duì)照，3表示空 白對(duì)照a，4表示空白對(duì)照b。圖3噬菌粒pHEN-D0NIV2結(jié)構(gòu)圖。圖4表達(dá)質(zhì)粒pRX3-D0NIV2結(jié)構(gòu)圖。圖5親和層析純化單域抗體SDS-PAGE電泳圖。泳道M為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，泳道 1為親和層析純化前細(xì)胞破碎上清，泳道2為親和層析純化后單域抗體D0NIV2。圖6融合表達(dá)質(zhì)粒pAP-D0NIV2。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)單域抗體(多肽)的制備、分析以及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，這些 具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。應(yīng)用實(shí)例1 抗DON單域抗體的淘選與鑒定。采用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫(kù)NA-PDL中淘選針對(duì)DON的 單域抗體。參照文獻(xiàn)(鄧舜洲，游淑珠，許楊.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇人工抗原的研制[J]. 食品科學(xué)，2007，28 (2) 149-152.)制備DON的人工抗原D0N-MBSA，用PBS稀釋DON-MBSA至 50 100 μ g/mL,每孔加入100 μ L，4°C包被過(guò)夜，吸出包被液，PBS洗板3次，3% BSA-PBS在 37°C封閉2h，PBS洗板3次，加入噬菌體抗體庫(kù)100 μ L(約含2X IO11CFU)，37°C孵育1. 5h， 用PBST (含0. 5% Tween-20)洗板3次(逐輪增加1次)，再用TBS洗板10次(逐輪增加5 次)。以100 μ L洗脫液(甘氨酸-鹽酸，ρΗ 2. 2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用50 μ L Tris-HCl (lmol/L,pH 8.0)中和洗脫物，取10 μ L用于滴度測(cè)定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下 一輪淘選。經(jīng)四輪淘選后，采用輔助噬菌體ΚΜ13對(duì)隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展 示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接ELISA法測(cè)定噬菌體顆粒的結(jié)合活性(圖2)，實(shí)驗(yàn)設(shè) 定陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及背景對(duì)照，具體加樣步驟見(jiàn)表1。表1間接phage-ELISA加樣表
實(shí)驗(yàn)組 背景對(duì)照 空白對(duì)照a 空白對(duì)照b 包被 DON-MBSA BSA DON-MBSA BSA
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體，其具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)或多肽，由4個(gè)框架區(qū)和3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)組成，其中，4個(gè)框架區(qū)分別由SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :4 和 SEQ ID NO. :5 組成，3 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)分別由 SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含SEQID NO. :2，SEQ IDN0. :3， SEQ ID NO. :4和SEQ ID NO. :5中的一個(gè)或者兩個(gè)以上的氨基酸序列，且至少與一個(gè)氨基 酸序列具有90%同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或多肽，其特征是包含SEQID NO. :6，SEQ IDN0. :7和 SEQ ID NO. :8中的一個(gè)或者兩個(gè)以上的氨基酸序列，且至少與一個(gè)氨基酸序列具有80%同 源性。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的蛋白質(zhì)或多肽在DON凈化和檢測(cè)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1、2或3所述的蛋白質(zhì)或多肽在檢測(cè)和清除DON污染中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的蛋白質(zhì)或多肽，其特征是所述蛋白質(zhì)或多肽是抗體、抗 體片段或融合蛋白質(zhì)。
7.一種編碼權(quán)利要求1、2或3中所述蛋白質(zhì)或多肽的核酸。
8.一種含有權(quán)利要求7所述核酸序列的載體。
9.一種含有權(quán)利要求7所述核酸的原核或真核宿主細(xì)胞，其特征是能夠表達(dá)權(quán)利要求 1、2或3中所述的蛋白質(zhì)或多肽。
全文摘要
一種針對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的單域抗體和多肽，其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過(guò)隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來(lái)發(fā)展進(jìn)一步用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102060924SQ201010544358
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者付金衡, 何慶華, 劉夏, 涂追, 許楊, 陶勇 申請(qǐng)人:南昌大佳科技有限公司