專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼人癌胚抗原的合成基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及癌癥的治療。更為具體而言，本發(fā)明涉及編碼人腫瘤相關(guān)多肽癌胚抗原的合成多核苷酸，本文將其命名為hCEAopt，其中該多核苷酸為在人體細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。本發(fā)明也提供了包含該合成多核苷酸的重組載體和宿主。本發(fā)明也涉及攜帶有hCEAopt的腺病毒載體和質(zhì)粒，及它們?cè)谟糜陬A(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物中的用途。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(IgSF)由眾多編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)的基因組成，其中一種功能即細(xì)胞間粘附。IgSF蛋白質(zhì)含有至少一個(gè)Ig相關(guān)區(qū)域，該區(qū)域?qū)τ诰S持正常的分子間結(jié)合作用而言是重要的。由于該相互作用對(duì)于IgSF成員的不同生物學(xué)功能而言是必須的，因此多種IgSF粘附分子的破壞或異常表達(dá)與多種人類(lèi)疾病相關(guān)。
癌胚抗原(CEA)屬于由細(xì)胞表面糖蛋白組成的Ig超家族的亞家族。已知的CEA亞家族成員如CEA相關(guān)的細(xì)胞粘附分子(CEACAMs)。在最近的科學(xué)文獻(xiàn)中，CEA基因被重新命名為CEACAM5，雖然相應(yīng)蛋白質(zhì)的命名仍然為CEA。研究顯示CEACAMs在功能上同時(shí)作為同型和異型的分子間粘附分子(Benchimol等，Cell57327-334(1989))。除了細(xì)胞粘附，CEA還抑制由于細(xì)胞從胞外基質(zhì)解離而引起的細(xì)胞死亡，并有助于與某些原癌基因如Bcl2和C-Myc相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
在胚胎發(fā)育和成人結(jié)腸粘膜中已檢測(cè)到CEA的正常表達(dá)。CEA過(guò)量表達(dá)在三十多年前首先于人結(jié)腸癌中被檢測(cè)到(Gold和Freedman，J.Exp.Med.121439-462(1965))且之后幾乎發(fā)現(xiàn)于所有的結(jié)直腸癌中。此外，在高比例的胰腺、乳腺和肺部的腺癌中檢測(cè)到CEA的過(guò)量表達(dá)。由于CEA表達(dá)在這些腫瘤類(lèi)型中普遍存在，CEA被臨床廣泛地用于這些癌癥的處理和預(yù)后中。
編碼人CEA的序列已被克隆和表征(美國(guó)專(zhuān)利No.5,274,087、美國(guó)專(zhuān)利No 5,571,710和美國(guó)專(zhuān)利No 5,843,761.也參見(jiàn)Beauchemin等，Mol.Cell.Biol.73221-3230(1987)；Zimmerman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84920-924(1987)；Thompson等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(9)2965-69(1987))。
CEA表達(dá)和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的相關(guān)性已經(jīng)導(dǎo)致將其鑒定為分子和免疫干涉的目標(biāo)，用于結(jié)直腸癌的治療。
以CEA為目標(biāo)的一種治療方法即采用抗CEA抗體(參見(jiàn)Chester等.，Cancer Chemother.Pharmacol.46(Suppl)S8-S 12(2000))，而另一種方法采用基于CEA的疫苗激活免疫系統(tǒng)以攻擊表達(dá)CEA的腫瘤(參見(jiàn)上文引用的Berinstein的綜述)。
多種疫苗的研發(fā)和商業(yè)化已受阻于與在成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中獲得高水平的外源基因表達(dá)相關(guān)的難題。因此，盡管編碼上述CEA蛋白質(zhì)的野生型核酸序列已被確定，還非常需要開(kāi)發(fā)一種可方便更新的人CEA蛋白質(zhì)來(lái)源，該來(lái)源利用了被優(yōu)化用于在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的編碼CEA的核酸序列，該來(lái)源容許開(kāi)發(fā)一種有效且不受自體耐受性影響的癌癥疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及引發(fā)或增強(qiáng)針對(duì)CEA基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，所述CEA基因與多種腺癌相關(guān)，包括結(jié)直腸癌。具體而言，本發(fā)明提供了編碼人CEA蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)，對(duì)該多核苷酸進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含合成多核苷酸的基于腺病毒和質(zhì)粒的載體并公開(kāi)了該載體在用于預(yù)防和/或治療CEA相關(guān)癌癥的免疫組合物和疫苗中的用途。
本發(fā)明也涉及包含編碼如SEQ ID NO.2所示人癌胚抗原(下文中表示為hCEA)的核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，其中該合成核酸分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化(下文中表示為hCEAopt)。本文公開(kāi)的核酸分子可被轉(zhuǎn)染到選定的宿主細(xì)胞中，其中該重組宿主細(xì)胞提供了顯著水平的表達(dá)功能性hCEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)的來(lái)源。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼了表達(dá)人CEA蛋白質(zhì)的mRNA的合成核酸分子；該DNA分子包含如本文公開(kāi)的SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明該部分的優(yōu)選方面公開(kāi)在

圖1中，該圖顯示了編碼hCEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2或SEQ ID NO16)的DNA分子。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)，進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
本發(fā)明另一種優(yōu)選的DNA分子包含編碼缺失了C末端錨定區(qū)域(AD)的人CEA的核苷酸序列，該區(qū)域位于人全長(zhǎng)CEA(SEQ ID NO2)的約第679個(gè)氨基酸到約第702個(gè)氨基酸，其中該核苷酸序列為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。編碼錨定區(qū)域被截短的CEA變體的代表性DNA分子如SEQ ID NO15所示(如圖10A中所示)。相應(yīng)的hCEA-hAD的氨基酸序列如SEQ ID NO16所示(如圖10B中所示)。
本發(fā)明也涉及重組載體和真核和原核的重組宿主細(xì)胞，均包含貫穿本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的核酸分子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在重組宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包含如SEQ ID NO1或SEQ ID NO15所示核酸分子的載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中；并(b)在容許該經(jīng)密碼子優(yōu)化的蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面是一種預(yù)防和治療癌癥的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用包含合成核酸分子的疫苗載體，該合成核酸分子包含編碼如SEQ ID NO2或SEQ ID NO16所示人癌胚抗原(hCEA)蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中該合成核酸分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及腺病毒疫苗載體，該載體包含具E1區(qū)缺失和E1區(qū)的插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
本發(fā)明也涉及包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分的疫苗質(zhì)粒，該表達(dá)盒部分包含(a)編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成多核苷酸，其中該多核苷酸為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一方面是保護(hù)哺乳動(dòng)物免患癌癥或治療患CEA相關(guān)癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；(b)允許經(jīng)過(guò)一段預(yù)定時(shí)間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
貫穿本說(shuō)明書(shū)及在附錄權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式″一個(gè)″″一種″和″該″如上下文未明確指出均包括復(fù)數(shù)形式。
貫穿本說(shuō)明書(shū)及附錄的權(quán)利要求中所用的下列定義和縮寫(xiě)適用于術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指DNA鏈上RNA多聚酶結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)。啟動(dòng)子與RNA多聚酶形成起始復(fù)合物以起始并驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性。該復(fù)合物可被稱(chēng)為“增強(qiáng)子”的激活序列或稱(chēng)為“沉默子”的抑制序列所修飾。
術(shù)語(yǔ)“盒”指本發(fā)明中含有待表達(dá)核苷酸序列的序列。盒在概念上類(lèi)似盒式錄音帶；每個(gè)盒具有本身的序列。因此通過(guò)互相交換盒，載體將表達(dá)不同的序列。由于限制位點(diǎn)在5’和3’末端，盒可被方便的插入，移除或用其它盒替代。
術(shù)語(yǔ)“載體”指可將DNA片段導(dǎo)入到宿主器官或宿主組織中一些方式。目前有多種類(lèi)型的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌體和粘粒。
關(guān)于腺病毒載體所用的術(shù)語(yǔ)“第一代”描述了復(fù)制缺陷型的腺病毒載體。第一代腺病毒載體典型地具有缺失或失活的E1基因區(qū)，且優(yōu)選地具有缺失或失活的E3基因區(qū)。
名稱(chēng)“pV1J/hCEAopt”指此處公開(kāi)的質(zhì)粒構(gòu)建體，包含具內(nèi)含子A的人CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子、全長(zhǎng)的經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA基因、牛生長(zhǎng)激素來(lái)源的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列和最小pUC主鏈(參見(jiàn)實(shí)施例2)。名稱(chēng)“pV 1J/hCEA”指上述構(gòu)建體，除了該構(gòu)建體包含野生型人CEA基因而不是經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的人CEA基因。
名稱(chēng)“MRKAdS/hCEAopt”和“MRKAdS/hCEA”指此處公開(kāi)的兩種構(gòu)建體，均含有缺失了E1和E3區(qū)的Ad5腺病毒基因組。在“MRKAdS/hCEAopt”構(gòu)建體中，E1區(qū)被經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA基因以與E1并行的方向取代，且位于無(wú)內(nèi)含子A的人CMV啟動(dòng)子控制下，之后為牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)?！癕RKAdS/hCEA”構(gòu)建體基本如上所述，除了Ad5基因組的E1區(qū)被野生型人CEA序列取代(參見(jiàn)實(shí)施例2)。
術(shù)語(yǔ)“有效量”指足夠的疫苗組合物被導(dǎo)入以產(chǎn)生足夠水平的多肽，從而發(fā)生免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)可該水平會(huì)發(fā)生變化。
“保守的氨基酸取代”指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)化學(xué)上類(lèi)似的氨基酸殘基替代。這樣的保守取代的實(shí)例為一個(gè)疏水性氨基酸(異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或蛋氨酸)被另一個(gè)疏水性氨基酸取代；一個(gè)極性氨基酸被另一個(gè)具有相同電荷的極性氨基酸取代(如精氨酸被賴(lài)氨酸取代；谷氨酸被天冬氨酸取代)。
“hCEA”和“hCEAopt”分別指人癌胚抗原和經(jīng)密碼子優(yōu)化的人癌胚抗原。
術(shù)語(yǔ)“hCEA-ΔAD”指缺失了C末端錨定區(qū)域(AD)的人CEA變體，該錨定區(qū)域位于人全長(zhǎng)CEA(SEQ ID NO2)的從約第679個(gè)氨基酸到約第702個(gè)氨基酸。編碼本發(fā)明hCEA-ΔAD的核苷酸序列為在人細(xì)胞環(huán)境中高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化(此處命名為hCEAopt-ΔAD)。編碼錨定區(qū)域被截短的CEA變體的代表性DNA分子如SEQ ID NO15(如圖10A中所示)。相應(yīng)的hCEA-ΔAD的氨基酸序列如SEQ ID NO16(如圖10B中所示)。編碼hCEA-ΔAD的核苷酸可用于癌癥疫苗的開(kāi)發(fā)以治療和/或預(yù)防癌癥。
術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”指包括人類(lèi)在內(nèi)的任何哺乳動(dòng)物。
縮寫(xiě)“Ag”指抗原。
縮寫(xiě)“Ab”和“mAb”分別指抗體和單克隆抗體。
縮寫(xiě)“ORF”指基因的開(kāi)放讀碼框架。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了野生型人CEA cDNA(SEQ ID NO3)和經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化克隆(hCEAopt，SEQ ID NO1)的核苷酸序列。相應(yīng)推斷的氨基酸序列顯示在上方(SEQ ID NO2)。經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的合成cDNA的取代核苷酸顯示在hCEA cDNA序列下方。參見(jiàn)實(shí)施例2。
圖2顯示了經(jīng)注射小鼠體內(nèi)的hCEA表達(dá)。10只C57BL/6小鼠組成的實(shí)驗(yàn)組被在四頭肌注射不同劑量的MRKAdS-hCEA和MRKAd5-hCEAopt(圖A)或注射25或50毫克的pV1J/hCEA和pV1J/hCEAopt質(zhì)粒(圖B)。
注射后3天收集血液樣品并測(cè)定CEA水平。實(shí)心三角形代表個(gè)體小鼠的CEA測(cè)定結(jié)果。同時(shí)也顯示了幾何平均值(實(shí)心圓形)。
圖3顯示了密碼子優(yōu)化提高了針對(duì)人CEA的免疫反應(yīng)。8只C57BL/6小鼠組成的實(shí)驗(yàn)組被通過(guò)四頭肌注射不同劑量的MRKAd5-hCEA和MRKAd5-hCEAopt。在第0天和第21天進(jìn)行病毒注射。圖A.加強(qiáng)注射后兩周，利用覆蓋氨基酸569-583且包含CD8+表位的肽143在來(lái)源于個(gè)體小鼠的脾細(xì)胞上通過(guò)ELISPOT試驗(yàn)測(cè)定特異性針對(duì)hCEA的分泌IFNγ的CD8+T細(xì)胞的數(shù)量(實(shí)心三角形)。實(shí)驗(yàn)采用了兩種不同數(shù)量的脾細(xì)胞(2.5×105和5×105)，且每種數(shù)量的脾細(xì)胞均設(shè)兩組平行。通過(guò)扣除在不存在肽的情況下測(cè)定的背景值(通常低于10SFC/106總脾細(xì)胞)計(jì)算平均值，并將結(jié)果表示為SFC數(shù)量/106總脾細(xì)胞。個(gè)體小鼠的數(shù)值(實(shí)心三角形)及幾何平均值(實(shí)心圓形)均被顯示。圖B利用加強(qiáng)后10天的血清樣品測(cè)定個(gè)體小鼠血清的抗CEA抗體滴度(實(shí)心三角形)。同時(shí)也顯示了幾何平均滴度(GMT)(實(shí)心圓形)。Ad/hCEAopt與Ad/hCEA有顯著差異。
圖4。不同免疫方案的比較。用pV1J/hCEA質(zhì)粒(按50tg/劑量電注射到四頭肌)和MRKAd5/hCEA質(zhì)粒(1×109pp/劑量)的不同組合免疫C57BL/6(A)或BALB/c(B)小鼠實(shí)驗(yàn)組。采用如材料和方法及圖3的圖例中描述的覆蓋氨基酸497-703(合并物D)的肽合并物測(cè)定在每只個(gè)體小鼠的脾細(xì)胞中分泌IFNγ的T細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)也顯示了幾何平均值(實(shí)心圓形)。在C57BL/6小鼠中D/D和D/A與Ad/Ad組有顯著差異。在BALB/c小鼠中所有3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有顯著差異。
圖5顯示了將T細(xì)胞反應(yīng)定位到hCEA蛋白質(zhì)特定區(qū)域的結(jié)果。用50μg pV1J/hCEA質(zhì)粒免疫C57BL/6(圖A)或BALB/c(圖B)小鼠實(shí)驗(yàn)組并于三周后用1×109pp的Ad/hCEA加強(qiáng)免疫。采用如材料和方法及圖3的圖例中描述的覆蓋整個(gè)蛋白質(zhì)的肽合并物于加強(qiáng)免疫后2周測(cè)定在每只個(gè)體小鼠的脾細(xì)胞中分泌IFNγ的T細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)也顯示了幾何平均值(實(shí)心圓形)。
圖6。hCEA免疫反應(yīng)肽的確定。通過(guò)ELISPOT試驗(yàn)分析從4只經(jīng)免疫的C57BL/6(圖片A)或BALB/c(圖片B)小鼠收集的脾細(xì)胞針對(duì)每種所示肽的IFNγ分泌(參見(jiàn)實(shí)施例8)。
圖7顯示了在C57BL/6小鼠(圖片A)和BALB/c小鼠(圖片B)(參見(jiàn)實(shí)施例xx)中含表位的肽的序列。右側(cè)所列為產(chǎn)生IFNγ的CD8+(CD4+)CD3+細(xì)胞的比例。
圖8顯示了如實(shí)施例9所描述的經(jīng)免疫的CEA轉(zhuǎn)基因小鼠的IFNγ-ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果。采用每次間隔一周的4次電注射質(zhì)粒DNA，及一次腺病毒注射免疫小鼠。對(duì)每種免疫原，用三只經(jīng)注射小鼠的脾細(xì)胞收集物獲取數(shù)據(jù)。利用肽143測(cè)定CD8特異性反應(yīng)。
圖9顯示了經(jīng)免疫的CEA.tg.小鼠的IFNγ細(xì)胞內(nèi)染色結(jié)果。用每次間隔2周的2次1×1010vp腺病毒注射免疫小鼠。顯示了從三只經(jīng)注射小鼠的脾細(xì)胞收集物獲得的數(shù)據(jù)。右側(cè)所列為CD8+或CD4+細(xì)胞的比例。
圖10，圖A顯示了如SEQ ID NO15所示的代表性的編碼錨著區(qū)域被截短的CEA變體、經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的DNA分子。hCEA-ΔAD相應(yīng)的氨基酸序列如圖B(SEQ ID NO16)所示。
發(fā)明詳述癌胚抗原(CEA)通常與腺癌的發(fā)展有關(guān)。本發(fā)明涉及組合物和方法，用于引發(fā)和增強(qiáng)針對(duì)CEA腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性，其中異常的CEA表達(dá)與腺癌或其發(fā)展相關(guān)聯(lián)。異常的CEA表達(dá)與癌癥的相關(guān)性并不要求CEA蛋白質(zhì)在腫瘤組織生長(zhǎng)的全部時(shí)間點(diǎn)均被表達(dá)，因?yàn)楫惓５腃EA表達(dá)可能僅存在與腫瘤初始階段且在腫瘤發(fā)展后期無(wú)法被檢測(cè)到，反之亦然。
為此目的，提供了編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成DNA分子。
合成分子的密碼子經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)使其被所計(jì)劃的宿主細(xì)胞，在優(yōu)選的實(shí)施方案中為人類(lèi)細(xì)胞，所首選。合成分子可用于開(kāi)發(fā)重組腺病毒或基于質(zhì)粒的疫苗，以通過(guò)中和抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性提供針對(duì)CEA相關(guān)癌癥的有效免疫預(yù)防。合成分子可被用作免疫原性組合物。本發(fā)明提供了多核苷酸，當(dāng)其被直接導(dǎo)入到包括哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)在內(nèi)的脊椎動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，可誘導(dǎo)編碼蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)。
野生性人CEA核苷酸序列已被報(bào)導(dǎo)(參見(jiàn)，如美國(guó)專(zhuān)利No.5,274,087；美國(guó)專(zhuān)利No.5,571,710號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利No.5,843,761)。本發(fā)明提供了編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成DNA分子。本發(fā)明的合成分子包含核酸序列，其中部分核苷酸被改變以使用被哺乳動(dòng)物所首選的密碼子，從而使CEA在人宿主細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)。該合成分子可被用作CEA蛋白質(zhì)來(lái)源，用于癌癥疫苗以通過(guò)中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性提供針對(duì)CEA相關(guān)癌癥的有效免疫預(yù)防。
四種可能核苷酸堿基的三聯(lián)體密碼可存在超過(guò)60種變體形式。
由于這些密碼子僅為20種不同氨基酸提供編碼信息(以及轉(zhuǎn)錄起始和終止)，因此部分氨基酸可被超過(guò)一個(gè)密碼子所編碼，該現(xiàn)象被稱(chēng)為密碼子冗余。由于某些不完全了解的原因，可選密碼子并不均一地存在于不同類(lèi)型細(xì)胞的內(nèi)源DNA中。實(shí)際上，在某些類(lèi)型的細(xì)胞中對(duì)某些密碼子似乎存在可變的天然等級(jí)或偏好性。例如，亮氨酸可被包括CTA，CTC，CTG，CTT，TTA和TTG在內(nèi)的6個(gè)DNA密碼子中任一個(gè)所確定。對(duì)微生物基因組密碼子頻率的詳盡研究已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的內(nèi)源DNA大部分通常含有CTG亮氨酸指定密碼子，而酵母和粘液菌的DNA大部分通常含有TTA亮氨酸指定密碼子。考慮到這種等級(jí)性，通常認(rèn)為由大腸桿菌宿主獲得富亮氨酸多肽的高水平表達(dá)的可能性將某種程度上依賴(lài)于所用密碼子的頻率。例如，富含TTA密碼子的基因在大腸桿菌中很可能表達(dá)較差，而富含CTG基因在該宿主中很可能高水平表達(dá)。類(lèi)似地，優(yōu)選的用于在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼子將是TTA。
密碼子偏好性現(xiàn)象對(duì)重組DNA技術(shù)的意義是顯而易見(jiàn)的，并且該現(xiàn)象可用于解釋很多之前的失敗以實(shí)現(xiàn)在成功轉(zhuǎn)化的宿主體內(nèi)外源基因的高水平表達(dá)-偏好性較低的密碼子可能重復(fù)存在于插入的基因中，宿主細(xì)胞的表達(dá)機(jī)制可能無(wú)法有效地發(fā)揮作用。該現(xiàn)象說(shuō)明被設(shè)計(jì)用來(lái)包括所計(jì)劃的宿主細(xì)胞的偏好密碼子的合成基因可提供外源遺傳物質(zhì)用于重組DNA技術(shù)操作的優(yōu)化形式。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是為在人細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的人CEA基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，已發(fā)現(xiàn)采用編碼相同蛋白質(zhì)序列的可選密碼子可消除外源CEA蛋白質(zhì)在人體細(xì)胞中表達(dá)的限制。
根據(jù)本發(fā)明，人CEA基因序列被轉(zhuǎn)化為具有相同翻譯后序列但使用可選密碼子的多核苷酸序列，如Lathe在《從氨基酸序列數(shù)據(jù)推導(dǎo)的合成寡核苷酸探針理論和實(shí)踐考量》，J.Molec.Biol.1831-12(1985)中的描述，該文在此引入作為參考。該方法一般由鑒定在野生型序列中通常不與高水平表達(dá)的人類(lèi)基因相關(guān)的密碼子并將它們替換為優(yōu)化用于在人體細(xì)胞中表達(dá)的密碼子組成。然后檢查新的基因序列中是否存在由于這些密碼子替換產(chǎn)生了非所需的序列(例如，”ATTTA”序列，疏忽產(chǎn)生的內(nèi)含子剪接識(shí)別位點(diǎn)，不需要的限制酶位點(diǎn)等)。非所需序列可通過(guò)將已存在的密碼子用編碼相同氨基酸的不同密碼子替代而得以消除。然后測(cè)試合成基因片段的改善表達(dá)情況。
上述方法被用于產(chǎn)生人CEA的合成基因序列，從而得到了包含為高效表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的基因。盡管上述步驟概述了發(fā)明人用于設(shè)計(jì)經(jīng)密碼子優(yōu)化基因的方法，該基因用于設(shè)計(jì)癌癥疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是類(lèi)似的疫苗功效或提高的基因表達(dá)可通過(guò)操作步驟的略微改變或序列的少量變化而得以實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員同樣應(yīng)認(rèn)識(shí)到其它的DNA分子也可被構(gòu)建以在人體細(xì)胞內(nèi)提供CEA的高水平表達(dá)，其中僅一部分DNA分子的密碼子經(jīng)過(guò)了密碼子優(yōu)化。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及合成多核苷酸，該合成多核苷酸包含編碼人CEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)或編碼人CEA蛋白質(zhì)具生物學(xué)活性的片段或突變體形式的核苷酸序列，包括但不限于hCEA-ΔAD(SEQ IDNO16)，該多核苷酸序列包含經(jīng)優(yōu)化用于在人宿主內(nèi)表達(dá)的密碼子。該CEA蛋白質(zhì)的突變體形式包括但不限于保守氨基酸取代，氨基末端截短，羧基末端截短，缺失或插入，此處總稱(chēng)為“變體”。任何該生物學(xué)活性片段和\或突變體將編碼特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，這些蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段基本上模擬了如SEQ ID NO2所示的CEA蛋白質(zhì)的免疫學(xué)屬性。本發(fā)明的合成多核苷酸編碼表達(dá)功能性人CEA蛋白質(zhì)的mRNA分子，從而可用于治療性或預(yù)防性癌癥疫苗的開(kāi)發(fā)。
如上所述，本發(fā)明涉及編碼人CEA蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)或生物學(xué)活性片段或其突變體形式的核苷酸。為此目的，本發(fā)明提供了編碼hCEA-ΔAD(SEQ ID NO16，圖10B)的核苷酸，該蛋白包含缺失了C末端錨定序列的人CEA蛋白質(zhì)。本發(fā)明編碼hCEA-ΔAD的核酸分子為增強(qiáng)在人體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
編碼hCEA-ΔAD的代表性核酸分子包含如SEQ ID NO15(圖10A)所示的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及包括特定核苷酸序列的合成核酸分子(多核苷酸)，該核苷酸序列編碼了表達(dá)如SEQ ID NO2所示的新型hCEA蛋白質(zhì)的mRNA，其中該合成核酸分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。本發(fā)明的核酸分子基本不含其它核酸。
本發(fā)明也涉及包含本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)核酸分子的重組載體和真核和原核的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明合成核酸分子，相關(guān)載體和宿主可用于癌癥疫苗的開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明優(yōu)選的DNA分子包含如此處公開(kāi)為SEQ ID NO1，如圖1所示的核苷酸序列，該序列編碼如圖2和SEQ ID NO2所示的人CEA蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的DNA分子包含如此處公開(kāi)為SEQ ID NO15，如圖10A所示的核苷酸序列，該序列編碼缺失了C末端錨定序列的人CEA變體，如SEQ ID NO16和圖10B所示。
本發(fā)明也包括SEQ ID NO1的生物學(xué)活性片段或突變體，該序列編碼可表達(dá)人CEA蛋白質(zhì)的mRNA。任何該生物學(xué)活性片段和/或突變體將編碼至少基本模擬了hCEA蛋白質(zhì)藥理學(xué)屬性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，包括但不限于如SEQ ID NO2所示的hCEA蛋白質(zhì)。任意該多核苷酸包括但不限于核苷酸取代，缺失，添加，氨基末端截短和羧基末端截短。本發(fā)明突變體編碼mRNA分子，該分子在真核細(xì)胞中表達(dá)功能性hCEA蛋白質(zhì)，使其可用于開(kāi)發(fā)癌癥疫苗。
本發(fā)明也涉及編碼hCEA蛋白質(zhì)、經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成DNA分子，其中該合成DNA的核苷酸序列顯著異于SEQ ID NO1的核苷酸序列，但仍編碼了如SEQ ID NO2所示的hCEA蛋白質(zhì)。
該合成DNA被確定屬于本發(fā)明范疇。因此，本發(fā)明公開(kāi)了密碼子冗余，可導(dǎo)致多種表達(dá)相同蛋白質(zhì)的DNA分子。同樣包括在本發(fā)明范疇的是DNA序列的突變，該突變基本不改變表達(dá)蛋白質(zhì)的最終物理屬性。例如，將纈氨酸取代為亮氨酸、精氨酸取代為賴(lài)氨酸或天冬酰胺取代為谷酰胺不會(huì)引起多肽的功能性改變。
已知編碼肽的DNA序列可被改變以使其編碼的肽具有不同于天然存在肽的屬性。改變DNA序列的方法包括但不限于定點(diǎn)誘變。所改變屬性的實(shí)施例包括但不限于酶對(duì)底物或受體對(duì)配體親和性的改變。
本發(fā)明也涉及hCEAopt融合構(gòu)建體，包括但不限于表達(dá)連接到不同標(biāo)記的部分人CEA蛋白質(zhì)的融合構(gòu)建體，該標(biāo)記包括但決不限于GFP(綠色熒光蛋白)，MYC表位，GST和Fc。任意該融合構(gòu)建體可在感興趣的細(xì)胞系中表達(dá)并用于篩選此處公開(kāi)的人CEA蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑。也考慮了被構(gòu)建用于增強(qiáng)對(duì)人CEA免疫反應(yīng)的融合構(gòu)建體，包括但不限于DOM和hsp70和LTB。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含貫穿本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的合成核酸分子的重組載體。這些載體由DNA或RNA組成。對(duì)大多數(shù)克隆而言，優(yōu)選DNA載體。典型的載體包括質(zhì)粒、經(jīng)過(guò)修飾的病毒、桿狀病毒、噬菌體、粘粒、酵母人工染色體和其它形式的可編碼hCEA蛋白質(zhì)的游離或整合的DNA。確定適合特定基因轉(zhuǎn)移或其它用途的載體屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍。
含有編碼hCEA蛋白質(zhì)、經(jīng)密碼子優(yōu)化DNA的表達(dá)載體可被用于在重組宿主體內(nèi)高水平表達(dá)hCEA。表達(dá)載體可包括但不限于克隆載體、經(jīng)修飾的克隆載體、特別設(shè)計(jì)的質(zhì)?；虿《?。同樣，如果需要，多種細(xì)菌表達(dá)載體可被用于在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組hCEA。另外，多種真菌細(xì)胞表達(dá)載體可被用于在真菌細(xì)胞中表達(dá)重組hCEA。此外，多種昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體可被用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及用包含本發(fā)明核酸分子的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞可以是真核或原核的，包括但不限于細(xì)菌如大腸桿菌，真菌細(xì)胞如酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于牛、豬、猴和嚙齒動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞系以及昆蟲(chóng)細(xì)胞包括但不限于果蠅和蠶來(lái)源的細(xì)胞系。這樣的重組宿主細(xì)胞可于合適的條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生hCEA或生物學(xué)等效形式。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是人。如此處所定義的，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”不打算包括轉(zhuǎn)基因人類(lèi)、轉(zhuǎn)基因胎兒或轉(zhuǎn)基因胚胎體內(nèi)的宿主細(xì)胞。
如上所述，包含hCEA蛋白質(zhì)的編碼DNA的表達(dá)載體可被用作在重組宿主體內(nèi)表達(dá)hCEA。因此，本發(fā)明另一方面是在重組宿主體內(nèi)表達(dá)人CEA蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變體的方法，包括(a)將包含如ID NO1或ID NO15所示核酸的載體導(dǎo)入合適的人細(xì)胞系；并(b)在容許該人CEA蛋白質(zhì)或CEA蛋白質(zhì)變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
在hCEA于宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，hCEA蛋白質(zhì)可被回收以提供活性形式的hCEA蛋白質(zhì)。已有多種可用的hCEA蛋白質(zhì)純化步驟。重組hCEA蛋白質(zhì)可通過(guò)鹽分級(jí)、離子交換層析、尺寸排阻層析、羥基磷灰石吸附層析和疏水相互作用層析的單一或多種組合應(yīng)用而從細(xì)胞裂解液中被純化。此外，重組hCEA蛋白質(zhì)可通過(guò)使用免疫親和柱從其他細(xì)胞蛋白中被分離，該免疫親和柱用特異性針對(duì)全長(zhǎng)hCEA蛋白質(zhì)或hCEA蛋白質(zhì)的多肽片段的單克隆或多克隆抗體制備。
本發(fā)明核酸可被組裝進(jìn)表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含被設(shè)計(jì)用來(lái)提供蛋白質(zhì)在人體細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)的序列。
該表達(dá)盒優(yōu)選含有全長(zhǎng)、經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA基因，和與之可操作連接的相關(guān)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，如啟動(dòng)子和終止序列。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是無(wú)內(nèi)含子A序列的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到任意其它已知啟動(dòng)子如強(qiáng)免疫球蛋白、或其它真核基因啟動(dòng)子也可被采用。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長(zhǎng)激素終止子，盡管其它已知轉(zhuǎn)錄終止子也可被采用。CMV-BGH終止子的的組合是尤其優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，hCEAopt表達(dá)盒被插入到載體中。載體優(yōu)選為腺病毒載體，雖然連接到啟動(dòng)子或其它載體如腺相關(guān)病毒或修飾的牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒載體的線性DNA也可被采用。
如果所選載體為腺病毒，則優(yōu)選被稱(chēng)為第一代腺病毒載體。這些腺病毒載體特征在于具有無(wú)功能E1基因區(qū)和優(yōu)選的被缺失的腺病毒E1基因區(qū)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)盒被插入到正常腺病毒E1區(qū)定位的位置上。此外，這些載體任選地具有無(wú)功能或被缺失的E3區(qū)。所用腺病毒基因組的E1和E3區(qū)均被缺失是優(yōu)選的(AE1AE3)。腺病毒可于表達(dá)病毒E1基因的已知細(xì)胞系，如293細(xì)胞或PERC.6細(xì)胞或來(lái)源于293或PERC.6細(xì)胞內(nèi)被擴(kuò)增，這些細(xì)胞系被短暫或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以表達(dá)額外的蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)采用具有受控基因表達(dá)，如四環(huán)素可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子系統(tǒng)的構(gòu)建體時(shí)，細(xì)胞系可表達(dá)參與調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組分。該細(xì)胞系的一個(gè)實(shí)例是T-Rex-293；其它實(shí)例為本領(lǐng)域所知。
為腺病毒載體的操作方便性，腺病毒可以是穿梭質(zhì)粒形式。本發(fā)明也指向包含質(zhì)粒部分和腺病毒部分的穿梭質(zhì)粒載體，腺病毒部分包含具E1和可選E3缺失的腺病毒基因組，并具有包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的人hCEA的插入表達(dá)盒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，質(zhì)粒的腺病毒部分側(cè)翼具有限制位點(diǎn)，使得腺病毒載體可被方便移除。該穿梭質(zhì)粒可在原核或真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)盒被插入pMRKAd5-HVO腺病毒質(zhì)粒(參見(jiàn)Emini等，WO 02/22080，在此引入作為參考)。該質(zhì)粒包含缺失了E1和E3區(qū)的Ad5腺病毒基因組。通過(guò)將5’順式作用包裝區(qū)域延伸到E1基因區(qū)以并入對(duì)優(yōu)化病毒包裝重要的元件對(duì)pMRKAd5-HVO質(zhì)粒的設(shè)計(jì)進(jìn)行改良，從而增強(qiáng)了病毒的復(fù)制。該加強(qiáng)的腺病毒載體能夠方便地在高代繁殖后維持遺傳穩(wěn)定性。
用于制備和純化DNA構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)使本發(fā)明腺病毒、穿梭質(zhì)粒和DNA免疫原得以制備。
根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)確定此處所述的合成cDNA分子(SEQ ID NO1)比相應(yīng)野生型序列具有更高的表達(dá)效率，該合成cDNA分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。令人驚訝地，經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA的cDNA比野生型序列更為有效地打破了對(duì)hCEA的耐受性。此外，此處已顯示hCEAopt比hCEA免疫原性更高，且在引發(fā)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)方面更為有效。
因此，上述載體可被用于免疫原性組合物和疫苗，以預(yù)防與異常CEA表達(dá)相關(guān)的腺癌和\或治療現(xiàn)有癌癥。通過(guò)消除與獲得在成功轉(zhuǎn)化宿主生物體內(nèi)外源CEA高水平相關(guān)的難題，本發(fā)明載體有助于疫苗的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化。為此目的，本發(fā)明的一個(gè)方面是一種預(yù)防或治療癌癥的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成核酸分子的疫苗載體，該經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成核酸分子包含編碼了如SEQ IDNO2所示人CEA蛋白質(zhì)的核酸序列。
根據(jù)上述方法，為預(yù)防或治療任意哺乳動(dòng)物體內(nèi)的癌癥，疫苗載體可被施用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類(lèi)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)一步選擇用于上述治療和預(yù)防方法的任意類(lèi)型的載體。該載體優(yōu)選為腺病毒載體或質(zhì)粒載體。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，該載體為腺病毒載體，包含具腺病毒E1區(qū)缺失和腺病毒E1區(qū)插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化、編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含具E1區(qū)缺失和E1區(qū)插入的腺病毒基因組的腺病毒疫苗載體，其中該插入包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化、編碼人CEA蛋白質(zhì)的合成多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體是Ad 5載體。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體是Ad 6載體。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，腺病毒載體是Ad 24載體。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分的疫苗質(zhì)粒，該表達(dá)盒部分包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的合成多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，此處公開(kāi)的重組腺病毒疫苗與基于質(zhì)粒的多核苷酸疫苗一起被用于各種激發(fā)\加強(qiáng)組合中，以誘導(dǎo)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。因此，這兩種載體以“激發(fā)和加強(qiáng)”方案被施用。例如，第一種載體被施用后，經(jīng)過(guò)一段預(yù)定時(shí)間，例如2周、1個(gè)月、2個(gè)月、6個(gè)月或其它適當(dāng)間隔后，施用第二種載體。載體優(yōu)選地?cái)y帶編碼相同多核苷酸或多核苷酸組合的表達(dá)盒。在也使用了質(zhì)粒DNA的實(shí)施方案中，優(yōu)選的載體含有一個(gè)或多個(gè)可被哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞識(shí)別的啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，質(zhì)粒將含有強(qiáng)啟動(dòng)子，例如，但不限于CMV啟動(dòng)子。合成的人CEA基因或其它待表達(dá)基因?qū)⒈贿B接到該啟動(dòng)子。該質(zhì)粒的實(shí)例是如(J.Shiver等.在《DNA疫苗》，M.Liu等編輯，N.Y.Acad.Sci.，N.Y.，772198-208(1996)，在此引入作為參考)描述的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒Vains。
如上所述，腺病毒載體疫苗和質(zhì)粒疫苗可被作為單一治療方案的組成部分，施用給脊椎動(dòng)物以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。為此目的，本發(fā)明涉及保護(hù)哺乳動(dòng)物免患癌癥的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；(b)允許經(jīng)過(guò)一段預(yù)定時(shí)間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物；該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；在上述保護(hù)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一種載體是質(zhì)粒，第二種載體是腺病毒載體。在可選實(shí)施方案中，第一種載體是腺病毒載體，第二種載體是質(zhì)粒。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療患有腺癌的哺乳動(dòng)物的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；(b)允許經(jīng)過(guò)一段預(yù)定時(shí)間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物；該載體包含i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或人CEA蛋白質(zhì)變體的合成多核苷酸；和ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；在上述保護(hù)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一種載體是質(zhì)粒，第二種載體是腺病毒載體。在可選實(shí)施方案中，第一種載體是腺病毒載體，第二種載體是質(zhì)粒。
待導(dǎo)入到疫苗受者的可表達(dá)DNA或轉(zhuǎn)錄RNA數(shù)量將部分依賴(lài)于所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度和所表達(dá)基因產(chǎn)物的免疫原性。一般而言，約1ng到100gm，優(yōu)選約10μg到300μg質(zhì)粒疫苗載體的免疫學(xué)或預(yù)防性有效劑量被直接使用到肌肉組織中。對(duì)重組腺病毒的有效劑量是約106-1012個(gè)顆粒，優(yōu)選約107-1011個(gè)顆粒。皮下注射、真皮內(nèi)導(dǎo)入、皮膚壓迫和其它給藥方式如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入送遞也被考慮。同樣也考慮了提供加強(qiáng)接種。結(jié)合佐劑如白細(xì)胞介素12蛋白質(zhì)的非腸道給藥，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或其它給藥方式與本發(fā)明疫苗的非腸道給藥同時(shí)或隨后進(jìn)行也具有優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的疫苗載體可以是裸露的，即不與任何對(duì)受者免疫系統(tǒng)有影響的蛋白質(zhì)、佐劑或其它藥劑結(jié)合。為此，理想的疫苗載體是在生理學(xué)可接受溶劑內(nèi)，例如，但不限于無(wú)菌生理鹽水或無(wú)菌緩沖鹽水。可選地，與本發(fā)明疫苗或免疫原組合物同時(shí)施用免疫刺激劑，如佐劑、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)或其它載體也是有優(yōu)勢(shì)的。因此，本發(fā)明包括與本發(fā)明組合物和方法聯(lián)合應(yīng)用該免疫刺激劑。此處所用的免疫刺激劑，基本上指任何增強(qiáng)或加強(qiáng)針對(duì)外源抗原的免疫反應(yīng)(抗體和\或細(xì)胞介導(dǎo)的)的任何物質(zhì)。該免疫刺激劑可以DNA或蛋白質(zhì)形式被施用。多種免疫刺激劑的任一種均可被與本發(fā)明的疫苗和免疫原組合物聯(lián)合應(yīng)用，包括但不限于GM-CSF、IFNγ、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、IL12、B7.1、LFA-3和ICAM-1。該免疫刺激劑為本領(lǐng)域所熟知。
可輔助DNA細(xì)胞攝取的藥劑，例如但不限于鈣離子，也可被應(yīng)用。這些藥劑通常指作為轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑和藥學(xué)可接受載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定特定的免疫刺激劑或藥學(xué)可接受載體以及合適的時(shí)間和給藥模式。
為了描述和公開(kāi)可能連同本發(fā)明應(yīng)用的方法和材料，此處提及的所有出版物均被引入作為參考。此處無(wú)任何內(nèi)容可以被認(rèn)為承認(rèn)本發(fā)明由于之前的發(fā)明而未被授權(quán)將本公開(kāi)內(nèi)容提前。
在參考附圖描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案后，應(yīng)理解本發(fā)明不受限于那些準(zhǔn)確的實(shí)施方案，且在不偏離如在附錄權(quán)利要求中定義的本發(fā)明范圍和精神前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可實(shí)施各種改變和修正。
下列實(shí)施例例證了但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1人CEA優(yōu)化的密碼子序列完整的hCEAopt編碼序列通過(guò)BIONEXIS(Oakland，CA)合成和組裝。采用由PCR組裝的寡核苷酸構(gòu)建在5’末端攜帶有經(jīng)優(yōu)化的Kozak序列的hCEAopt cDNA。組裝的cDNA被插入到pCR-鈍端載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以產(chǎn)生pCR-hCEAopt。hCEAopt cDNA的完整性通過(guò)對(duì)兩條鏈的測(cè)序確定。
實(shí)施例2質(zhì)粒構(gòu)建體和腺病毒載體pV1J/hCEAopt用EcoRI于37℃消化pCR-hCEAopt質(zhì)粒1小時(shí)。得到的2156bp插入序列經(jīng)純化并克隆到pV1JnsB質(zhì)粒(Montgomery等，DNA Cell Biol.，12(9)777-83(1993)的EcoRI位點(diǎn)。
pV1J/hCEA用EcoRI消化pCI/hCEA質(zhì)粒(Song等，通過(guò)組合的基于DNA的免疫接種和非病毒細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)T-輔助-1對(duì)T-輔助-2活性及增強(qiáng)腫瘤免疫性。Gene Therapy 7481-492(2000))。得到的2109bp插入序列被克隆到pV1JnsA質(zhì)粒(Montgomery等，如前)的EcoRI位點(diǎn)。
Ad5/hCEAopt用EcoRI消化pCR-hCEAopt質(zhì)粒。得到的2156bp的插入序列經(jīng)純化并克隆到polyMRK-Ad5穿梭質(zhì)粒的EcoRI(參見(jiàn)Emini等，WO02/22080，在此引入作為參考)。
Ad5/CEA用于產(chǎn)生Ad5載體的pMRK-hCEA穿梭質(zhì)粒獲得自采用SspI和EcoRV消化pDeltalsplB/hCEA質(zhì)粒。然后將9.52kb的片段連接到來(lái)自polyMRK質(zhì)粒、BglII-BamHI限制性、1272bp的Klenow處理產(chǎn)物上。在大腸桿菌BJ5183細(xì)胞中將來(lái)自pMRK-hCEA和pMRK-hCEAopt、包含用于hCEA的表達(dá)盒和E1側(cè)翼Ad5區(qū)域的Pacl/StuI片段與ClaI線性化的pAd5質(zhì)粒重組。得到的質(zhì)粒分別為pAdS-hCEA和pAd5-hCEAopt。兩種質(zhì)粒均用Pad酶切以釋放Ad反轉(zhuǎn)末端重復(fù)(ITRs)并轉(zhuǎn)染PerC-6細(xì)胞。采用系列傳代進(jìn)行Ad5載體的擴(kuò)增。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)CsCl梯度純化方法純化并用A105緩沖液(5mMTris-Cl pH 8.0，1mM MgCl2，75mM NaCI，5％蔗糖，0.005Tween20)充分透析MRKAdS/hCEA和MRKAdS/hCEAopt。
實(shí)施例3CEA表達(dá)和檢測(cè)采用蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)由質(zhì)粒和Ad載體的hCEA表達(dá)。采用Lipofectamine 2000(Life Technologies，Carlsbad，CA)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞或Perc.6細(xì)胞中。Perc.6細(xì)胞的腺病毒感染在37℃下于無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行30分鐘，然后加入新鮮培養(yǎng)基。溫育48小時(shí)后，收集全細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析采用兔多克隆抗體檢測(cè)細(xì)胞裂解物中存在的CEA蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)被檢測(cè)為180-220kDa條帶。采用直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)CEA試劑盒(DBC-DiagnosticsBiochem Canada Inc.，Ontario，Canada)檢測(cè)在細(xì)胞上清和經(jīng)注射小鼠(注射后3天)外周血中分泌的CEA。
實(shí)施例4小鼠免疫雌性C57BL/6小鼠(H-2b)購(gòu)自Charles River(Lecco，Italy)。CEA.tg小鼠(H-2b)由J.Primus(Vanderbilt University)提供并與標(biāo)準(zhǔn)條件下保存。按照以前所描述的方法(Rizzuto等，.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(11)6417-22(1999))將50μg質(zhì)粒DNA以50μl體積電注射到小鼠四頭肌中。在小鼠四頭肌中以50μl體積進(jìn)行Ad注射。在指定時(shí)間分析體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
實(shí)施例5經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA的cDNA顯著提高h(yuǎn)CEA的表達(dá)人CEA(hCEAopt)的合成基因被設(shè)計(jì)以并入針對(duì)每種氨基酸(下文表示為aa)殘基的人類(lèi)首選密碼子。經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA被修飾以維持與原始克隆76.8％的同一性(參見(jiàn)圖1)。經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA被克隆到pV 1J載體中(Montgomery等，如前)，并置于Kozak優(yōu)化序列(5′-GCCGCCACC-3′，SEQ ID NO13)之前，且位于人巨細(xì)胞(CMV)/內(nèi)含子A啟動(dòng)子和牛生長(zhǎng)激素(BGH)終止信號(hào)的控制下。
該構(gòu)建體被命名為pV 1J/hCEAopt(參見(jiàn)實(shí)施例2)。此外，構(gòu)建了攜帶hCEAopt序列的腺病毒5型載體(Ad5/hCEAopt)，該hCEAopt序列由CMV/內(nèi)含子和BGH終止信號(hào)位于側(cè)翼。為進(jìn)行比較，攜帶有野生型hCEA序列的相應(yīng)的質(zhì)粒和Ad5載體被構(gòu)建并產(chǎn)生pV1J/hCEA和Ad5/hCEA。與含有經(jīng)密碼子優(yōu)化cDNA的載體類(lèi)似，這些載體攜帶有位于CMV/int A啟動(dòng)子和BGH終止信號(hào)控制下的野生型基因。
對(duì)用pV1J/hCEAopt轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析產(chǎn)生了具有較大分子量(180-200kDa)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在體積上與在pV1J/hCEA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中所檢測(cè)的難以區(qū)別。類(lèi)似地，用Ad5/hCEA或Ad5H7hCEAopt轉(zhuǎn)染的PerC-6細(xì)胞的上清液中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)在體積上也沒(méi)有明顯差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
為比較hCEAopt和hCEA的表達(dá)效率，用1×107到1×104pfu的不同劑量的Ad5/hCEAopt載體注射到10只C57BL/6小鼠的實(shí)驗(yàn)組的四頭肌內(nèi)。注射后三天，測(cè)定CEA蛋白質(zhì)水平并與對(duì)照組的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行比較，該對(duì)照組被注射了相同劑量的Ad5/hCEA。與注射Ad5/hCEA的小鼠相比，觀察到注射1×107pfu Ad/hCEAopt(48.2μg/l)后，hCEA水平的幾何平均值提高了6倍，而注射了1×106pfu相同病毒(19.1μg/l)后蛋白質(zhì)水平提高了10倍(圖2A)。與之對(duì)照，與Ad5/hCEA相比，注射較低劑量的Ad5/hCEAopt基本未導(dǎo)致循環(huán)CEA水平的提高。相對(duì)于pV 1J/hCEA，在電注射20或50μgpV1J/hCEAopt質(zhì)粒后CEA蛋白質(zhì)水平的增加雖然程度稍低，但也很顯著(圖2B)。因此，這些結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)密碼子優(yōu)化的cDNA與相應(yīng)的野生型序列相比具有更高的表達(dá)效率，不受所用基因轉(zhuǎn)移載體的限制。
實(shí)施例6IFN-γELISPOT分析用在無(wú)菌PBS中稀釋為2.5μg/ml的純化兔抗鼠IFN-γ((IgGl，克隆R4-6A2，Pharmingen，San Diego，CA)按100μl/孔包被96孔MAIP平板(Millipore，Bedford，MA)。經(jīng)PBS洗滌后，用220μl/孔的R10培養(yǎng)基于37℃封閉平板2小時(shí)。
通過(guò)以無(wú)菌方式從無(wú)痛致死小鼠移除脾臟以獲得脾細(xì)胞。通過(guò)在金屬網(wǎng)上磨碎經(jīng)分割的脾臟進(jìn)行脾臟粉碎。通過(guò)在細(xì)胞沉淀物中加入1ml 0.1×PBS進(jìn)行滲透裂解并旋渦振蕩不超過(guò)15秒以除去紅細(xì)胞。然后加入1ml 2×PBS并用1×PBS將體積調(diào)整為4ml。
通過(guò)室溫下1200rpm離心10分鐘以沉淀細(xì)胞，并于1ml RIO培養(yǎng)基中重新懸浮沉淀物。用Turks染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞。
脾細(xì)胞以5×105和2×105細(xì)胞/孔濃度鋪培養(yǎng)板，每個(gè)濃度設(shè)兩組平行，并與1μg/ml每種肽的懸液于37℃溫育20小時(shí)。對(duì)每只小鼠用5μg/ml的Concanavalin A(ConA)作為陽(yáng)性?xún)?nèi)參。用含0.05％Tween20的PBS洗滌后，用50μl/孔、于試驗(yàn)緩沖液中按1∶2500稀釋的生物素偶聯(lián)的兔抗鼠IFN-γ(RatIgGl，clone XMG 1.2，PharMingen)于4℃溫育平板過(guò)夜。經(jīng)充分洗滌后，加入50μl/孔NBT-CIP(PierceBiotechnology Inc.，Rockford，IL)顯影平板，直到斑點(diǎn)顯影清晰可見(jiàn)為止。
通過(guò)用蒸餾水充分洗滌細(xì)胞平板以終止反應(yīng)。將平板在空氣中干燥并用自動(dòng)ELISPOT讀板機(jī)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。
實(shí)施例7細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色將1ml RPMI 10％FCS中的一到兩百萬(wàn)個(gè)小鼠脾細(xì)胞或PBMC與肽合并物(每種肽終濃度為5-6μg/ml)、brefeldin A(1μg/ml，BD Pharmingen cat #555028/2300kk)和5％CO2一起于37℃溫育12-16小時(shí)。然后用FACS緩沖液(PBS 1％ FBS，0.01％ NaN3)洗滌細(xì)胞并將細(xì)胞與純化抗鼠CD16/CD32 Fc block(BD Pharmingen cat #553142)一起于4℃溫育15分鐘。接著洗滌細(xì)胞并用表面抗體CD4-PE偶聯(lián)抗鼠(BD Pharmingen，cat.# 553049)、PercP CD8偶聯(lián)抗鼠(BD Pharmingen cat# 553036)和APC偶聯(lián)抗鼠CD3e(BDPharmingen cat# 553066)，于暗處室溫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行30分鐘染色。經(jīng)洗滌后，用Cytofix-Cytoperm溶液(BD Pharmingen cat#555028/2300kk)固定化并滲透細(xì)胞。用PermWash溶液(BDPharmingen cat #555028/2300kk)洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞與IFNγ-FITC抗體(BD Pharmingen)溫育。然后洗滌細(xì)胞、用含1％甲醛的PBS進(jìn)行固定化并于FACS-Calibur流式細(xì)胞儀上用CellQuest軟件(Becton Dickinson，San Jose，CA)進(jìn)行分析。
實(shí)施例8用于CEA特異性T細(xì)胞直接計(jì)數(shù)的含表位的肽的鑒定和表征為更好的表征在小鼠內(nèi)針對(duì)CEA的遺傳接種所引發(fā)的免疫反應(yīng)，對(duì)C57BL/6和BALB/c進(jìn)行ELISPOT分析以鑒定CD4+和CD8+CEA特異性表位。為此目的，比較了不同的免疫程式以產(chǎn)生高度免疫的小鼠，該小鼠可被用于鑒定對(duì)覆蓋整個(gè)蛋白質(zhì)的個(gè)體肽的反應(yīng)?？紤]到最近的報(bào)導(dǎo)顯示通過(guò)采用質(zhì)粒DNA初次免疫-Ad加強(qiáng)免疫程式可誘導(dǎo)針對(duì)病毒和細(xì)菌抗原的高水平細(xì)胞免疫，本研究中采用了相同的免疫模式。用不同的方式肌肉內(nèi)免疫小鼠i)兩劑1×109vp的Ad/hCEA(Ad/Ad)；ii)兩劑pV1J/hCEA質(zhì)粒(DNA/DNA)和iii)一劑質(zhì)粒DNA，之后一劑Ad/hCEA(DNA/Ad)。免疫時(shí)間間隔為兩周。
在加強(qiáng)免疫兩周后通過(guò)ELISPOT測(cè)定由不同免疫方案引發(fā)的細(xì)胞免疫。為比較不同接種方案的免疫原性效率，采用覆蓋氨基酸497-703、重疊11個(gè)氨基酸的15mer肽合并物(合并物D)激發(fā)由脾細(xì)胞分泌的抗原特異性細(xì)胞因子。在DNA/Ad注射組的C57BL/6和BALB/c小鼠中觀察到由較高的SFC幾何平均值所顯示的最強(qiáng)的反應(yīng)(圖4)。因此，該方法被用于進(jìn)一步分析免疫反應(yīng)。
為確定免疫反應(yīng)是否等量分布于整個(gè)CEA蛋白質(zhì)上，用完全覆蓋整個(gè)蛋白質(zhì)序列的4個(gè)15mer肽合并物中的1個(gè)于體外激發(fā)來(lái)自經(jīng)免疫的C57BL/6和BALB/c小鼠的脾細(xì)胞。每個(gè)合并物由重疊11個(gè)殘基、15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽組成。凍干的hCEA肽購(gòu)自Bio-Synthesis(Lewisville，TX)并以40mg/ml重懸于DMSO中。除了合并物D以外，合并物A(氨基酸1到47)、B(氨基酸137到237)和C(氨基酸317到507)也都被用于本研究。終濃度如下合并物A＝1.2mg/ml、合并物B＝0.89mg/ml、合并物C＝0.89mg/ml、合并物D＝0.8mg/ml。肽保存于-80℃。
在C57BL/6小鼠中由DNA/Ad接種方案引發(fā)的免疫反應(yīng)明顯地偏向蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域(參見(jiàn)圖5A)。用肽合并物C和D獲得了顯著的SFC數(shù)值(幾何平均值分別為170和244SFC/106脾細(xì)胞)，而合并物A和B產(chǎn)生了低得多的數(shù)值(分別為10和27SFC/106脾細(xì)胞)。相反地，在BALB/c小鼠中用合并物B得到的免疫反應(yīng)最高(幾何平均值1236SFC/106脾細(xì)胞)，盡管合并物A、C和D也顯示了顯著的SFC數(shù)值(分別為93、263和344)(圖5B)。在兩組小鼠中針對(duì)無(wú)關(guān)肽合并物無(wú)顯著的反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
為確定肽合并物中引發(fā)反應(yīng)的個(gè)體肽，針對(duì)每種個(gè)體肽用IFNγ-ELISPOT試驗(yàn)分析4只用DNA/Ad接種方案免疫的小鼠的脾臟，這些肽包含了觀察到顯著免疫反應(yīng)的肽合并物。針對(duì)包括在合并物C和D中的肽80到173測(cè)試了來(lái)自C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞。對(duì)包含合并物B、C和D的肽35到173測(cè)試了來(lái)自BALB/c小鼠的脾細(xì)胞。C57BL/6小鼠中的CEA特異性反應(yīng)被定位到4對(duì)具有重疊序列的15mer肽(氨基酸431到435和425到439；529到543，和533到547；565到579，和569到593；613到627和617到631)(圖6A)。在BALB/c小鼠中免疫反應(yīng)被定位到22個(gè)不同的肽，其中17個(gè)具有重疊序列(氨基酸213到227，和213到227；229到243，和233到247；409到423和413到427；421到435和425到439；565到579和569到583；573到587；613到627和617到631；和621到635和625到639；637到651和641到655)(圖6B)。
為定義所選肽中含有的表位的T細(xì)胞特異性，在來(lái)自經(jīng)注射小鼠的脾細(xì)胞上進(jìn)行IFNγ細(xì)胞內(nèi)染色試驗(yàn)。獲得的結(jié)果如圖7所示。數(shù)據(jù)說(shuō)明已鑒定了C57BL/6和BALB/c小鼠的CD8+和CD4+特異性表位，可被用于定量T淋巴細(xì)胞的循環(huán)水平。
實(shí)施例9經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA打破了hCEA轉(zhuǎn)基因小鼠的耐受性為確定經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA增強(qiáng)的免疫原屬性是否會(huì)更為有效地打破對(duì)人CEA的耐受性，用攜帶有野生型或經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA序列的載體免疫h(yuǎn)CEA轉(zhuǎn)基因小鼠。這些轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶有完整的人CEA基因以及側(cè)翼序列且在盲腸和結(jié)腸表達(dá)hCEA蛋白質(zhì)。因此，該小鼠細(xì)胞系對(duì)研究針對(duì)該腫瘤自身抗原的免疫治療策略的安全性和有效性而言是有用的模型(Clarke等.人CEA轉(zhuǎn)基因小鼠作為免疫治療模型，Cancer Res.58(7)1469-77(1998))。
首先，用4次50μg質(zhì)粒DNA電注射處理5到10只轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)組，隨后終注射1×1010pp腺病毒。用IFNγ-ELISPOT實(shí)驗(yàn)在收集自4只經(jīng)注射小鼠的脾細(xì)胞上分析對(duì)hCEA的免疫反應(yīng)。僅用來(lái)自hCEAopt cDNA免疫小鼠的脾細(xì)胞檢測(cè)到了對(duì)hCEA的免疫反應(yīng)(參見(jiàn)圖8)。用肽143和合并物D檢測(cè)到免疫反應(yīng)，說(shuō)明免疫已引發(fā)了對(duì)C末端表位引發(fā)顯著的Cd8+反應(yīng)。
在用間隔兩周的兩次1×1010pp腺病毒載體注射的轉(zhuǎn)基因小鼠中也測(cè)試了經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA的增強(qiáng)的免疫原性。用IFNγ細(xì)胞內(nèi)染色在收集自4只經(jīng)免疫小鼠的PBMC上測(cè)定CEA特異性免疫反應(yīng)。僅在Ad/CEAopt免疫的小鼠中檢測(cè)到了對(duì)hCEA的免疫反應(yīng)(圖9)。如在DNA加Ad組中所觀察到的，用肽合并物D檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)；但用肽合并物A也觀察到顯著的CD8+反應(yīng)。因此，這些結(jié)果說(shuō)明經(jīng)密碼子優(yōu)化的hCEA cDNA比野生型序列免疫原性更高且更為有效地打破對(duì)hCEA的耐受性。
實(shí)施例10抗體檢測(cè)和滴定用于抗體滴定的血清獲得自后眼眶取血。用稀釋于包被緩沖液(50mM NaHCO3，pH 9.4)中的CEA蛋白質(zhì)(高純CEA；FitzgeraldIndustries International Inc.，Concord MA)按100ng/孔包被ELISA平板((Nunc maxisorpTM)并于4℃溫育過(guò)夜。然后用含有5％BSA的PBS于37℃封閉平板1小時(shí)。于5％BSA的PBS中稀釋小鼠血清(稀釋50倍以評(píng)估血清轉(zhuǎn)化率；稀釋度從1∶10到1∶31，2150以評(píng)估滴度)。免疫前血清用作背景。稀釋的血清于4℃溫育過(guò)夜。
用含1％BSA、0.05％Tween 20的PBS進(jìn)行洗滌。二級(jí)抗體(羊抗鼠，IgG過(guò)氧化物酶，Sigma)于含5％BSA的PBS中稀釋2000倍并于室溫下在搖床上溫育2-3小時(shí)。洗滌后，將平板用TMB底物(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)按100μl/孔顯影。用25μl/孔的1M H2SO4溶液終止反應(yīng)并于450nm/620nm讀板?？笴EA血清滴度被計(jì)算為血清極限稀釋度的倒數(shù)，在該極限稀釋度下血清產(chǎn)生的吸光度比相同稀釋度自體免疫前血清的吸光度至少大3倍。
實(shí)施例11提高的hCEAopt免疫原性為檢測(cè)由野生型和經(jīng)密碼子優(yōu)化CEA表達(dá)載體誘導(dǎo)的體內(nèi)免疫反應(yīng)，用1×105到1×103pfu范圍內(nèi)不同劑量的Ad5/hCEAopt肌肉內(nèi)免疫C57BL/6小鼠。作為比較，用1×106到1×104pfu范圍內(nèi)劑量的Ad5/hCEA免疫8到10只小鼠的實(shí)驗(yàn)組。用間隔3周的兩次注射處理小鼠。第二次免疫后2周，從每只小鼠中分離脾細(xì)胞。為定量由腺病毒介導(dǎo)的免疫產(chǎn)生的分泌IFNγ的CEA特異性CD8T細(xì)胞前體頻率，用于H-2b限制T細(xì)胞表位CGIQNSVSA(SEQ ID NO14，參見(jiàn)下文)的ELISPOT實(shí)驗(yàn)被采用。1×104pfu的免疫引發(fā)了可測(cè)量的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了53個(gè)特異于CGIQNSVSA表位(SEQ ID NO14)的IFNγ斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC，幾何平均值)，而注射1×103pfu僅引發(fā)了可忽略的SFC數(shù)值(圖3A)。SFC在用1×105pfu Ad/hCEAopt免疫的實(shí)驗(yàn)組中增加到302。相反地，至少需要1×105pfu Ad5/hCEA才能引發(fā)顯著的CD8T細(xì)胞前體頻率，該頻率在用1×106pfu劑量免疫的小鼠實(shí)驗(yàn)組中增加到168SFC。在Ad5免疫的小鼠中未檢測(cè)到肽特異性IFNγ(數(shù)據(jù)未顯示)。
在ELISA中用純化的人CEA蛋白質(zhì)作為底物測(cè)試來(lái)自用1×105pfu每種hCEA腺病毒載體免疫的小鼠的血清(圖3B)。在所有經(jīng)免疫小鼠中均檢測(cè)到Ad5/hCEAopt免疫小鼠的CEA特異性抗體滴度，且Ab滴度的幾何平均值為46，474。相反地，Ad5/hCEA免疫的實(shí)驗(yàn)組顯示了約低100倍的CEA特異性抗體滴度幾何平均值(454)。因此，這些數(shù)據(jù)證明經(jīng)密碼子優(yōu)化的CEA cDNA在引發(fā)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)方面更為有效。
實(shí)施例12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析該實(shí)施例所示結(jié)果是通過(guò)斯氏t檢驗(yàn)分析的。小于0.05的p值被認(rèn)為是顯著的。
序列表<110>Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolar P.Angeletti S.P.A.
Lamonica，NicolaMennuni，CarmelaSavino，RoccoLahm，Armin<120>編碼人癌胚抗原的合成基因及其用途<130>ITR0044Y<150>60/467,971<151>2003-05-05<150>未知的<151>2004-02-11<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2109<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hCEAopt<400>1atggagagcc ccagcgcccc cccccaccgc tggtgcatcc cctggcagcg cctgctgctg 60accgccagcc tgctgacctt ctggaacccc cccaccaccg ccaagctgac catcgagagc 120acccccttca acgtggccga gggcaaggag gtgctgctgc tggtgcacaa cctgccccag 180cacctgttcg gctacagctg gtacaagggc gagcgcgtgg cggcaaccg ccagatcatc 240ggctacgtga tcggcaccca gcaggccacc cccggccccg cctacagcgg ccgcgagatc 300atctacccca acgccagcct gctgatccag aacatcatcc agaacgacac cggcttctac 360accctgcacg tgatcaagag cgacctggtg aacgaggagg ccaccggcca gttccgcgtg 420taccccgagc tgcccaagcc cagcatcagc agcaacaaca gcaagcccgt ggaggacaag 480gacgccgtgg ccttcacctg cgagcccgag acccaggacg ccacctacct gtggtgggtg 540aacaaccaga gcctgcccgt gagcccccgc ctgcagctga gcaacggcaa ccgcaccctg 600accctgttca acgtgacccg caacgacacc gccagctaca agtgcgagac ccagaacccc 660gtgagcgccc gccgcagcga cagcgtgatc ctgaacgtgc tgtacggccc cgacgccccc 720accatcagcc ccctgaacac cagctaccgc agcggcgaga acctgaacct gagctgccac 780gccgccagca acccccccgc ccagtacagc tggttcgtga acggcacctt ccagcagagc 840acccaggagc tgttcatccc caacatcacc gtgaacaaca gcggcagcta cacctgccag 900gcccacaaca gcgacaccgg cctgaaccgc accaccgtga ccaccatcac cgtgtacgcc 960gagcccccca agcccttcat caccagcaac aacagcaacc ccgtggagga cgaggacgcc 1020gtggccctga cctgcgagcc cgagatccag aacaccacct acctgtggtg ggtgaacaac 1080
cagagcctgc ccgtgagccc ccgcctgcag ctgagcaacg acaaccgcac cctgaccctg 1140ctgagcgtga cccgcaacga cgtgggcccc tacgagtgcg gcatccagaa cgagctgagc 1200gtggaccaca gcgaccccgt gatcctgaac gtgctgtacg gccccgacga ccccaccatc 1260agccccagct acacctacta ccgccccggc gtgaacctga gcctgagctg ccacgccgcc 1320agcaaccccc ccgcccagta cagctggctg atcgacggca acatccagca gcacacccag 1380gagctgttca tcagcaacat caccgagaag aacagcggcc tgtacacctg ccaggccaac 1440aacagcgcca gcggccacag ccgcaccacc gtgaagacca tcaccgtgag cgccgagctg 1500cccaagccca gcatcagcag caacaacagc aagcccgtgg aggacaagga cgccgtggcc 1560ttcacctgcg agcccgaggc ccagaacacc acctacctgt ggtgggtgaa cggccagagc 1620ctgcccgtga gcccccgcct gcagctgagc aacggcaacc gcaccctgac cctgttcaac 1680gtgacccgca acgacgcccg cgcctacgtg tgcggcatcc agaacagcgt gagcgccaac 1740cgcagcgacc ccgtgaccct ggacgtgctg tacggccccg acacccccat catcagcccc 1800cccgacagca gctacctgag cggcgccaac ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac 1860cccagccccc agtacagctg gcgcatcaac ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg 1920ttcatcgcca agatcacccc caacaacaac ggcacctacg cctgcttcgt gagcaacctg 1980gccaccggcc gcaacaacag catcgtgaag agcatcaccg tgagcgccag cggcaccagc 2040cccggcctga gcgccggcgc caccgtgggc atcatgatcg gcgtgctggt gggcgtggcc 2100ctgatctga 2109<210>2<211>702<212>PRT<213>智人<400>2Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly35 40 45Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly50 55 60Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile65 70 75 80Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile100 105 110Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp115 120 125Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu130 135 140Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys145 150 155 160Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr165 170 175Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln180 185 190Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn195 200 205Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg210 215 220Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn245 250 255Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe260 265 270Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn275 280 285Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser290 295 300Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala305 310 315 320Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu325 330 335Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr340 345 350Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg355 360 365Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr370 375 380Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser385 390 395 400Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp405 410 415Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn420 425 430Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser435 440 445Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile450 455 460Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn465 470 475 480Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val485 490 495Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro500 505 510Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln515 520 525Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser530 535 540Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn545 550 555 560Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser565 570 575Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly580 585 590Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly595 600 605Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln610 615 620Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu625 630 635 640Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe645 650 655Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr675 680 685Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile690 695 700<210>3<211>2109<212>DNA<213>智人<400>3atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300tatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa cgaattaagt 1200gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100ctgatatag 2109<210>4<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>肽<400>4Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Ser Cys His Ala1 5 10 15<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>5Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val1 5 10 15<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>6Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp1 5 10 15<210>7<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>7Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly1 5 10 15<210>8
<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>8Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser1 5 10 15<210>9<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>9Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser Val Asp His1 5 10 15<210>10<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>10Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu1 5 10 15<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>11Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln1 5 10 15
<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>12Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr1 5 10 15<210>13<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Kozak序列<400>13gccgccacc9<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T-細(xì)胞表位<400>14Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala1 5<210>15<211>2034<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hCEA-ΔAD<400>15atggagagcc ccagcgcccc cccccaccgc tggtgcatcc cctggcagcg cctgctgctg 60accgccagcc tgctgacctt ctggaacccc cccaccaccg ccaagctgac catcgagagc 120
acccccttca acgtggccga gggcaaggag gtgctgctgc tggtgcacaa cctgccccag 180cacctgttcg gctacagctg gtacaagggc gagcgcgtgg acggcaaccg ccagatcatc 240ggctacgtga tcggcaccca gcaggccacc cccggccccg cctacagcgg ccgcgagatc 300atctacccca acgccagcct gctgatccag aacatcatcc agaacgacac cggcttctac 360accctgcacg tgatcaagag cgacctggtg aacgaggagg ccaccggcca gttccgcgtg 420taccccgagc tgcccaagcc cagcatcagc agcaacaaca gcaagcccgt ggaggacaag 480gacgccgtgg ccttcacctg cgagcccgag acccaggacg ccacctacct gtggtgggtg 540aacaaccaga gcctgcccgt gagcccccgc ctgcagctga gcaacggcaa ccgcaccctg 600accctgttca acgtgacccg caacgacacc gccagctaca agtgcgagac ccagaacccc 660gtgagcgccc gccgcagcga cagcgtgatc ctgaacgtgc tgtacggccc cgacgccccc 720accatcagcc ccctgaacac cagctaccgc agcggcgaga acctgaacct gagctgccac 780gccgccagca acccccccgc ccagtacagc tggttcgtga acggcacctt ccagcagagc 840acccaggagc tgttcatccc caacatcacc gtgaacaaca gcggcagcta cacctgccag 900gcccacaaca gcgacaccgg cctgaaccgc accaccgtga ccaccatcac cgtgtacgcc 960gagcccccca agcccttcat caccagcaac aacagcaacc ccgtggagga cgaggacgcc 1020gtggccctga cctgcgagcc cgagatccag aacaccacct acctgtggtg ggtgaacaac 1080cagagcctgc ccgtgagccc ccgcctgcag ctgagcaacg acaaccgcac cctgaccctg 1140ctgagcgtga cccgcaacga cgtgggcccc tacgagtgcg gcatccagaa cgagctgagc 1200gtggaccaca gcgaccccgt gatcctgaac gtgctgtacg gccccgacga ccccaccatc 1260agccccagct acacctacta ccgccccggc gtgaacctga gcctgagctg ccacgccgcc 1320agcaaccccc ccgcccagta cagctggctg atcgacggca acatccagca gcacacccag 1380gagctgttca tcagcaacat caccgagaag aacagcggcc tgtacacctg ccaggccaac 1440aacagcgcca gcggccacag ccgcaccacc gtgaagacca tcaccgtgag cgccgagctg 1500cccaagccca gcatcagcag caacaacagc aagcccgtgg aggacaagga cgccgtggcc 1560ttcacctgcg agcccgaggc ccagaacacc acctacctgt ggtgggtgaa cggccagagc 1620ctgcccgtga gcccccgcct gcagctgagc aacggcaacc gcaccctgac cctgttcaac 1680gtgacccgca acgacgcccg cgcctacgtg tgcggcatcc agaacagcgt gagcgccaac 1740cgcagcgacc ccgtgaccct ggacgtgctg tacggccccg acacccccat catcagcccc 1800cccgacagca gctacctgag cggcgccaac ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac 1860cccagccccc agtacagctg gcgcatcaac ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg 1920ttcatcgcca agatcacccc caacaacaac ggcacctacg cctgcttcgt gagcaacctg 1980gccaccggcc gcaacaacag catcgtgaag agcatcaccg tgagcgccag cggc2034<210>16<211>678<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>hCEA-ΔAD<400>16Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly35 40 45Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly50 55 60Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile65 70 75 80Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile100 105 110Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp115 120 125Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu130 135 140Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys145 150 155 160Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr165 170 175Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln180 185 190Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn195 200 205Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg210 215 220Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro225 230 235 240Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn245 250 255Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe260 265 270Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn275 280 285Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser290 295 300Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala305 310 315 320Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu325 330 335Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr340 345 350Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg355 360 365Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr370 375 380Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Glu Leu Ser385 390 395 400Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp405 410 415Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn420 425 430Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser435 440 445Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile450 455 460Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn465 470 475 480Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val485 490 495Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro500 505 510Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln515 520 525Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn545 550 555 560Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser565 570 575Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly580 585 590Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly595 600 605Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln610 615 620Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu625 630 635 640Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe645 650 655Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile660 665 670Thr Val Ser Ala Ser Gly67權(quán)利要求
1.合成的核酸分子，包含編碼如SEQ ID NO2所示人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)的核苷酸序列，該合成核酸分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
2.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核酸是mRNA。
4.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核酸是cDNA。
5.權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中核苷酸序列包含如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
6.包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
7.包含權(quán)利要求6的載體的宿主細(xì)胞。
8.在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將包含權(quán)利要求1的核酸的載體導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中；并(b)在允許該人CEA蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。
9.預(yù)防或治療癌癥的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用包含經(jīng)密碼子優(yōu)化的合成核酸分子的疫苗載體，核酸分子包含編碼如SEQ ID NO2所示人癌胚抗原(hCEA)蛋白質(zhì)或如SEQ ID NO16所示人癌胚抗原變體的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中哺乳動(dòng)物為人類(lèi)。
11.權(quán)利要求9的方法，其中載體為腺病毒載體或質(zhì)粒載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中載體為腺病毒載體，包含具腺病毒E1區(qū)缺失和腺病毒E1區(qū)插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求9的方法，其中載體為質(zhì)粒疫苗載體，包含質(zhì)粒部分和可表達(dá)盒，該可表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
14.腺病毒疫苗載體，包含具E1區(qū)缺失和E1區(qū)插入的腺病毒基因組，其中該插入包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求14的腺病毒載體，其為Ad5載體。
16.權(quán)利要求14的腺病毒載體，其為Ad6載體。
17.權(quán)利要求14的腺病毒載體，其為Ad24載體。
18.包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分的疫苗質(zhì)粒，表達(dá)盒部分包含(a)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(b)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
19.保護(hù)哺乳動(dòng)物免患癌癥的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；(b)允許經(jīng)過(guò)一段預(yù)定時(shí)間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中第一種載體是質(zhì)粒而第二種載體是腺病毒載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中第一種載體是腺病毒載體而第二種載體是質(zhì)粒。
22.治療患結(jié)直腸癌的哺乳動(dòng)物的方法，包括(a)將第一種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子；(b)允許經(jīng)過(guò)一段預(yù)定時(shí)間；和(c)將第二種載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物，該載體包含(i)經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼人CEA蛋白質(zhì)或其變體的多核苷酸；和(ii)與該多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中第一種載體是質(zhì)粒而第二種載體是腺病毒載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中第一種載體是腺病毒載體而第二種載體是質(zhì)粒。
25.包含編碼如SEQ ID NO16所示人癌胚抗原(CEA)蛋白質(zhì)變體的核苷酸序列的合成核酸分子，該合成核酸分子為在人體細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化；
26.權(quán)利要求25的合成核酸分子，其中核苷酸序列包含如SEQ IDNO15所示的核苷酸序列。
27.包含權(quán)利要求25的核酸分子的載體。
28.包含權(quán)利要求27的載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼人癌胚抗原(CEA)的合成多核苷酸，該合成多核苷酸為在人體細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)經(jīng)過(guò)了密碼子優(yōu)化。編碼CEA的基因通常與人類(lèi)腫瘤的發(fā)展有關(guān)。本發(fā)明提供了引發(fā)或增強(qiáng)針對(duì)由CEA腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，其中，異常的CEA表達(dá)與癌或其發(fā)展有關(guān)。具體而言，本發(fā)明提供了攜帶有經(jīng)密碼子優(yōu)化的人CEA的腺病毒載體和質(zhì)粒，且公開(kāi)了它們?cè)谟糜陬A(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物方面的用途。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1784424SQ200480012115
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月5日
發(fā)明者N·拉莫尼卡, A·拉姆, C·門(mén)努尼, R·薩維諾 申請(qǐng)人:P.安杰萊蒂分子生物學(xué)研究所