一種中性內(nèi)切木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種中性內(nèi)切木聚糖酶及其編碼基因與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 半纖維素是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源。木聚糖是以木吡喃糖為單 位的由β_1，4鍵連接的半纖維素，富含于闊葉樹和大多數(shù)一年生植物體內(nèi)。而半纖維素在自 然界中含量占生物量的30%，僅次于纖維素。
[0003] 木聚糖是一種雜聚多糖，它的主鏈由吡喃木糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成。通常所 說的木聚糖酶即內(nèi)切，4-D_木聚糖酶(endo-β-Ι，4-D-xylanase)[EC3.2.1.8]，它的主要 作用是隨機(jī)地切割木聚糖主鏈骨架吡喃木糖殘基之間的β-1，4-糖苷鍵，生成不同長度的木 糖、寡聚木糖或帶有側(cè)鏈的寡聚木糖。由于木聚糖酶在木聚糖降解過程中發(fā)揮了重要作用， 它是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵、最重要的酶，也是木聚糖降解相關(guān)酶中研究最多、最有應(yīng)用 價(jià)值的一類酶。
[0004] 內(nèi)切β-1，4_木聚糖酶屬于糖苷水解酶，其結(jié)構(gòu)具有豐富的多樣性。根據(jù)木聚糖酶 催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸同源性和疏水簇分析，內(nèi)切β-l，4木聚糖酶酶分布在糖苷水解酶第5， 7，8,10,11，30,43等六個(gè)家族。截至目前，糖苷水解酶家族已達(dá)到131個(gè)（http:// www. cazy .org)，隨著木聚糖酶研究的發(fā)展，將可能會(huì)有更多新的木聚糖酶不斷被鑒定出 來。不同家族木聚糖酶的結(jié)構(gòu)、作用方式、酶學(xué)性質(zhì)及底物特異性都有很大區(qū)別。目前發(fā)現(xiàn) 的木聚糖酶基本都分布在第10和第11家族，其他家族的木聚糖酶數(shù)量極少。
[0005] 第10家族木聚糖酶一般具有較高分子量(大于30kD)，低等電點(diǎn)(pi)，常具有多結(jié) 構(gòu)域。其結(jié)構(gòu)是典型的(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出主要由α-螺旋和β-折疊重復(fù)出現(xiàn) 而構(gòu)成上面略大下面略小的形狀。在相應(yīng)的保守位置有相同的活性中心Glu，作催化反應(yīng)的 親核中心和酸/堿催化氨基酸，其催化機(jī)制為酸堿催化機(jī)制。第10家族木聚糖酶對短鏈的寡 聚木糖具有較高活性，揭示它們具有更小的底物結(jié)合位點(diǎn)。
[0006] 第11家族木聚糖酶的特點(diǎn)是低分子量(小于30kD)，常常只具有一個(gè)以β-折疊為主 的結(jié)構(gòu)域，具有較高等電點(diǎn)(ρ I)。其催化結(jié)構(gòu)域?yàn)棣?- j e 11 y r ο 11結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)β -折疊片和一 個(gè)螺旋形成，形似半握右拳狀，這個(gè)結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)β_折疊片層扭曲成近直角形狀，形成一 個(gè)深且狹長的溝縫狀結(jié)構(gòu)。其催化機(jī)制為雙交換機(jī)制，兩個(gè)Glu作為催化殘基，從裂縫兩側(cè) 伸入作為酶的活性中心，裂縫在反應(yīng)中作為底物結(jié)合區(qū)，其兩邊有多個(gè)芳香族氨基酸殘基， 并且至少提供四個(gè)木糖結(jié)合殘基。
[0007] 木聚糖酶，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、酵母、放線菌、反芻動(dòng)物瘤胃、蝸牛、甲殼動(dòng)物、 陸地植物組織和各種無脊椎動(dòng)物中，其中細(xì)菌來源的中性或堿性木聚糖酶具有較高的耐堿 性和熱穩(wěn)定性。木聚糖酶具有廣泛的應(yīng)用，在造紙工業(yè)中，可應(yīng)用于紙漿漂白、廢紙脫墨;在 飼料行業(yè)中，木聚糖酶可降低小麥型日糧水溶性木聚糖導(dǎo)致的食糜黏性增高，從而提高消 化酶對底物的作用效率，同時(shí)木聚糖酶可作用于不溶性非淀粉多糖，破碎植物細(xì)胞壁，并釋 放出營養(yǎng)物質(zhì);在釀酒和食品行業(yè)中應(yīng)用也非常廣泛，如木聚糖酶添加到面粉中，可以改善 面團(tuán)的持水性、穩(wěn)定性和對過度發(fā)酵的耐受性，提高入爐急漲性能，增大烘烤后面包的體 積，改善面包心質(zhì)地，降低面包的老化速率，延長貨架壽命。
[0008] 由于木聚糖酶在造紙、飼料、食品等工業(yè)上的特殊用途，對木聚糖酶進(jìn)行開發(fā)及研 究顯得非常重要。國際上已進(jìn)行了木聚糖酶工業(yè)應(yīng)用的開發(fā)，但僅有少量公司能生產(chǎn)用于 造紙工業(yè)的木聚糖酶，其耐堿度及耐熱性仍有提高空間；國內(nèi)目前尚無對耐熱耐堿性木聚 糖酶的系統(tǒng)性研究，也無法工業(yè)化生產(chǎn)耐熱耐堿性木聚糖酶。因此，尋找新的具有優(yōu)良性質(zhì) 的木聚糖酶對我國造紙工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種中性內(nèi)切木聚 糖酶XYN-H31基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本發(fā)明根據(jù)木聚糖酶保守序列設(shè)計(jì)簡并 引物，用PCR的方法成功克隆出中性內(nèi)切木聚糖酶的酶基因。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有上述XYN-H31基因的表達(dá)載體。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述XYN-H31基因的大腸桿菌菌株。
[0012]本發(fā)明的再一目的在于提供上述重組中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因，所述 XYN-H31基因的核苷酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0014]所述中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因序列為一個(gè)完整的開放閱讀框(0RF)，該開放 閱讀框以起始密碼子ATG開始而以終止密碼子TGA結(jié)束，共包括1380個(gè)核苷酸。其中，前66個(gè) 核苷酸為信號肽編碼序列。
[0015] 上述中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No:2 所示。
[0016]中性內(nèi)切木聚糖酶X Y N - Η 3 1基因開放閱讀框編碼4 5 9個(gè)氨基酸，其中， MPNDSLDRRKPPGWRALGRKAL序列(前22個(gè)氨基酸)為基因編碼的信號肽，其在成熟酶蛋白分泌 時(shí)在Leu 22位點(diǎn)被切除。因此，成熟的酶蛋白從Leu23開始，共計(jì)437個(gè)氨基酸，其理論分子量 (麗〇為46.91^)，酶蛋白的理論等電點(diǎn)(？1)為8.18。
[0017 ] -種含有本發(fā)明XYN-H31基因的表達(dá)載體。
[0018]所述的表達(dá)載體為適于在大腸桿菌中表達(dá)的載體。
[0019 ] 本發(fā)明的XYN-H31基因被插入至pET_28a (+)載體中。
[0020] 本發(fā)明的XYN-H31基因被插入至pET-28a( + )載體中的EcoR I和Xho頂每切位點(diǎn)之 間；
[0021] 含有本發(fā)明的XYN-H31基因的大腸桿菌菌株。
[0022] 所述的大腸桿菌菌株含有本發(fā)明的表達(dá)載體。
[0023] 一株表達(dá)中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31的菌株，是將上述核苷酸序列構(gòu)建成載體后 轉(zhuǎn)染到大腸桿菌(Escherichia coli，E. coli)BL21Star(DE3)得到。
[0024] 一株表達(dá)中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31的菌株的制備方法，包括如下步驟：
[0025] 用PCR方法從Streptomyces sp.H31(CCTCC No:M 2015003)的基因組0嫩中克隆出 酶基因全長，將其插入到原核表達(dá)載體pET-28a( + )中，得到重組質(zhì)粒pET-28a-XYN-H31，并 轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli(Escherichia coli)BL21 Star(DE3)菌株;經(jīng)過篩選后得到表達(dá)所述 的中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31的重組大腸桿菌菌株E. co 1 i BL21 Star (DE3) -XYN-H31;
[0026] 所述的PCR的所用的引物的序列：
[0027] 上游引物：5' -CCGGAATTCATGCCCAACGATTCGTTAGACAGGCGCAAG-37 ；
[0028](下劃線的序列表示的是EcoR頂每切位點(diǎn)）
[0029] 下游引物：5' -CCGCTCGAGTCAgtgatggtgatggtggtgGGAGACGGAACAGGCTCCGA-37 ；
[0030] (下劃線的序列表示的是Xho頂每切位點(diǎn)，小寫表示6 X His標(biāo)簽）
[0031]所述的PCR的反應(yīng)體系為：
[0032] 使用Takara的PCR Amplification Kit試劑盒，以Streptomyces sp.H31 的基因組 DNA為模板，按照如下反應(yīng)體系配制PCR反應(yīng)液：
[0033] ddH20 14yL;10XPCR Buffer 2.5yL;dNTP Mixture 2yL;上游引物2yL;下游引物 2此;模板2yL;Ex Taq酶0.5yL;Total 25yL/Sample(樣品）。
[0034] 所述的PCR的反應(yīng)條件為：
[0035] 94°C5min; 94°C30s，55°C30s，72°C1 · 5min，30 個(gè) Cycles; 72°C7min; 25°C 保持。
[0036] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0037] 根據(jù)酶基因序列BLAST分析結(jié)果結(jié)合酶蛋白在分子量、等電點(diǎn)及酶學(xué)特性等方面 與己知蛋白的差異判斷，中性內(nèi)切木聚糖酶基因 XYN-H31為一新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切β-l，4-木聚糖 酶基因。
【附圖說明】
[0038] 圖1是pMD-18T克隆載體圖譜。
[0039]圖2是pMD-18T克隆載體的多克隆位點(diǎn)圖。
[0040] 圖3是Streptomyces sp ·Η31菌基因組DNA電泳圖；其中：泳道Μ為takara公司的 DL15000Marker;泳道 1、2為基因組 DNA。
[0041]圖4是中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因保守序列PCR結(jié)果的電泳圖；其中：泳道Μ為 takara公司的DL2000Marker;泳道4為ΧΥΝ-Η31基因保守DNA序列。
[0042] 圖5是中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因的保守DNA序列與Genbank基因序列比對結(jié) 果，截取了其中相似性最高的序列的結(jié)果圖。
[0043] 圖6是中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因的保守DNA序列的上游PCR結(jié)果的電泳圖；其 中：泳道Μ為takara公司的DL2000Marker;泳道4為XYN-H31基因的保守DNA序列的上游PCR結(jié) 果。
[0044] 圖7是中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31基因的保守DNA序列的下游PCR結(jié)果的電泳圖；其 中：泳道Μ為takara公司的DL2000Marker;泳道2為XYN-H31基因的保守DNA序列的下游PCR結(jié) 果。
[0045] 圖8是中性內(nèi)切木聚糖酶XYN-H31與Genbank氨基酸序列比對結(jié)果，截取了其中相 似性最高的序列的結(jié)果圖。
[0046] 圖9是pET_28a( + )表達(dá)載體圖譜。
[0047]圖10是pET_28a( + )表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)圖。