成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽在制備肝纖維化治療藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的一種新用途，即成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子-21成熟肽在制備肝纖維化治療藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外間質(zhì) 成分（ECM)過(guò)度異常地沉積，從而影響肝臟的功能，是慢性肝損傷共有的病理反應(yīng)，最終將 導(dǎo)致肝硬化、門靜脈高壓癥、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等。
[0003] 肝纖維化的病因很多，如乙肝病毒感染、脂肪肝、長(zhǎng)期飲酒及藥物等長(zhǎng)期持續(xù)損害 肝臟，都將導(dǎo)致肝纖維化形成。在這些肝纖維化的誘因中，單純乙肝患者就已經(jīng)超過(guò)2500 萬(wàn)，而脂肪肝的發(fā)病率更高，2013年的統(tǒng)計(jì)表明北京地區(qū)脂肪肝的發(fā)病率為13%，這些疾 病最終都可能發(fā)展成為肝纖維化，所以肝纖維化的發(fā)病率非常高，治療肝纖維化的藥物市 場(chǎng)十分巨大。
[0004] 目前尚沒(méi)有治療肝纖維化的理想藥物，正如著名肝臟病學(xué)家Hans Popper所 說(shuō)："誰(shuí)能阻止或減緩肝纖維化的發(fā)生，誰(shuí)就將會(huì)治愈大多數(shù)慢性肝病"。因此，研究治療肝 纖維化的藥物成為全世界醫(yī)藥工作者的競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)之一。
[0005] 肝星狀細(xì)胞（HSC)是肝內(nèi)一種具有多功能、變化不定的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，HSC活化是 肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。研究證實(shí)，HSC是ECM的主要來(lái)源，HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖 維細(xì)胞樣細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化。HSC活化分啟動(dòng)與持續(xù)2個(gè)階段。啟動(dòng)主要依賴旁 分泌機(jī)制，肝損傷后造成肝細(xì)胞凋亡，凋亡小體激活庫(kù)普弗細(xì)胞與血小板分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子-β (TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF)等細(xì)胞因子、趨化因子，同時(shí)受損肝細(xì)胞與內(nèi) 皮細(xì)胞釋放各種HSC刺激因子（如成纖維細(xì)胞因子、TGF-β、IGF-1、TNF-α、IL-1、IL-6)， 共同介導(dǎo)HSC被激活并轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，肌纖維母細(xì)胞可以自分泌TGF- β等因子，進(jìn) 而導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積和纖維化。其中，HSC激活過(guò)程中，TGF-β、TOGF以及TNF-a、IL-1、 IL-6等炎癥因子起關(guān)鍵作用。因此，抑制TGF- β、PDGF表達(dá)和抑制炎癥反應(yīng)是治療肝纖維 化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽在制備肝纖維化治療 和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)一種治療和/或預(yù)防肝纖維化的藥物，其活性成分為成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子-21成熟肽。所述藥物還包括其它藥學(xué)上可接受的載體或輔料。所述藥物中，除了 所述活性成分外，可以添加藥學(xué)上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體、增效劑和添加劑等。所述藥物的給藥形態(tài)可為針劑（如粉劑、水劑、油劑）。所述制劑都 可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知常用的制備方法而獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、 靜脈注射或肌肉注射。
[0008] 以上任一所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽為如下（a)或（b):
[0009] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] (b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且具有治療和/或預(yù)防肝纖維化的功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0011] 所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽對(duì)肝纖維化的治療作用體現(xiàn)為（c 1)至（c8) 中的至少一種：
[0012] (cl)抑制肝纖維化程度；
[0013] (c2)抑制肝纖維化發(fā)生；
[0014] (c3)降低肝臟中膠原纖維和/或肌纖維的水平；
[0015] (c4)降低肝臟中羥脯氨酸的水平；
[0016] (c5)降低肝臟中I型膠原蛋白和/或α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的水平；
[0017] (c6)降低肝臟中IL-6和/或TNF- α和/或IL-1 β的水平；
[0018] (c7)降低血液中IL-6和/或TNF- α和/或IL-1 β的水平；
[0019] (c8)降低肝臟中TGF-β和/或磷酸化Smad2/3的水平。
[0020] 以上任一所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽具體可采用包括如下步驟的方法 制備：
[0021] (1)表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白；
[0022] (2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 成熟肽。
[0023] 所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白（即分子伴侶SUM0)。
[0024] 所述"表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽與分子伴侶的融合蛋白"的實(shí)現(xiàn) 方法如下：將所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的編碼基因插入原核表達(dá)載體pSUMO,得到重組 質(zhì)粒；將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta (DE3)，得到重組菌；發(fā)酵所述重組菌并采用 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到所述融合蛋白。
[0025] 所述"切除所述分子伴侶"的實(shí)現(xiàn)方式如下：取所述融合蛋白，用SUM0蛋白酶 I (SUM0蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比具體可為1:50)和DTT (所述DTT的初始濃度可為 2mmol/L)切割（切割條件具體可為4°C切割過(guò)夜）。
[0026] 所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽的編碼基因具體可為如下1)或2)或3)的 DNA分子：
[0027] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0028] 2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分 子；
[0029] 3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA 分子。
[0030] 所述嚴(yán)格條件為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜 交并洗膜。
[0031] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21成熟肽能夠有效抑制肝纖維化的發(fā)生，可作 為藥物治療和/或預(yù)防肝纖維化，對(duì)于肝纖維化的治療和預(yù)防具有重大價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為FGF-21成熟肽溶液的聚丙烯凝膠電泳圖。
[0033] 圖2為HE染色和Masson染色結(jié)果。
[0034] 圖3為Masson染色的表面密度。
[0035] 圖4為羥脯氨酸含量結(jié)果。
[0036] 圖5為I型膠原蛋白基因和α -平滑肌肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)水平，I型膠原蛋白 和α -平滑肌肌動(dòng)蛋白相對(duì)β -actin蛋白的蛋白水平。
[0037] 圖6為IL-6基因、TNF-α基因和IL-Ιβ基因的表達(dá)水平，IL-6、TNF_a和IL-Ιβ 含量。
[0038] 圖7為TGF-β基因的表達(dá)水平，TGF-β蛋白相對(duì)β -actin蛋白的蛋白水平和磷 酸化Smad2/3蛋白相對(duì)Smad2/3蛋白的蛋白水平。
[0039] 圖8為pIKB相對(duì)IKB的蛋白水平和NF-KB p65相對(duì)Lamin-bl的蛋白水平。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0041] FGF-21蛋白的成熟肽，簡(jiǎn)稱FGF-21成熟肽，如序列表的序列1所示。FGF-21成熟 肽的編碼基因如序列表的序列2所示。
[0042] 原核表達(dá)載體pSUMO(在文獻(xiàn)中被稱為"pHisSUMO"）：參考文獻(xiàn)：姜媛媛，尹成凱， 李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUM0融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性重組蛋白的研究.東 北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 39(10) :57-62 ;李璐，尹成凱，李德山.高效表達(dá)可溶性重組蛋白 表達(dá)載體--pHisSUMO.生物技術(shù)，2009, 19(3) : 11-14.。
[0043] 大腸桿菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)CD801。
[0044] 雄性昆明小鼠：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所試驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0045] 二甲基亞硝胺：Sigma_Aldrich 公司；CAS 號(hào) 62-75-9。
[0046] 羥脯氨酸測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；產(chǎn)品編號(hào)A030-2。
[0047] PBS緩沖液（pH 7. 2):溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：NaCl 137mmol/L， KC12. 7mmol/L, Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L〇
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