本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及喹唑啉化合物在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)具有自我更新和多向分化潛能，能分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞等。神經(jīng)干細(xì)胞的分化技術(shù)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病或遺傳性代謝疾病、神經(jīng)退行性疾病等疾病提供了新的治療策略。因此調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的增殖和分化成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點。

目前，國內(nèi)外通用的體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的方法是給予絲裂原，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及表皮生長因子(epidermalgrowth factor，EGF)等，干預(yù)維持培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，使其處于增殖狀態(tài)，除去絲裂原并添加含胎牛血清的培養(yǎng)基后，誘導(dǎo)NSCs進(jìn)行分化，但這種方法較為繁瑣，神經(jīng)干細(xì)胞難以獲得和培養(yǎng)，而且所得到的分化細(xì)胞主要是膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元比例較低。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow stroma cells，BMSCs)是一類具有自我更新能力的多潛能干細(xì)胞，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)。相比與神經(jīng)干細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞更易獲取和調(diào)控分化，組織相容性好。國內(nèi)外報道先后報道利用小分子化合物誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化獲得神經(jīng)元細(xì)胞。所使用的小分子有叔丁基對羥基茴香醚(Butylatedhydroxyarisol，BHA)、PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)/AKT抑制劑LY294002等。但這些誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)率還有待提高，且機(jī)理尚不明確。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種能夠高效調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，用于修復(fù)神經(jīng)損傷和治療神經(jīng)退行性疾病、以及用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠高效調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，用于修復(fù)神經(jīng)損傷和治療神經(jīng)退行性疾病、以及用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。

本發(fā)明第一方面提供了一種式I化合物、其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽，

式中，

R₁和R₂各自獨立地選自下組：

(i)H；

(i i)取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀鏈烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀鏈炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀環(huán)烷基；其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、C₁－C₃羧基、-R₄-R₅基團(tuán)、－NR₆(R₇)、未取代的苯基、或被C₁-C₃烷基或鹵素取代的苯基；

(iii)取代或未取代的C₅-C₂₀芳基、取代或未取代的C₃-C₂₀雜芳基、取代或未取代的5-20元雜環(huán)基、取代或未取代的C₁₀－C₃₀的稠環(huán)基；其中，所述雜芳基或雜環(huán)基含有1至3個選自N、O、S的雜原子，并且所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、－NR₆(R₇)；

其中R₄選自未取代的或鹵代的C₁－C₈亞烷基，而R₅選自未取代的或鹵代的C₅－C₂₀芳基；R₆和R₇各自獨立地為氫、未取代或鹵代的C₁-C₁₀烷基、未取代或鹵代的C₂-C₁₀鏈烯基、未取代或鹵代的C₂-C₁₀炔基；

或者，R₁與R₂可以和相連的N原子共同形成含有至少1個氮原子的、取代或未取代的3－8元雜環(huán)基，并且所述的3－8元雜環(huán)基中共含有1-3個選自N、O、S的雜原子，其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀鏈烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、-NH₂、C₁－C₃羧基；

以及R₃選自下組：H、取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀鏈烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀環(huán)烷基；其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、-NH₂。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素包括F、Cl、Br或I。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素為F或Br。

在另一優(yōu)選例中，所述化合物具有式Ia所示的結(jié)構(gòu)：

式中，R₁和R₂的定義如上所述。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂各自獨立地選自下組：

(i)H；

(ii)取代或未取代的C₂-C₈烷基、取代或未取代的C₂－C₈鏈烯基、取代或未取代的C₂-C₈炔基、取代或未取代的C₄-C₈環(huán)烷基；其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、C₁－C₃羧基、-R₄-R₅基團(tuán)、－NR₆(R₇)、未取代的苯基、或被C₁-C₃烷基或鹵素取代的苯基；

(iii)取代或未取代的C₅-C₁₀芳基、取代或未取代的C₃-C₁₀雜芳基、取代或未取代的5-10元雜環(huán)基、取代或未取代的C₁₀－C₂₀的稠環(huán)基；其中，所述雜芳基或雜環(huán)基含有1至3個選自N、O、S的雜原子，并且所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、－NR₆(R₇)；

其中R₄選自未取代的或鹵代的C₁－C₆亞烷基，而R₅選自未取代的或鹵代的C₅－C₁₀芳基；R₆和R₇各自獨立地為氫、未取代或鹵代的C₁-C₆烷基、未取代或鹵代的C₂-C₆鏈烯基、未取代或鹵代的C₂-C₆炔基；

或者，R₁與R₂可以和相連的N原子共同形成含有至少1個氮原子的、取代或未取代的3－8元雜環(huán)基，并且所述的3－8元雜環(huán)基中共含有1-2個選自N、O、S的雜原子，其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆鏈烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆鹵代烷基、C₁-C₆鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、-NH₂、C₁－C₃羧基。

在另一優(yōu)選例中，R₁選自下組：H、甲基、乙基、苯基、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，R₂選自下組：H、甲基、乙基、丙基、丁基、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，R₁和R₂和相連的N原子共同形成吡咯烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、環(huán)己亞胺環(huán)、1,3-二氮雜卓環(huán)、或1,4-二氮雜卓環(huán)。

在另一優(yōu)選例中，R₁、R₂、R₃為實施例中各具體化合物相對應(yīng)的具體基團(tuán)。

在另一優(yōu)選例中，R₄、R₅、R₆、R₇為實施例中各具體化合物相對應(yīng)的具體基團(tuán)。

在另一優(yōu)選例中，所述化合物為實施例中制備的各具體化合物，優(yōu)選的化合物選自下組：

在另一優(yōu)選例中，所述化合物選自下組：

本發(fā)明第二方面提供了一種式I化合物、其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途，用于制備藥物或制劑，所述藥物或制劑用于(i)治療神經(jīng)退行性疾?。?ii)修復(fù)神經(jīng)損傷；和/或(iii)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物或制劑還可用于(i)調(diào)控(包括上調(diào)或下調(diào))nestin的表達(dá)；和/或(ii)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

本發(fā)明第三方面提供了一種藥物組合物，包括：

(i)本發(fā)明第一方面所述的式I化合物，其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽；和

(ii)藥學(xué)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有治療有效量或安全有效量的式I化合物，其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在另一優(yōu)選例中，所述前藥包括酯類化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物中，含有0.0001-99wt％(較佳地0.01-90wt％，更佳地，0.1-80wt％)的組分(i)，以藥物組合物的總重量計。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于制備神經(jīng)干細(xì)胞增殖或分化的調(diào)控劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于(i)修復(fù)神經(jīng)損傷；(ii)治療和/或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病；和/或(iii)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。

在另一優(yōu)選例中，所述神經(jīng)退行性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、牛海綿狀腦病、克雅二氏病、小腦萎縮癥、多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性側(cè)索硬化、脊髓性肌萎縮癥、或其組合。

本發(fā)明第四方面提供了一種式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制法，包括步驟：

在惰性溶劑中，在堿的存在下，將化合物6和式II所示的胺進(jìn)行反應(yīng)，從而得到式I化合物；

各式中，R₁、R₂和R₃如本發(fā)明第一方面中所定義。

在另一優(yōu)選例中，R₃為C₁-C₁₀烷基，如甲基。

在另一優(yōu)選例中，所述惰性溶劑包括極性溶劑。

在另一優(yōu)選例中，所述惰性溶劑選自下組：N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、四氫呋喃、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述堿選自下組：碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸銫、氫化鈉、氫氧化鈉、氫化鈉、三乙胺、二異丙胺乙基胺、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述胺選自下組：正丁胺、二乙基胺、吡咯烷、哌啶、嗎啉、芐基胺、鄰位取代苯胺、間位取代苯胺、對位取代苯胺、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述化合物6由如下方法制備：

(a)在堿存在下，將化合物5與三氯氧磷進(jìn)行反應(yīng)，從而得到化合物5a；

(b)將化合物5a與氨水進(jìn)行反應(yīng)，從而得到化合物6；

各式中，R₃如本發(fā)明第一方面中所定義。

在另一優(yōu)選例中，R₃為C₁-C₁₀烷基，如甲基。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述堿選自下組：N,N-二甲基苯胺。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述反應(yīng)溫度40－150℃，更佳地，50-140℃，更佳地，90-110℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述反應(yīng)時間0.1－15h，較佳地，1-10h，更佳地，1-4h。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述反應(yīng)溫度0℃－150℃，較佳地，10-100℃，更佳地，15-50℃。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，所述反應(yīng)時間0.1-15h，較佳地，1-13h，更佳地，1-10h。

本發(fā)明第五方面提供了一種中間體化合物，所述中間體化合物選自下組：

本發(fā)明第六方面提供了一種用于治療神經(jīng)退行性疾病的方法，所述方法包括:

向所需對象施用本發(fā)明第一方面所述的式I化合物或本發(fā)明第三方面所述的藥物組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述對象包括人。

在另一優(yōu)選例中，所述對象包括非人哺乳動物。

在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動物包括嚙齒動物，如小鼠、大鼠。

在另一優(yōu)選例中，施用劑量為10-10000mg/kg/天，較佳地，50-10000mg/kg/天，更佳地，100-1000mg/kg/天。

在另一優(yōu)選例中，施用頻率為1-5次/天，較佳地，1-2次/天。

在另一優(yōu)選例中，施用包括一個或多個周期，各周期為2-30天，較佳地，3-7天。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了雙報告基因平臺的篩選結(jié)果。

圖2顯示了對雙報告基因篩選平臺篩選的結(jié)果進(jìn)行驗證。

圖3顯示了化合物Yhhu-3477、Yhhu-3481促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，使Tuj-1陽性細(xì)胞比例增加。

圖4顯示了化合物Yhhu-3477和Yhhu-3481可劑量依賴性地增加Tuj-1的表達(dá)。

圖5顯示了化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792可以提高Tuj-1和GFAP的表達(dá)水平。

圖6顯示了化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

圖7顯示了化合物Yhhu-3792促使BrdU陽性細(xì)胞比例增加。

圖8顯示了化合物Yhhu-3792促進(jìn)BrdU+/Tuj-1+及BrdU+/GFAP+細(xì)胞數(shù)量增加。

圖9顯示了化合物Yhhu-3792促進(jìn)Notch-1表達(dá)。

圖10顯示了化合物Yhhu-3792使核內(nèi)NICD增加。

圖11顯示了化合物Yhhu-3792對SHH信號通路無明顯影響。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，合成了一系列的喹唑啉化合物，所述的化合物能夠高效調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，用于修復(fù)神經(jīng)損傷和治療神經(jīng)退 行性疾病、以及用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。

基團(tuán)定義

如本文所用，術(shù)語“取代或未取代的”指所述基團(tuán)可以是未取代的，或者所述基團(tuán)中的H被一個或多個(如1-10個，較佳地1-5個，更佳地1-3個，最佳地，1-2個)取代基所取代。

如本文所用，所述的“取代”或“取代的”指所述基團(tuán)具有一個或多個(較佳地1-6個，更佳地1-3個)選自下組的取代基：鹵素、羥基、-NH₂、硝基、-CN、C₁-C₄烷基、C₁-C₄鹵代烷基、C₁-C₄烷氧基、C₃-C₆環(huán)烷基、C₁-C₃羧基、C₂-C₄鏈烯基、C₂-C₄炔基、苯基、芐基。

如本文所用，術(shù)語“C₁-C₁₀烷基”是指具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、或類似基團(tuán)；其中，術(shù)語“C₁-C₃烷基”是指具有1-3個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₃-C₁₀環(huán)烷基”指具有3-10個碳原子的環(huán)狀烷基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₁-C₁₀亞烷基”指具有1-10個碳原子的二價烴基，如，亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₂-C₁₀鏈烯基”或“C₂-C₈鏈烯基”分別指具有2-10個或2-8個碳原子的直鏈或支鏈的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₂-C₁₀鏈炔基”是指具有2-10個碳原子的直鏈或支鏈的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₂-C₈鏈炔基”是指具有2-8個碳原子的直鏈或支鏈的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₅-C₂₀芳基”指5至20個(較佳5-14個)碳原子的單價芳香族碳環(huán)基團(tuán)，它具有單環(huán)(如苯基)或稠環(huán)(如萘基或蒽基)，如果連接點在芳香碳原上，稠環(huán)可能是非芳香性的(如2-苯并噁唑酮，2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)。所述取代或未取代的C₅－C₂₀芳基選自下組：鄰位取代苯基、間位取代苯基、對位取代苯基。優(yōu)選的芳基包括苯基和萘基。該術(shù)語包括取代或未取代的形式，其中取代基的定義如上。所述取代苯基的取代基選自下組：鹵素、羥基、甲基、乙基、異丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、三氟甲基、或其組合。

如本文所用，術(shù)語“C₅-C₂₀雜芳基”指具有5至20個碳原子和1至4個選自氧、氮和硫的雜原子的芳香基團(tuán)，這樣的雜芳基可以是單環(huán)的(如吡啶基或呋喃基)或稠環(huán)(如吲嗪基(indolizinyl)或苯并噻吩基)，其中，所述稠環(huán)可以是非芳香性的和/或含有一個雜原子，只要連接點是通過芳香性雜芳基的原子。優(yōu)選地雜芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。該術(shù)語包括取代或未取代的雜芳基。

如本文所用，術(shù)語“C₅-C₂₀雜環(huán)基”指飽和的、部分飽和的或不飽和的基團(tuán)(但不是芳香性的)，具有單環(huán)或稠環(huán)(包括橋環(huán)體系和螺環(huán)體系，具有5至20 個碳原子和1至4個選自氮、硫或氧的雜原子，在稠環(huán)體系中，一個或多個環(huán)可以是環(huán)烷基、芳基或雜芳基，只要連接點通過非芳香性環(huán)。該術(shù)語包括取代或未取代的雜環(huán)基。

如本文所用，術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴、或碘，優(yōu)選氟、氯和溴。

如本文所用，術(shù)語“鹵代的”指被相同或不同的一個或多個上述鹵原子取代的基團(tuán)，可以部分鹵代或全部鹵代，例如三氟甲基、五氟乙基、七氟異丙基、或類似基團(tuán)。

如本文所用，術(shù)語“C₁-C₃鹵代烷基”是指氫被1個或1個以上的鹵素取代的具有1-3個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如，鹵代甲基、鹵代乙基、鹵代丙基、鹵代異丙基、或類似基團(tuán)，優(yōu)選三氟甲基。

本發(fā)明的化合物可以含有一個或多個不對稱中心，并因此以消旋體、外消旋混合物、單一對映體、非對映異構(gòu)體化合物和單一非對映體的形式出現(xiàn)?？梢源嬖诘牟粚ΨQ中心，取決于分子上各種取代基的性質(zhì)。每個這種不對稱中心將獨立地產(chǎn)生兩個旋光異構(gòu)體，并且所有可能的旋光異構(gòu)體和非對映體混合物和純或部分純的化合物包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明包括化合物的所有異構(gòu)形式。

本文中，術(shù)語“室溫”指4-40℃，優(yōu)選為20-25℃。

本發(fā)明的化合物

如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明化合物”指通式I(或式Ia)化合物、其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽。

典型地，本發(fā)明提供通式I化合物、其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽。

式中，

R₁和R₂各自獨立地選自下組：

(i)H；

(ii)取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀鏈烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀環(huán)烷基；其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、C₁－C₃羧基、-R₄-R₅基團(tuán)、－NR₆(R₇)、未取代的苯基、或被C₁-C3烷基或鹵素取代的苯基；

(iii)取代或未取代的C₅-C₂₀芳基、取代或未取代的C₃-C₂₀雜芳基、取代或未取代的5-20元雜環(huán)基、取代或未取代的C₁₀－C₃₀的稠環(huán)基；其中，所述雜芳基或雜環(huán)基含有1至3個選自N、O、S的雜原子，并且所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、－NR₆(R₇)；

其中R₄選自未取代的或鹵代的C₁－C₈亞烷基，而R₅選自未取代的或鹵代的 C₅－C₂₀芳基；R₆和R₇各自獨立地為氫、未取代或鹵代的C₁-C₁₀烷基、未取代或鹵代的C₂-C₁₀鏈烯基、未取代或鹵代的C₂-C₁₀炔基；

或者，R₁與R₂可以和相連的N原子共同形成含有至少1個氮原子的、取代或未取代的3－8元雜環(huán)基，并且所述的3－8元雜環(huán)基中共含有1-3個選自N、O、S的雜原子，其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀鏈烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、硝基、-NH₂、C₁－C₃羧基；

以及R₃選自下組：H、取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀鏈烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀環(huán)烷基；其中所述的取代為具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀鹵代烷基、C₁-C₁₀鹵代烷氧基、-OH、-CN、-NH₂。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素包括F、Cl、或Br。

在另一優(yōu)選例中，所述的鹵素為F或Br。

在另一優(yōu)選例中，所述化合物具有式Ia所示的結(jié)構(gòu)：

式中，R₁和R₂的定義如上所述。

在本發(fā)明所述的化合物有立體異構(gòu)體存在的情況下，本發(fā)明包括化合物的所有立體異構(gòu)體。

在本發(fā)明所述的化合物有互變異構(gòu)體存在的情況下，本發(fā)明包括化合物的所有互變異構(gòu)體。

本發(fā)明還包括所述化合物中的任何一個或多個氫原子被其穩(wěn)定同位素氘取代而產(chǎn)生的氘代化合物。

本發(fā)明的中間體化合物

如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的中間體化合物”是指化合物2，3，4，5，5a,6，優(yōu)選下述中間體化合物：

本發(fā)明化合物的制備方法

本發(fā)明提供了式I化合物的制備方法，本發(fā)明中的化合物可以通過多種合成操作容易地制備，這些操作是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟練掌握的。這些化合物的示例性制備方法可以包括(但不限于)下文所述的流程。

通常，在本發(fā)明的制備方法中，各反應(yīng)大多在-20℃至160℃(或回流溫度)(較佳地，-5℃至100℃，或0-80℃)下，進(jìn)行一段時間(如0.1-72小時，較 佳地0.5-24小時)。

較佳地，本發(fā)明式(I)化合物可以通過以下方案及實施例中所述的示例性方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的相關(guān)公開文獻(xiàn)操作完成。

在具體操作過程中，可以根據(jù)需要對方法中的步驟進(jìn)行擴(kuò)展或合并。

方案(R₃＝C₁-C₁₀烷基，優(yōu)選甲基)

其中，R₁和R₂如說明書中所定義。

步驟1中，在堿(如碳酸鉀)存在下，在極性溶劑(如DMF、DMSO)中，化合物1與3-甲氧基苯酚在一定溫度下(如90℃—100℃)進(jìn)行親核取代反應(yīng)一段時間，形成化合物2。

步驟2中，在堿(如碳酸鉀)存在下，在惰性溶劑(如DMSO)中，化合物2與過氧化氫在一定溫度下(如20℃—40℃)進(jìn)行反應(yīng)一段時間，形成化合物3；

步驟3中，在酸(如鹽酸)存在下，在惰性溶劑(如THF)中，化合物3在一定溫度下(如40℃—60℃)經(jīng)過水解反應(yīng)一段時間，形成化合物4；

步驟4中，在惰性溶劑(如THF)中，化合物4與三光氣在一定溫度下(如65℃—70℃)進(jìn)行環(huán)合反應(yīng)一段時間，形成化合物5；

步驟5中，在堿(如N,N-二甲基苯胺)存在下,先將化合物5與三氯氧磷在一定溫度下(如90℃—110℃)進(jìn)行氯代反應(yīng)一段時間，形成化合物5a，再將化合物5a與氨水室溫反應(yīng)一段時間，形成化合物6；

步驟6中，在惰性溶劑(如四氫呋喃)中，化合物6與式II所示的胺(在一定溫度下(如130℃-160℃)進(jìn)行反應(yīng)一段時間，形式式I化合物。

本發(fā)明公開的式I化合物以及化合物的制備方法、藥物組成和治療方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含安全有效量范圍內(nèi)的活性成分，以及藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明所述的“活性成分”是指本發(fā)明所述的通式I化合物、其光學(xué)異構(gòu)體、水合物、溶劑化物、其前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明所述的“活性成分”和藥物組合物可用作神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控劑。在另一優(yōu)選例中，用于制備用于修復(fù)神經(jīng)損傷和治療神經(jīng)退行性疾病、以及用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述神經(jīng)退行性疾病選自下組：阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有1-2000mg活性成分/劑，更佳地，含有10-200mg活性成分/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個藥片。

“藥學(xué)上可接受的載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和本發(fā)明的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低活性成分的藥效。

本發(fā)明優(yōu)選實施例的化合物可以作為單獨活性藥劑給藥，也可以與一個或多個其它用于治療神經(jīng)退行性疾病的試劑組合使用。本發(fā)明優(yōu)選實施例的化合物與已知的治療劑組合使用也是有效的，目前已知的化合物和其它治療神經(jīng)退行性疾病的治療劑的組合在優(yōu)選實施例范圍之內(nèi)?；谒幬锏奶厥庑再|(zhì)和所涉及的疾病，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠辨別有效的藥劑組合。這種治療神經(jīng)退行性疾病的治療劑包括(但不限于)如下：阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥等。優(yōu)選實施例的化合物與治療神經(jīng)退行性疾病的治療劑同時施用時也有效。

通常，優(yōu)選實施例的化合物將以治療有效量、通過具有類似作用的藥劑的任意一種可接受的模式施用。優(yōu)選實施例的化合物(即活性成分)的實際用量根據(jù)多個因素確定，如待治療疾病的嚴(yán)重程度、患者的年齡和相對健康程度、被使用化合物的效力、施用的路徑和形式，以及其他因素。該藥物可一天施用多次，優(yōu)選地，每天一次或兩次。所有這些因素都在主治醫(yī)生的考慮范圍內(nèi)。

優(yōu)選實施例的目的，治療有效劑量通?？梢允菍颊咭淮涡允┯没蚍执问┯玫拿咳湛倓┝?，例如，每日約0.001至約1000毫克/公斤體重，優(yōu)選地，每日約1.0至約30毫克/千克體重。單位劑量組合物(Dosage unit composition)可包含其劑量因數(shù)以形成每日劑量。劑型的選擇取決于各種因素，例如給藥模式和藥物物質(zhì)的生物利用度。通常，優(yōu)選實施例的化合物可作為藥物組合物通過以下任意一種路線給藥：口服、全身給藥(如透皮、鼻內(nèi)或通過栓劑)、或腸外給藥(如肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。優(yōu)選的給藥方式為口服，可根據(jù)苦的程度調(diào)節(jié)方便的日劑量。組合物可采取的形式為片劑、丸劑、膠囊、半固體、粉劑、緩釋制劑、溶液、懸浮液、酏劑、氣霧劑或任何其他適當(dāng)?shù)慕M合物。另一種優(yōu)選的施用優(yōu)選實施例化合物的方式為吸入。這是一種將治療劑直接運送給呼吸道的有效方法(參見，如美國專利號5,607,915)。

合適的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括：如處理劑和藥物運送改性劑和促進(jìn)劑，諸如磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、單糖、二糖、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、葡萄糖、羥丙基-B-環(huán)糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點蠟、離子交換樹脂等，及其任意兩種或多種的組合。液體和半固體的賦 形劑可以選自甘油、丙二醇、水、乙醇和各種油，包括石油、動物油、植物油或合成來源，如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。優(yōu)選的液體載體，特別是用于可注射溶液的載體，包括水、鹽水、葡萄糖水性溶液和乙二醇。其它適宜的藥學(xué)上可接受的賦形劑在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences),Mack Pub.Co.,新澤西(1991)有描述，通過引用納入本文。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指通式I化合物的非毒性酸或堿土金屬鹽。這些鹽可在最終分離和純化通式I化合物時原位制得、或分別將合適的有機(jī)或無機(jī)酸或堿與堿性或酸性官能團(tuán)反應(yīng)制得。代表性的鹽包括，但不限于：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘基磺酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、硫氰酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。此外，含氮的堿性基團(tuán)可被如下試劑季銨鹽化：烷基鹵化物，如甲基、乙基、丙基、丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸鹽，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；長鏈鹵化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基鹵化物如芐基和苯乙基溴化物等。由此得到水溶性或油溶性或可分散產(chǎn)品?？杀挥糜谛纬伤帉W(xué)上可接受的酸加成鹽的酸的例子包括如鹽酸、硫酸、磷酸的無機(jī)酸，和如草酸、馬來酸、甲磺酸、琥珀酸、檸檬酸的有機(jī)酸。堿加成鹽可在最終分離和純化通式I的化合物時原位制得、或使羧酸部分分別與合適的堿(如藥學(xué)上可接受的金屬陽離子的氫氧化物，碳酸鹽或碳酸氫鹽)或氨、或有機(jī)伯、仲或叔胺反應(yīng)制得。藥學(xué)上可接受的鹽包括，但不限于，基于堿金屬和堿土金屬的陽離子，如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂、鋁的鹽等，以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，包括，但不限于：銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。其它代表性的用于形成堿加成鹽的有機(jī)胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。

如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的前藥”是指那些優(yōu)選實施例的化合物的前藥，在體內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化為上述通式所示的母體化合物的化合物，例如在血液中水解。在“T.Higuchi和V.Stella，作為新型運送系統(tǒng)的前藥(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)，A.C.S.15Symposium Series的14卷”和“Edward B.Roche編，藥物設(shè)計中的生物可逆載體(Bioreversible Carriers in Drug Design)，美國藥學(xué)協(xié)會和Pergamon出版社，1987年”中提供了完整的討論，這兩者都引入本文作為參考。

神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Nestin

本發(fā)明還提供了式I化合物在調(diào)控Nestin表達(dá)方面的應(yīng)用。

Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。Nestin的上調(diào)和下調(diào)均能影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。

在本發(fā)明中，大部分的化合物對Nestin的表達(dá)具有上調(diào)作用，只有少數(shù)化合物(如yhhu-3791和yhhu-3792)對Nestin的表達(dá)具有下調(diào)作用。

本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：

(1)提供一種結(jié)構(gòu)新穎的通式I化合物；

(2)本發(fā)明的化合物可以作為高效的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控劑；

(3)合成方法溫和，操作簡單易行，收率較高，易于衍生化，適合工業(yè)放大量生產(chǎn)；

(4)能夠用于修復(fù)神經(jīng)損傷、治療神經(jīng)退行性疾病、以及用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

制備實施例

實施例1化合物2的制備：

將化合物1(5g,28.1mmol)、3-甲氧基苯酚(3.39mL,30.9mmol)和碳酸鉀(7.74g,56.1mmol)置于DMF(50mL)中攪拌，并升溫至95℃，反應(yīng)12小時，反應(yīng)完全。將DMF蒸干后，加入水(80mL)稀釋，并以乙酸乙酯(80mL×3)萃取。收集有機(jī)層后，蒸干，并以乙醚洗滌，所得固體即為化合物15.7g。產(chǎn)率：72％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.28(s,3H),3.80(s,3H),6.59(d,J＝8.53Hz,1H),6.62-6.69(m,2H),6.72-6.82(m,1H),7.26-7.33(m,1H),7.42(t,J＝8.39Hz,1H),7.67(br.s.,1H),8.10(d,J＝8.25Hz,1H).

實施例2化合物3的制備

將化合物2(5g,17.7mmol)、碳酸鉀(0.37g,2.64mmol)加至25mL DMSO中攪拌。冰浴下，向該混合液中逐滴滴加過氧化氫水溶液(30％,4mL,35.4mL)，并在室溫下反應(yīng)過夜，即反應(yīng)完全。加入水(80mL)稀釋，并以乙酸乙酯(100mL×3)萃取。收集有機(jī)層，并以飽和亞硫酸鈉水溶液(80mL)洗滌。蒸干有機(jī)層， 得化合物35.2g。固體，產(chǎn)率：98％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.21(s,3H),3.78(s,3H),5.89(br.s.,1H),6.73(ddd,J＝9.15,1.44,1.24Hz,1H),7.23-7.31(m,2H),7.35(t,J＝8.39Hz,1H),7.61(br.s.,1H),8.44(d,J＝8.53Hz,1H),11.77(br.s.,1H).

實施例3化合物4的制備

將3(5g,16.6mmol)溶于四氫呋喃(20mL)和鹽酸水溶液(3N,20mL)的混合溶液中，50℃下攪拌6小時，反應(yīng)完全。加入60mL水稀釋，并用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9，以二氯甲烷(80mL×3)萃取。收集有機(jī)層并蒸干，得到化合物43.4g。固體，產(chǎn)率：85％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.78(s,3H),5.63(br.s.,1H),6.02-6.18(m,3H),6.42(dd,J＝8.25,1.10Hz,1H),6.55-6.66(m,2H),6.67-6.75(m,1H),7.04(t,J＝8.11Hz,1H),7.20-7.29(m,2H),7.49(br.s.,1H).

實施例4化合物5的制備

冰浴下，將三光氣(2.8g,9.29mmol)的無水四氫呋喃溶液(10mL)滴加至4(3g,11.6mmol)的無水四氫呋喃溶液(20mL)中，并升溫至70℃，攪拌24小時，反應(yīng)完全。待冷卻至室溫后，加入水(20mL)中止反應(yīng)。過濾后，以乙酸乙酯(10mL)洗滌固體，得化合物52.5g。產(chǎn)率：77％。固體，¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ3.71(s,3H),6.44(dd,J＝8.06,2.20Hz,1H),6.50(t,J＝2.35Hz,1H),6.56(d,J＝7.62Hz,1H),6.67(dd,J＝7.92,2.05Hz,1H),6.92(d,J＝7.62Hz,1H),7.22(t,J＝8.21Hz,1H),7.52(t,J＝8.06Hz,1H),11.01(s,1H),11.14(s,1H).

實施例5化合物6的制備

將5(2g,7.04mmol)加至三氯氧磷(8mL)中。冰浴下，再將N,N-二甲基苯胺(0.45mL,3.87mmol)緩慢滴加至該溶液中。升溫至95℃，并攪拌18小時，反應(yīng)完全。蒸干三氯氧磷后，加入冰水(50mL)稀釋，固體析出，過濾收集，即得相應(yīng)的2,4-二氯喹唑啉衍生物5a，粉末狀固體，ESI-MS：321.01[M+H]⁺。

將該中間體(5a)溶于四氫呋喃(15mL)中，冰浴下，向該溶液中滴加氨水溶液(15mL)。室溫下攪拌5小時，反應(yīng)完全。加入水(50mL)稀釋，以二氯甲烷(50mL×3)萃取。收集有機(jī)層并蒸干，經(jīng)過柱層析純化，即得目標(biāo)產(chǎn)物61.4g。產(chǎn)率：68％。固體，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.82(s,3H),6.24(br.s.,1H),6.66-6.71(m,2H),6.72-6.76(m,1H),6.84(ddd,J＝8.41,2.45,0.88Hz,1H),7.36(t,J＝8.22Hz,1H),7.44(dd,J＝8.31,1.08Hz,1H),7.55(t,J＝8.22Hz,1H),7.64(br.s.,1H).

實施例6化合物yhhu-3469的制備

將化合物6(80mg,0.265mmol)加至四氫呋喃(1.5mL)中，再滴加正丁胺(0.05mL,0.530mmol)至該溶液中。微波反應(yīng)器中加熱至150℃并反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)完全。加入水(30mL)稀釋，并以乙酸乙酯(30mL×3)萃取。收集有機(jī)層并蒸干，經(jīng)柱層析純化，得目標(biāo)產(chǎn)物yhhu-346956mg。產(chǎn)率：62％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ0.93(t,J＝7.29Hz,3H),1.34-1.48(m,2H),1.50-1.65(m,2H),3.40-3.50(m,2H),3.77(s,3H),5.12(br.s.,1H),6.32(d,J＝7.98Hz,1H),6.63-6.71(m,2H),6.75(dd,J＝8.25,2.20Hz,1H),7.13(d,J＝8.25Hz,1H),7.26-7.29(m,1H),7.29-7.34(m,1H).

實施例7化合物yhhu-3470的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：51％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.20(t,J＝6.42Hz,6H),3.61-3.75(m,4H),3.79(s,3H),6.29(d,J＝7.70Hz,1H),6.62-6.79(m,3H),7.14(d,J＝8.43Hz,1H),7.23-7.35(m,2H).

實施例8化合物yhhu-3493的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：75％。白色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.89-2.02(m,4H),3.64(t,J＝6.60Hz,4H),3.79(s,3H),6.31(d,J＝8.07Hz,1H),6.63-6.72(m,2H),6.75(dd,J＝8.62,1.65Hz,1H),7.14-7.22(m,1H),7.27-7.35(m,2H).

實施例9化合物yhhu-3472的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：71％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.54-1.72(m,6H),3.78(s,3H),3.81-3.88(m,4H),6.31(d,J＝8.07Hz,1H),6.62-6.72(m,2H),6.72-6.78(m,1H),7.14(d,J＝8.43Hz,1H),7.23-7.34(m,2H).

實施例10化合物yhhu-3473的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：68％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.45-1.55(m,2H),1.90-2.05(m,2H),3.21-3.36(m,2H),3.79(s,3H),3.93(td,J＝8.87,5.09Hz,1H),4.56(ddd,J＝13.62,4.81,4.68Hz,2H),6.34(d,J＝7.70Hz,1H),6.63-6.73(m,2H),6.76(dd,J＝9.21,1.51Hz,1H),7.14(d,J＝9.63Hz,1H),7.29(s,1H),7.31-7.36(m,1H).

實施例11化合物yhhu-3474的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：62％。白色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.65-1.75(m,2H),1.84-1.92(m,2H),3.79(s,3H),3.81-3.95(m,4H),3.98-4.06(m,1H),6.34(d,J＝7.98Hz,1H),6.64-6.72(m,2H),6.76(dd,J＝8.39,2.34Hz,1H),7.15(d,J＝8.25Hz,1H),7.29(s,1H),7.31-7.36(m,1H).

實施例12化合物yhhu-3471的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：68％。白色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.73-3.79(m,4H),3.80(s,3H),3.87(t,J＝4.40Hz,4H),6.36(d,J＝8.07Hz,1H),6.65-6.73(m,2H),6.77(dd,J＝8.25,2.38Hz,1H),7.15(d,J＝8.80Hz,1H),7.27-7.32(m,1H),7.32-7.38(m,1H).

實施例13化合物yhhu-3492的制備

制備方法同實施例6。產(chǎn)率：60％。黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.79(s,3H),4.71(d,J＝5.87Hz,2H),5.43(br.s.,1H),6.36(d,J＝8.07Hz,1H),6.66-6.75(m,2H),6.78(dd,J＝8.25,2.38Hz,1H),7.16(d,J＝8.43Hz,1H),7.23-7.26(m,1H),7.27-7.42(m,7H).

實施例14化合物yhhu-3491的制備

將化合物6(80mg,0.265mmol)加至四氫呋喃(1.5mL)中，滴加苯胺(0.05mL,0.530mmol)，再滴加鹽酸溶液(0.02mL)至該溶液中。微波反應(yīng)器中加熱至120℃并反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)完全。加入水(30mL)稀釋，并以乙酸乙酯(30mL×3)萃取。收集有機(jī)層并蒸干，經(jīng)柱層析純化，得目標(biāo)產(chǎn)物yhhu-349154mg。產(chǎn)率：57％。黃色固體，m.p.70-71℃，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,3H),6.44(d,J＝8.07Hz,1H),6.67-6.76(m,2H),6.79(d,J＝7.33Hz,1H),7.00(t,J＝7.33Hz,1H),7.31(t,J＝8.07Hz,4H),7.39 (t,J＝8.25Hz,1H),7.72(d,J＝8.43Hz,2H).

實施例15化合物yhhu-3477的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：68％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.33(s,3H),3.81(s,3H),6.42(d,J＝7.70Hz,1H),6.66-6.76(m,2H),6.80(dd,J＝8.43,2.57Hz,1H),7.01(t,J＝7.52Hz,1H),7.15-7.25(m,2H),7.33(t,J＝8.25Hz,1H),7.39(t,J＝8.25Hz,1H),7.61(br.s.,1H),8.05(d,J＝8.06Hz,1H).

實施例16化合物yhhu-3487的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：61％。黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),3.90(s,3H),6.44(d,J＝8.07Hz,1H),6.66-6.76(m,2H),6.79(d,J＝8.43Hz,1H),6.85-7.06(m,3H),7.28-7.36(m,2H),7.36-7.45(m,1H),7.55(br.s.,1H),8.76(d,J＝8.07Hz,1H).

實施例17化合物yhhu-3481的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：49％。黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.48(d,J＝7.70Hz,1H),6.68-6.77(m,2H),6.77-6.91(m,2H),7.28-7.39(m,3H),7.39-7.46(m,1H),7.54(dd,J＝8.07,1.47Hz,1H),8.80(d,J＝6.97Hz,1H).

實施例18化合物yhhu-3478的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：43％。黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.47(d,J＝8.07Hz,1H),6.66-6.77(m,2H),6.80(dd,J＝8.43,1.83Hz,1H),6.88-6.97(m,1H),7.01-7.20(m,3H),7.27-7.36(m,2H),7.42(t,J＝8.25Hz,1H),8.71-8.81(m,1H).

實施例19化合物yhhu-3476的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：59％。淺黃色固體，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.37(s,3H),3.81(s,3H),6.44(dd,J＝7.96,1.01Hz,1H),6.71(t,J＝2.29Hz,1H),6.72-6.76(m,1H),6.80(dd,J＝8.42,2.38Hz,1H),6.85(d,J＝7.50Hz,1H),7.04(br.s.,1H),7.22(t,J＝7.78Hz,1H),7.29(d,J＝1.10Hz,1H),7.33(t,J＝8.23Hz,1H),7.41(t,J＝8.14Hz,1H),7.49(s,1H),7.58(d,J＝8.05Hz,1H).

實施例20化合物yhhu-3488的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：52％。深紅色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,3H),3.84(s,3H),6.44(d,J＝8.07Hz,1H),6.57(d,J＝8.07Hz,1H),6.68-6.77(m,2H),6.80(d,J＝7.70Hz,1H),7.16(t,J＝7.52Hz,1H),7.20-7.31(m,3H),7.32(s,1H), 7.40(t,J＝8.07Hz,1H),7.61(br.s.,1H).

實施例21化合物yhhu-3479的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：46％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.46(d,J＝7.70Hz,1H),6.62-6.77(m,3H),6.77-6.85(m,1H),7.16-7.25(m,3H),7.27-7.36(m,2H),7.42(t,J＝8.25Hz,1H),7.91(d,J＝12.10Hz,1H).

實施例22化合物yhhu-3482的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：53％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.46(d,J＝8.07Hz,1H),6.67-6.76(m,2H),6.76-6.83(m,1H),7.07-7.18(m,2H),7.26-7.36(m,2H),7.41(t,J＝8.07Hz,2H),7.52(d,J＝7.70Hz,1H),8.10(s,1H).

實施例23化合物yhhu-3485的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：49％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.47(d,J＝7.70Hz,1H),6.67-6.77(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),7.19-7.46(m,5H),7.50(br.s.,1H),7.81(d,J＝8.07Hz,1H),8.18(br.s.,1H).

實施例24化合物yhhu-3475的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：65％。白色固體，m.p.133-134℃，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.32(s,3H),3.80(s,3H),6.42(d,J＝6.97Hz,1H),6.66-6.75(m,2H),6.79(d,J＝8.43Hz,1H),7.04(br.s.,1H),7.13(d,J＝8.43Hz,2H),7.20-7.26(m,1H),7.32(t,J＝8.25Hz,1H),7.38(t,J＝8.07Hz,1H),7.58(d,J＝8.43Hz,2H).

實施例25化合物yhhu-3791的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：50％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.63(d,J＝8.8Hz,2H),7.39(t,J＝8.4Hz,1H),7.36(d,J＝8.8Hz,2H),7.32(t,J＝8.0Hz,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.18(brs,1H),6.80(ddd,J＝8.4,2.4,0.8Hz,1H),6.74(ddd,J＝8.4,2.4,0.8Hz,1H),6.71(t,J＝2.4Hz,1H),6.42(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),5.88(brs,1H),3.81(s,3H),1.32(s,9H).

實施例26化合物yhhu-3792的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.60(brs,1H),7.63(brs,1H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),7.41(t,J＝8.4Hz,1H),7.34(t,J＝8.4Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),6.82(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.72(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.44(d,J＝8.0Hz,1H),6.69(m,1H),3.81(s,3H),6.40(brs,1H),2.86(m,1H),1.21(d,J＝6.8Hz,6H).

實施例27化合物yhhu-3489的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：55％。白色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,6H),6.41(d,J＝8.07Hz,1H),6.68-6.75(m,2H),6.79(dd,J＝8.43,2.20Hz,1H),6.89(m,2H),7.23(d,J＝7.70Hz,1H),7.32(t,J＝8.07Hz,1H),7.38(t,J＝8.25Hz,1H),7.59(m,2H).

實施例28化合物yhhu-3480的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：58％。黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,3H),6.43(d,J＝8.07Hz,1H),6.67-6.76(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),6.99(t,J＝8.07Hz,2H),7.20-7.28(m,1H),7.32(t,J＝8.25Hz,1H),7.39(t,J＝8.07Hz,1H),7.64(dd,J＝8.07,5.13Hz,2H).

實施例29化合物yhhu-3483的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：50％。白色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.46(d,J＝7.70Hz,1H),6.68-6.77(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),7.21(br.s.,1H),7.27-7.37(m,2H),7.37-7.46(m,3H),7.64(d,J＝8.43Hz,2H).

實施例30化合物yhhu-3486的制備

制備方法同實施例14。產(chǎn)率：56％。淺黃色固體，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.49(d,J＝8.07Hz,1H),6.69-6.77(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),7.27-7.38(m,3H),7.44(t,J＝8.07Hz,1H),7.56(m,2H),7.86(m,2H).

測試實施例本發(fā)明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉類化合物對神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響

試驗方法：

骨髓基質(zhì)細(xì)胞雙報告基因篩選方法

此篩選體系中需轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒，PGL4質(zhì)粒和pRL-CMV質(zhì)粒。其中PGL4質(zhì)粒載體帶有螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase,FL)序列，該序列上游插入了大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異的Nestin部分啟動子基因序列。巢蛋白(Nestin)是神經(jīng)干細(xì)胞中特異表達(dá)的中間絲蛋白，當(dāng)rMSCs往神經(jīng)方向分化時將啟動Nestin表達(dá)，將啟動下游螢火蟲熒光素酶表達(dá)，它的表達(dá)量與神經(jīng)方向分化的能力正相關(guān)。pRL-CMV質(zhì)粒帶有海腎熒光素酶(renillaluciferase,RL)序列，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞即可表達(dá)該酶，作為轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的本底對照。通過統(tǒng)計FL和RL的比值，篩選出影響Nestin表達(dá)的化合物。

取經(jīng)原代培養(yǎng)后傳至第3代的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(rMSCs)，用胰酶消化后，離心重懸計數(shù)，轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒，用αMEM+10％FBS培液稀釋成1×10⁵/mL細(xì)胞密度，均勻種入96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)過夜。將10mM的化合物儲備液，用培養(yǎng)基稀釋成10μM的工作濃度全換液。陽性對照用20％FBS+αMEM的培養(yǎng)液 將β-巰基乙醇配制成1mM換液，空白對照為αMEM培養(yǎng)基全換液。培養(yǎng)24hr后，陽性對照換成200μM的BHA(Butylated hydroxyanisole,丁基羥基茴香醚)，繼續(xù)培養(yǎng)5hr，檢測FL和RL讀值。通過比較Relative Luciferase＝RFL/RRL值，獲得影響神經(jīng)干細(xì)胞Nestin表達(dá)的候選化合物。

神經(jīng)干細(xì)胞分化實驗

孕13～14天的SD大鼠用10％水合氯醛麻醉后取胚胎，放至預(yù)冷D-Hanks緩沖液中取出胚胎腦，解剖顯微鏡下去除干凈腦膜并分離出海馬區(qū)域，將海馬組織剪成1～2mm³小塊，用37℃預(yù)熱的DMEM/F12+1％N2+2％B27細(xì)胞培液吹打多次，得到細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液得到單細(xì)胞，以5×10⁵個的細(xì)胞密度種于培養(yǎng)皿，加入含EGF(20ng/mL),bFGF(20ng/mL)的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中以5％CO₂、95％飽和濕空氣培養(yǎng)，隔天半換液，培養(yǎng)6天，離心(1000g，2分鐘)收集神經(jīng)球，經(jīng)Accutase消化為離散細(xì)胞后進(jìn)行傳代。

1)神經(jīng)球的貼壁分化：取P1代大小較均一的神經(jīng)球離心(1000g，2分鐘)，種于預(yù)鋪了PDL的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，設(shè)置空白對照組及各濃度的化合物組處理48hr～72hr進(jìn)行后續(xù)實驗。

2)離散細(xì)胞的貼壁分化：取P1代大小較均一的神經(jīng)球離心(1000g，2分鐘)，用Accutase消化成離散細(xì)胞，再次離心后將離散細(xì)胞均勻地種于預(yù)鋪了PDL的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，設(shè)置空白對照組及各濃度的化合物組處理3天或7天進(jìn)行后續(xù)實驗。

BrdU摻入實驗

5-Bromo-2-deoxyUridine(BrdU),中文名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入S期細(xì)胞單鏈DNA核苷酸序列，替代胸腺嘧啶。利用BrdU抗體，通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法，可檢測增殖細(xì)胞。本實驗用培養(yǎng)7天的神經(jīng)干細(xì)胞球，經(jīng)Accutase消化成離散細(xì)胞后，用含BrdU的DMEM/F12+1％N2+2％B27培液稀釋成5×10⁵個的細(xì)胞密度種于預(yù)鋪了PDL的24孔板中，培養(yǎng)3天或7天后進(jìn)行免疫熒光染色。

細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次，加入4％多聚甲醛固定20分鐘后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，用含0.1％的TritonX-100的PBS液通透5～10分鐘后，PBS洗滌3次，每次5分鐘，10％胎牛血清室溫孵育1小時封閉，后用封閉液配制的一抗溶液孵育過夜。再用PBS洗3次，每次5分鐘，相應(yīng)二抗室溫孵育1小時，PBS洗滌3次，每次5分鐘，封片。對于BrdU免疫熒光染色，細(xì)胞經(jīng)固定后，還需用2N的HCl室溫處理30分鐘，使DNA變性，再用0.1mol/L的四硼酸鈉中和15分鐘，然后進(jìn)行后續(xù)實驗。

蛋白免疫印跡法(Western Blot)

細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗2次后加入RIPA裂解液(Tris-HCl 50mM，pH7.4，NaCl 150mM，EDTA 1mM，Na-deoxycholate 0.25％，NP-401％，PMSF 1mM，Na₃VO₄1mM，NaF 1mM，Aprotinin 10μg/mL，Leupeptin 5μg/mL，Pepstatin 5μg/mL)，冰上裂解30分鐘。用細(xì)胞刮將裂解物刮下，收集裂解液至離心管，15000g，4℃離心15分鐘。吸取上清，取部分用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，在剩下的蛋白上清中加入4×樣品緩沖液，沸水浴5分鐘后收集蛋白樣品。樣品經(jīng)SDS/PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉室溫封閉1小時后，用稀釋的一抗4℃ 孵育過夜。次日，樣品條帶用TBST洗三遍，每次10分鐘。室溫孵育二抗1～1.5小時，樣品條帶用TBST洗三遍，孵育ECL顯色后，用ImageQuant LAS 4000成像儀器顯影拍照。

測試實施例1本發(fā)明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉類化合物對SD大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中nestin表達(dá)具有調(diào)控作用

篩選結(jié)果：

篩選結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，化合物Yhhu-3469、Yhhu-3479、Yhhu-3491、Yhhu-3492、Yhhu-4282、Yhhu-3472、Yhhu-3476、Yhhu-3477、Yhhu-3478、Yhhu-3481、Yhhu-3482、Yhhu-3487、Yhhu-3493使Nestin的表達(dá)顯著升高；化合物Yhhu-3791、Yhhu-3792使Nestin的表達(dá)顯著降低。

篩選的驗證：

采用免疫熒光染色方法，檢測上述篩選出的小分子化合物對骨髓基質(zhì)細(xì)胞中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Nestin的表達(dá)情況(圖2)。

結(jié)果表明,Yhhu-3478、Yhhu-3487、Yhhu-3493化合物均使Nestin陽性細(xì)胞數(shù)增加。

測試實施例2本發(fā)明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉類化合物對神經(jīng)干細(xì)胞分化的具有促進(jìn)作用

2.1化合物Yhhu-3477、Yhhu-3481可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化

化合物Yhhu-3477、Yhhu-3481以1μM的濃度作用于神經(jīng)干細(xì)胞球和離散神經(jīng)干細(xì)胞，用免疫熒光染色的方法和Western blot，檢測神經(jīng)元特異標(biāo)記蛋白Tuj-1(圖3和圖4)。

統(tǒng)計結(jié)果表明,Yhhu-3477、Yhhu-3481化合物可以使Tuj-1表達(dá)量顯著增加，分化的神經(jīng)元比例顯著增加。

2.2化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792可以對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用

將Yhhu-3791和Yhhu-3792化合物作用于神經(jīng)干細(xì)胞球，用免疫熒光染色的方法檢測神經(jīng)元特異標(biāo)記蛋白Tuj-1和星狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792可以使Tuj-1和GFAP的表達(dá)水平增加(圖5)。

結(jié)果表明，Yhhu-3791和Yhhu-3792具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細(xì)胞分化的作用。

測試實施例3本發(fā)明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉類化合物對神經(jīng)干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，且與Notch信號通路有關(guān)。

本實施例研究了Nestin下調(diào)化合物(如Yhhu-3791和Yhhu-3792)對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。

3.1化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖

結(jié)果如圖6所示。免疫熒光染色結(jié)果顯示，化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792在1μM濃度時可以使神經(jīng)干細(xì)胞球增大。結(jié)果表明，化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792對神經(jīng)干細(xì)胞有增殖的作用。

結(jié)果如圖7所示。利用BrdU摻入的方法，結(jié)果顯示，化合物Yhhu-3792可以使細(xì)胞BrdU陽性率顯著增加。結(jié)果表明，化合物Yhhu-3792對神經(jīng)干細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

3.2化合物Yhhu-3792可以促進(jìn)神經(jīng)元及星狀膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加

結(jié)果如圖8所示。通過BrdU與特異性標(biāo)記蛋白免疫熒光共標(biāo)的方法可以確定增殖細(xì)胞的類型，結(jié)果表明，Yhhu-3792化合物可以促進(jìn)神經(jīng)元(BrdU⁺/Tuj-1⁺)及星狀膠質(zhì)細(xì)胞(BrdU⁺/GFAP⁺)數(shù)量的增加。

3.3Notch信號通路參與了Yhhu-3792化合物促近神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用

Notch信號通路與神經(jīng)干細(xì)胞增殖密切相關(guān)，利用Western blot檢測Yhhu-3792化合物對Notch信號通路的作用。

結(jié)果如圖9和圖10所示。結(jié)果顯示，化合物Yhhu-3792能夠增加Notch-1受體表達(dá)量以及細(xì)胞核內(nèi)的Notch受體活化形式NICD的表達(dá)量。結(jié)果表明，Notch信號通路參與了Yhhu-3792化合物促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用。

結(jié)果如圖11所示。SHH信號通路與神經(jīng)干細(xì)胞增殖密切相關(guān),通過Westernblot檢測Yhhu-3792化合物對SHH信號通路的作用。結(jié)果顯示，SHH信號通路相關(guān)受體Patched表達(dá)量無明顯變化。結(jié)果表明，化合物Yhhu-3792對SHH信號通路無明顯影響。

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