一種治療肝臟纖維化的siRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種治療肝臟纖維化的siRNA及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化（Liver Fibrosis)是多種慢性肝臟疾病(包括病毒性肝炎，酒精肝和非 酒精性脂肪肝等）所致肝損傷的組織學(xué)變化，是一種在損害因子持續(xù)作用下漸進的病理過 程。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)病理階段。肝癌是目前世界上最常見的癌癥 之一，也是導(dǎo)致死亡的主要因素之一。而肝纖維化是肝癌形成的主要病因，超過80%的肝癌 由肝纖維化發(fā)展而來。
[0003] 目前對于肝纖維化的治療主要包括：（1)針對原發(fā)病去除致病因素，如抗乙型肝 炎、丙型肝炎病毒治療，抗血吸蟲治療，戒酒等；（2)針對肝纖維化本身的治療，如通過抑制 炎癥或脂質(zhì)過氧化，或者抑制肝星狀細胞的增生活化，以及促進膠原降解等。
[0004] 針對原發(fā)病去除致病因素的肝纖維化的治療，易出現(xiàn)患病情況持續(xù)，反復(fù)的情況。 雖然在終末期患者治療中，進行肝移植也是一個成功的治療方法，但可供移植器官不足，醫(yī) 療費用高昂，因此，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，闡明肝纖維化的發(fā)病機制，對于肝纖維化本身 的治療是最廣泛有效的方法。其中SiRNA對于基因的沉默來治療肝臟纖維化由于其安全性 高，效率高，治療效果好，正逐漸發(fā)展，而對于該技術(shù)，靶標的尋找和siRNA的設(shè)計是關(guān)鍵所 在。
[0005] 目前已知Slit2-Robol信號通路的激活參與了肝癌等多種腫瘤形成及炎癥反 應(yīng)，然而其能否調(diào)節(jié)肝癌重要前期病變即肝纖維化的病理進程尚不明確。近年來研宄證 明Slit2通過富亮氨酸重復(fù)序列與其受體Robol胞外免疫球蛋白樣區(qū)結(jié)合，從而激活 Slit2-Robol信號通路，調(diào)控炎癥、腫瘤、白細胞趨化、中胚層和血管平滑肌細胞迀移等病 理過程。研宄表明，多種腫瘤中存在Slit2、Robol基因的異常表達。Slit2與Robol作 用可以誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。最近研宄報道，Robol在肝癌組織中過表達，可以作為診 斷肝癌的臨床指標之一。鑒于Slit2-Robol信號通路在肝癌和炎癥中的重要調(diào)控作用，而 肝癌大多由肝纖維化發(fā)展而來，并且肝纖維化過程也是炎癥反應(yīng)相關(guān)的病理過程。那么， Slit2-Robol信號通路是否在肝纖維化的病理進程中同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用？目前尚 不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有肝纖維化治療藥物的不足，提供一種能夠治 療肝纖維化的短的、雙鏈的核糖核酸，即小干擾RNA (siRNA)。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供上述siRNA的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 本發(fā)明提供一種抑制robol基因表達的siRNA，所述siRNA的正義鏈序列如SEQ ID NO. 1所示，siRNA的反義鏈序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供上述抑制robol基因表達的siRNA在沉默robol基因中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供上述抑制robol基因表達的siRNA在抑制或下調(diào)TGF-β 1/Smad通 路蛋白和/或PI3K/AKT通路蛋白的表達中的應(yīng)用。
[0011] 上述抑制!"Obol基因表達的siRNA在抑制肝星狀細胞的活化中的應(yīng)用在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
[0012] 上述抑制robol基因表達的siRNA在制備預(yù)防和/或治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用 也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0013] 上述抑制robol基因表達的siRNA在制備治療慢性肝臟疾病藥物中的應(yīng)用也在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。所述慢性肝臟疾病為毒性肝炎，酒精肝或非酒精性脂肪肝。
[0014] 上述抑制robol基因表達的siRNA在制備治療肝硬化或肝癌藥物中的應(yīng)用也在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0015] 研宄表明，slit-robo通路對于肝纖維化的發(fā)展有促進作用，血清中Slit2水平與 肝纖維化程度呈正相關(guān)，利用Slit2抗體通過常規(guī)的ELISA、免疫組化、免疫熒光等方法，可 以特異性地標識Slit2與肝纖維化程度的關(guān)系，a -SMA與Slit2的表達呈正相關(guān)性。
[0016] 另外，在肝纖維化的發(fā)展過程中，兩條通路起著非常重要的作用，一條是TGF-β 1/Smad3通路，轉(zhuǎn)化生長因子-β 1 (TGF-β 1)過度表達已被公認為肝纖維化發(fā)生的最重要 的因素之一。TGF-β 1通過與其跨膜受體結(jié)合，激活胞內(nèi)Smad3蛋白，進而調(diào)控a -SM等 細胞外基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，并促進其合成ECM并抑制ECM降解，誘導(dǎo)靜息狀態(tài)的肝星狀細 胞（HSC)向肌纖維細胞轉(zhuǎn)化，進而引起肝纖維化。因此，阻斷TGF-β 1合成或抑制TGF-β 1/ Smad3信號通路均可顯著減輕實驗性肝纖維化程度；NF- κ B是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵的 核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)肝臟炎癥信號通路方面發(fā)揮著重要作用，NF-κ B通過上調(diào)TGF-M表 達進而激活TGF-M/Smad3通路，促進ECM積聚，從而參與肝臟炎癥、肝纖維化和肝癌病變 進程。
[0017] 另一條是PI3K/AKT通路，能夠在多方面管控肝臟星狀細胞的激活，包括膠原的生成與肝星 狀細胞的增殖。其與膠原形成具有明顯的相關(guān)性。而膠原沉積是產(chǎn)生肝臟纖維化的最主要 的原因。其主要是通過作用于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子（??ΜΡ)， MMP具有降解細胞外基質(zhì)中膠原的作用，而??ΜΡ則可以抑制??ΜΡ的作用。正常人體肝臟組 織中，??ΜΡ與MMP的水平是保持動態(tài)平衡的。而PI3K/AKT通路則可以增加 ??ΜΡ的表達， 將這個平衡破壞，從而促進細胞外基質(zhì)的堆積，導(dǎo)致肝臟纖維化。
[0018] 我們通過在基因水平上沉默robol基因，使得TGF-β 1/Smad通路蛋白均有不同 程度的下調(diào)，PI3K/AKT通路蛋白也有一定程度下調(diào)，從而使得在TGF-β 1/Smad3與PI3K/ AKT這兩條通路上緩解肝纖維化的病理進程，從而從根本上遏制肝纖維化的發(fā)展，從而達到 治療肝纖維化的目的。
[0019] 對于robol基因的抑制能夠有效的治療肝臟纖維化，而肝纖維化是慢性肝病發(fā)展 到肝硬化的必經(jīng)病理階段和肝癌形成的主要病因，因此，對于肝癌等疾病的治療具有重要 的應(yīng)用前景。而且，根據(jù)本發(fā)明的siRNA制備藥物是通過對肝纖維化本身的治療來達到治 療肝癌等疾病的目的，能夠預(yù)防肝纖維化的反復(fù)，提高治病效率與安全性。
[0020] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種治療肝臟纖維化的SiRNA及其應(yīng)用。所述SiRNA的堿基序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，該siRNA可以有效的沉默Robol基因，從而阻斷Slit2-Robol 信號通路，繼而達到從根本上遏制肝纖維化發(fā)展的目的。
[0021] 另外，本發(fā)明所述的siRNA沉默Robol基因后，可有效地減少肝星狀細胞（LX2細 胞)靶蛋白質(zhì)（TGF-β 1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT通路蛋白）的產(chǎn)生，抑制肝星狀細胞的活 化，從而使得在TGF- β 1/Smad3與PI3K/AKT這兩條通路上緩解阻斷肝纖維化的病理進程， 從而從根本上遏制肝纖維化的發(fā)展，從而達到治療肝纖維化的目的。
[0022] 總之，本發(fā)明siRNA對于robol基因的抑制能夠有效的治療肝臟纖維化，而肝纖維 化是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)病理階段和肝癌形成的主要病因，因此，對于肝癌等疾 病的治療具有重要的應(yīng)用前景。
[0023] 而且，本發(fā)明是通過對肝纖維化本身的治療來達到治療肝癌等疾病的目的，能夠 預(yù)防肝纖維化的反復(fù)，提高治病效率與安全性。
【附圖說明】
[0024] 圖1為Elisa檢測血清中Slit2含量的結(jié)果。
[0025] 圖2為免疫組化（IHC)檢測SIit2和免疫熒光技術(shù)（IF)檢測a -SMA表達的結(jié)果。
[0026] 圖3為不同肝纖維素化分期的Slit2表達量。
[0027] 圖4為不同肝纖維素化分期的a -SM表達量。
[0028] 圖5為a -SMA和SIit2的表達關(guān)系。
[0029] 圖6為western blot檢測robol基因沉默后TGF-β 1/Smad通路蛋白和PI3K/AKT 通路蛋白的表達。
【具體實施方式】
[0030] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0031] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0032] 實施例1 ELISA檢測人Slit2 1、Elisa檢測正常人和肝纖維化患者血清中Slit2含量，采用市購的人Slit2 ELISA 試劑盒（Human Slit2 ELISA Kit)，方法步驟如下： (I)將各種試劑移至室溫（18~25 °C )平衡至少30分鐘，配制試劑。
[0033] (2)加樣：分別設(shè)標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100 μ L， 輕輕晃動混勻，覆上板貼，37°C溫育2小時。
[0034] (3)棄去液體，甩干，不用洗滌。
[0035] (4)每孔加生物素標記抗體工作液100 μ L，覆上新的板貼，37°C溫育1小時。
[0036] (5)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200 μ L/每孔，甩干。
[0037] (6)每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μ L，覆上新的板貼，37°C溫育1 小時。
[0038] (7)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200 μ L/每孔，甩干。37°C (8)依序每孔加底物溶液90 μ L，37°C避光顯色15~30分鐘。
[0039] (9)依序每孔加終止溶液50 μ L，終止反應(yīng)。
[0040] (10)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（0D 值)。
[0041] 2、結(jié)果 結(jié)果如附圖1所示，正常人血清中Slit2的含量約20 ng/mL，而肝纖維化患者的血清中 Slit2含量顯著增加，約100 ng/mL。表明血清中Slit2水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)。
[0042] 實施例2免疫組化（IHC)檢測SIit2 1、Slit2抗體的制備 所述Slit2抗體（BA2082)購買于博士德公司，為兔多克隆抗體，可針對大鼠、小鼠及人 源性標本進行實驗檢測。本發(fā)明中應(yīng)用的抗體體積稀釋配比為1:150,稀釋液體為1% (w/ v) BSA 液體或 ρΗ7· 2 ~7. 6 的 PBS。
[0043] 2、獲取小鼠肝臟 分別選取6~8周齡的SIit2過表達小鼠 SIit2-Tg，由本研宄所自行構(gòu)建，飼養(yǎng)于本 研宄所(廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研宄所）動物房。
[0044] C57BL/6J小鼠，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK (粵） 2008-0002)。
[0045] 分別用CC14和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)肝纖維化模型，并按照以下方法獲取小鼠肝臟： 51. 將小鼠頸部脫臼處死； 52. 將小鼠仰臥，腹中間開口暴露腹腔，用鑷子夾住膽囊，將肝臟分離出來，放入盛有磷 酸鹽緩沖液（PBS)的小皿中。將肝臟放入專用小