一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護 劑。
【背景技術】
[0002] 豬瘟（CSF)是國際動物衛(wèi)生組織（OIE)和中國的A類法定傳染病，是我國強制性免 疫的重大動物疫病之一，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的"第一殺手"。豬瘟是由豬瘟病毒引起的，無法 用藥物進行控制，疫苗免疫是最有效的辦法。
[0003] 目前國內外市售的豬瘟疫苗主要有豬瘟脾淋苗、豬瘟細胞苗以及豬瘟亞單位疫 苗，但市場上豬瘟疫苗的主流產品仍然是豬瘟脾淋苗和豬瘟細胞苗。作為疫苗中的經 典-精制豬瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。
[0004] 豬瘟脾淋源活疫苗選用中國豬瘟兔化弱毒株（C株)，該疫苗株能激發(fā)機體快速產 生免疫力、遺傳穩(wěn)定、毒力不返強，是國際上公認的目前世界上最為安全有效的弱毒疫苗 株。采用該毒株接種優(yōu)良家兔，收獲感染家兔的脾臟制成乳劑，與凍干保護劑混勻后經過冷 凍真空干燥制成豬瘟脾淋源活疫苗。
[0005] 目前市場認為豬瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，對豬瘟脾淋活疫苗的認識仍存 在誤區(qū)，這主要和目前國內豬瘟脾淋源活疫苗使用方法不當、混合感染豬只免疫后應激過 大，以及質量參差不齊等情況有關。
[0006] 近年來，人們針對活疫苗凍干保護劑進行了大量研宄，多為耐熱保護劑，解決了疫 苗在運輸使用過程中的耐熱問題，但對于提高活疫苗效果方面幾乎沒有提升。
[0007] 多糖是中藥活性成分之一，大量研宄表明，多糖及糖復合物在生物體內不僅是作 為能量資源和構成材料，更重要的是它存在于一切細胞膜結構中，參與生命現(xiàn)象中細胞的 各種活動。多糖類物質是所有生命有機體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂質過氧化的能力，同時多糖也具有很好的耐熱效果，多種實驗表明中藥多糖 可作為耐熱保護劑添加于活疫苗凍干保護劑中。
[0008] 黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質，也是自然界藥用植物中的主要活 性成分之一。它是指具有15個碳原子并以C6-C3-C6的方式構成的三環(huán)天然有機物，是植 物在長期自然選擇中產生的二級代謝產物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于 果蔬、中草藥中，無毒副作用，它具有顯著的清除機體內自由基、抗老化、抗突變、調血脂降 血壓等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑，這些抗氧化活性物質可 以減少和清除機體內自由基，具有預防疾病的作用。
[0009] 法氏囊素（bursin，BS)是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊（Bursa of fabricius)中分離出來的一種活性三肽物質，其結構為L-LyS-His-Gly-NH2。研宄表明，BS 能促進禽類和哺乳動物B淋巴細胞前體的分化、增殖，能提高B細胞系Daudi細胞內第二信 使cAMP和cGMP水平，加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度，促進B細胞內蛋白質的生成， 從而使B細胞產生和分泌抗體能力加強。
[0010] 基于上述【背景技術】，本發(fā)明提出一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑。該保護劑 主要由中藥多糖、中藥黃酮、法氏囊素等組成。本發(fā)明所制備的凍干保護劑一方面可以提供 給活疫苗耐熱保護，另一方面在疫苗使用過程中大大提高了疫苗的使用效果，同時還兼具 了提高機體免疫力的功效。

【發(fā)明內容】

[0011] 針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種豬瘟脾淋源活疫苗用 凍干保護劑的技術方案，該凍干保護劑能夠大幅度提高了機體的免疫力，提高體液免疫能 力，刺激機體產生高效的中和抗體，提高了機體預防疾病的能力。
[0012] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑，其特征在于該凍干保護劑每1000 ml 磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、法氏囊素2~16mg，所述的中 藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到：垂盆草、金果欖、雞矢藤、水牛角、螻蛄、 香薷、防己、半邊蓮和路路通。
[0013] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑，其特征在于該凍干保護劑每1000 ml 磷酸緩沖液中含有中藥多糖50~80g、中藥黃酮30~50g、法氏囊素4~12mg。
[0014] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥 黃酮通過以下步驟制得： a、 按垂盆草10~30份、金果欖20~40份、雞矢藤10~20份、水牛角10~30份、 螻蛄10~30份、香薷10~20份、防己10~30份、半邊蓮10~30份和路路通10~20 份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至 90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； c、 將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按通過活性炭柱進行內毒素吸附，收集濾出液； e、 將d中上濾出液通過sevag法除去蛋白； f、 將e中中藥多糖進行真空冷凍干燥制得中藥多糖； g、 將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗，再次進 行減壓真空濃縮，如此三次后經冷凍真空干燥制成中藥黃酮。
[0015] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑，其特征在于所述的法氏囊素通過以 下步驟制得：取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7. 2滅菌冷PBS洗 凈；按1 :1比例加入pH 7. 2滅菌冷PBS，在組織勻漿機中進行高速勻漿；勻漿液中加入2. 5% 的胰蛋白酶，反復凍融3次，12000rpm離心20min，棄沉淀；上清用1000 da截留分子量的超 濾膜進行超濾，膜下液經〇. 22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液；粗提液經冷 凍真空干燥制得法氏囊素。
[0016] 上述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護劑，設計合理，與傳統(tǒng)的凍干保護劑相 比其具有以下優(yōu)點： 1.本發(fā)明所制備的凍干保護劑，具有耐熱效果，可提高疫苗運輸、儲藏等便利性。
[0017] 2.采用本發(fā)明凍干保護劑所制備的疫苗在免疫注射時可以減少豬只疼痛感，降低 豬只的應激反應。
[0018] 3.采用本發(fā)明凍干保護劑制備疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的產 生中和抗體，減少免疫空檔期，降低豬只發(fā)病幾率，提高機體抵御疾病的能力。
[0019] 4.采用本發(fā)明凍干保護劑制備的疫苗免疫機體后，能促進機體B淋巴細胞前體的 分化、增殖，加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度，促進B細胞內蛋白質的生成，從而使B 細胞產生和分泌抗體能力加強，從而可提高機體免疫力。
【具體實施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解， 這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實 驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。
[0021] 實施例1 :中藥多糖和中藥黃酮的制備 a、 按垂盆草30份、金果欖20份、雞矢藤20份、水牛角30份、螻蛄30份、香薷10份、防 己10份、半邊蓮10份和路路通10份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加 入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分 鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； c、 將b中上清進行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進行溶 解，溶解后，按〇. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清經0. 22um濾膜過濾除菌后，進行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進行真空冷凍干燥即得到中藥多糖； g、 將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗，再次進 行