一種長效重組glp-1融合蛋白及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種長效重組GLP?1融合蛋白及其制備方法和用途。所述長效重組GLP?1融合蛋白是通過細胞表面展示技術(shù)篩選獲得的。本發(fā)明所述重組GLP?1融合蛋白具有更高的降糖活性、更低的免疫原性、更長的體內(nèi)半衰期，因而可用于具有很好的治療糖尿病的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種長效重組GLP-1融合蛋白及其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明提供了長效重組GLP-1融合蛋白及其制備方法 和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] Π 型糖尿?。═ype Π Diabetes)是一種以胰島素抵抗和胰島素分泌不足為特征的 慢性疾病，作為糖尿病發(fā)病的主要類型，Π 型糖尿病病人占糖尿病總?cè)巳旱?0%以上，預(yù)計 到2025年全球Π 型糖尿病發(fā)病人群將會達到3億，成為繼癌癥之后的又一嚴重危害人類健 康的疾病，我國Π 型糖尿病發(fā)病廣泛，患者如果不能及時得到治療，很容易導(dǎo)致多種糖尿病 并發(fā)癥，給患者和國家造成很大負擔(dān)，因此研制安全高效的Π 型糖尿病治療藥物的需求極 為迫切。
[0003] GLP-1受體激動劑是近年發(fā)展起來的用于Π 型糖尿病治療的一類新型藥物。
[0004] 天然GLP-1是一種人體自身分泌的，由胰高血糖素原基因轉(zhuǎn)錄的腸促胰島素激素。 它由腸道L細胞分泌，由進食刺激誘導(dǎo)合成并分泌。通過連接B家族G蛋白偶聯(lián)受體，GLP-1可 激活胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶(3(1611713七6〇5^1386)、蛋白激酶厶(口1'0七6；[111^仙86 4，？1^)、鳥苷酸 轉(zhuǎn)化因子（cAMP-regulated guanine nucleotide exchange factor II，Epac2)，進而增加 胞漿內(nèi)Ca2+濃度，促使辟田胞胞吐胰島素。藥理學(xué)研究表明，GLP-1具有血糖依賴性的胰島素 分泌作用，在高血糖條件下還可以抑制胰高血糖素的分泌，通過延緩胃排空和調(diào)節(jié)食欲間 接達到降低體重的目的。相較于胰島素和其它胰島素促泌劑，GLP-1最顯著的優(yōu)勢在于嚴格 根據(jù)血糖閾值來完成降糖作用，并通過降低體重來緩解糖尿病危險因素。
[0005] 然而，天然GLP-1很容易被降解，其血清半衰期非常短。研究人員采用多種策略來 延長61^-1的血清半衰期，包括氨基酸突變以抵抗二肽基肽酶(0丨口6口1^(17116口1^(^86， DPP-IV)和中性肽鏈內(nèi)切酶(Neutral endopeptidase，NEP)的降解、與白蛋白或IgG Fc段融 合、納米修飾包裹等等。其中，IgG Fc與寡肽或多肽組成融合蛋白來延長血清半衰期的策略 已有較多應(yīng)用，現(xiàn)有技術(shù)中存在GLP-1或其突變體與IgG4Fc或其突變體的融合蛋白。
[0006] 但是，要獲得能夠應(yīng)用于臨床的長效GLP-1融合蛋白，則在融合Fc片段的選擇上， 首先要能夠維持GLP-1的生物活性，其次才是獲得盡可能長的半衰期。因此，通過恰當(dāng)?shù)难?究方法，對用于構(gòu)建融合蛋白的GLP-1和Fc片段進行組合篩選，則有可能獲得更為理想的 GLP-1-Fc融合蛋白。
[0007] 本發(fā)明人借助哺乳動物細胞表面展示技術(shù)，從GLP-1-Fc融合蛋白編碼基因突變文 庫中篩選出高活性、長半衰期的GLP-1-Fc融合蛋白編碼序列，進而獲得其氨基酸序列，所得 融合蛋白有望用于II型糖尿病的治療研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0008] 鑒于上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于通過活性篩選的方式，提供一種可獲得 GLP-1-Fc融合蛋白序列的篩選方法，并進一步提供包含所述GLP-1-Fc融合蛋白的藥物組合 物及其用途。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建和篩選GLP-Ι-Fc融合蛋白編碼cDNA的方法，該方法包括，制備所述GLP-1-Fc融合蛋白編碼序列所包含 的3部分：編碼GLP-1的cDNA序列；編碼柔性連接肽的cDNA序列，以及編碼Fc的突變cDNA序 列。所述柔性連接肽由甘氨酸和絲氨酸組成，即含有2-5組的Gly 4Ser;所述編碼柔性連接肽 的cDNA序列，如SEQ ID ^):2-5所示;所述編碼?〇的突變〇0嫩序列，以1861，1862和1864的3 種Fc序列為混合模板，使用通用引物進行易錯PCR擴增獲制備的cDNA文庫。使用IIs型限制 性內(nèi)切酶，將GLP-1的cDNA序列、柔性連接肽cDNA序列、不同的Fc突變cDNA序列連接起來，組 成含有不同F(xiàn)c突變序列的cDNA文庫。將該文庫與哺乳動物表面展示載體p-Display相連接， 構(gòu)建表面展示文庫，用于候選序列的篩選。將質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)60小時后進行磁 珠分選及流式分選。首先為磁珠分選:將轉(zhuǎn)染后的293T細胞與固定有Fey R的磁珠共孵育， 收集未結(jié)合細胞用于流式分選;然后使用帶有FITC標(biāo)記的羊抗人IgG與經(jīng)磁珠分選的細胞 共同孵育。從分選收集的細胞中提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a進行擴增，作為下一輪篩選的 子文庫。下一輪篩選中，降低FITC標(biāo)記的濃度至第一輪的1/10。經(jīng)過三輪淘洗和篩選，獲得 的陽性質(zhì)粒經(jīng)測序分析，確定其DNA序列。
[0010] 在本發(fā)明的一個實施方案中，篩選的質(zhì)粒11-04號中含有的GLP-1-FC編碼DNA序列 如SEQ ID N0:13所示。
[0011] 另一方面，本發(fā)明了提供一種制備所述GLP-1-Fc融合蛋白的方法，將編碼所述 GLP-卜Fc融合蛋白的cDNA連接入哺乳動物細胞穩(wěn)定表達載體，轉(zhuǎn)染CH0-K1細胞，建立穩(wěn)定 表達細胞株。重組GLP-1-Fc融合蛋白分泌表達于細胞上清中，通過protein A親和層析純化 制備重組GLP-1-Fc融合蛋白。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述GLP-1-FC融合蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO :14所示的氨基酸序列。
[0013] -方面，本發(fā)明提供了一種重組GLP-1-Fc融合蛋白，其包括GLP-1，連接肽和人免 疫球蛋白Fc變體。所述的連接肽由2-5組的Gly4Ser組成，其中優(yōu)選為3組。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述重組GLP-1-Fc融合蛋白具有如SEQ ID N0: 14所示的氨基酸序列。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供了一種GLP-1-FC融合蛋白編碼基因，其包含編碼GLP-1的 cDNA，編碼柔性連接肽的cDNA，以及編碼Fc的突變cDNA序列。
[0016] 其中所述的編碼GLP-1的cDNA具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0017]所述的編碼柔性連接肽的CDNA具有選自SEQ ID N0: 2-5所示的核苷酸序列，優(yōu)選 為SEQ ID N0:3。
[0018] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述GLP-1-Fc融合蛋白編碼基因具有如SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列。
[0019] 降糖作用測定和半衰期測定實驗證明：本發(fā)明制備的重組GLP-1-Fc融合蛋白，與 禮來的杜拉魯肽(Duraglutide)相比，具有更好的降糖效果、更低的免疫原性，且半衰期延 長 10%〇
[0020] 因此，本發(fā)明另一方面提供了一種用于降血糖治療II型糖尿病的藥物組合物，其 中包含所述重組GLP-1-Fc融合蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體。
[0021] 另一方面，本發(fā)明提供了所述重組GLP-1-FC融合蛋白在制備用于防治II型糖尿病 的藥物中的用途。
[0022] 另一方面，本發(fā)明提供了所述的GLP-1-Fc融合蛋白編碼基因在制備用于防治II型 糖尿病的藥物中的用途。
[0023]另一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建展示型GLP-1-Fc突變文庫的方法，該方法包括： (a)合成編碼GLP-1的cDNA序列；（b)合成編碼柔性連接肽的cDNA序列；（c)擴增編碼Fc的突 變cDNA，（ i)合成IgGl、IgG2和IgG4cDNA; (i i)合成引物；（ii i)以 IgGl、IgG2和IgG4cDNA混合 物為模板（例如1:1:1混合），使用（ii)合成的引物，進行PCR擴增，得到不同的Fc的突變 cDNA; (d)將編碼GLP-1的cDNA序列、編碼柔性連接肽cDNA序列、不同的Fc突變cDNA序列通過 限制性酶切后連接，得到含有不同F(xiàn)c突變序列的GLP-1-Fc cDNA文庫，其中使用的限制性內(nèi) 切酶為Π s型限制性內(nèi)切酶。
[0024] 本發(fā)明中，融合Fc的主要目的就是在維持GLP-1活性的基礎(chǔ)上，獲得具有更長半衰 期的融合蛋白序列。Fc序列的引入，有可能會介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒作用(ADCC)和補體依 賴的細胞毒作用(CDC)，因此需要對Fc序列進行突變和篩選，以便獲得半衰期長、免疫毒性 低的新分子。如圖1所示，突變是以3種亞型I gG-Fc為混合模板，通過易錯PCR結(jié)合DNA改組來 實現(xiàn)的，所得突變文庫通過IIs型限制性內(nèi)切酶與不同長度的柔性連接肽序列連接，再與 GLP-1拼接，產(chǎn)生含有不同F(xiàn)c突變體的cDNA文庫。
[0025] 另一方面本發(fā)明提供了一種制備GLP-1-Fc融合蛋白的方法，該方法包括利用哺乳 動物表面展示載體p-DisplayS表達并展示突變cDNA文庫編碼的GLP-1-Fc融合蛋白，經(jīng)過磁 珠和流式細胞儀分選，最終獲得具有目的功能的融合蛋白編碼序列。進一步將編碼序列構(gòu) 建到哺乳動物細胞表達載體(例如SGLs)中，轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細胞(例如，CH0-K1細胞制備 重組GLP-1-Fc融合蛋白。分析驗證其生物活性與半衰期。
【附圖說明】
[0026]圖1圖示的是構(gòu)建本發(fā)明篩選文庫的原理圖，其中G為GLP-1，L為不同長度的柔性 連接肽，F(xiàn)為Fc片段。本發(fā)明中GLP-1分子采用通用的GLP-1突變序列，該分子具有抵抗DDP-IV的降解作用;柔性連接肽的氨基酸數(shù)量多少可能會影響GLP-1的活性發(fā)揮，因此，我們設(shè) 計了不同長度的連接肽;本發(fā)明中，融合Fc的主要目的就是在維持GLP-1活性的基礎(chǔ)上，獲 得具有更長半衰期的融合蛋白序列。Fc序列的引入，有可能會介導(dǎo)抗體依賴的細胞毒作用 (ADCC)和補體依賴的細胞毒作用(CDC)，因此需要對Fc序列進行突變和篩選，以便獲得半衰 期長、免疫毒性低的新分子。如附圖1所示，突變是以3種亞型IgG-Fc為混合模板，通過易錯 PCR結(jié)合DNA改組來實現(xiàn)的，所得突變文庫通過IIs型限制性內(nèi)切酶與不同長度的柔性連接 肽序列連接，再與GLP-1拼接，產(chǎn)生含有不同F(xiàn)c突變體的cDNA文庫。利用哺乳動物表面展示 載體p-DisplayS表達并展示突變cDNA文庫編碼的GLP-1-Fc融合蛋白。
[0027] 圖2圖示的是IgGl、IgG2和IgG4的Fc編碼DNA序列之間的同源比對結(jié)果。其中a和b 為設(shè)計PCR上游引物區(qū)域，b部分同源部分（圖2中框線標(biāo)示部分)對應(yīng)上游引物的3'端;a部 分對應(yīng)引物5'端。
[0028]圖3圖示的是本發(fā)明的重組GLP-1-Fc融合蛋白在小鼠體內(nèi)藥效結(jié)果。 實施例
[0029] 實施例1:展示型GLP-1-Fc突變文庫的構(gòu)建
[0030] 1.1合成文庫構(gòu)建模板及引物：
[0031] 分別合成如SEQ ID N0:1所示的GLP-1編碼CDNA(并在其上游引入Sfi酶切位點、下 游引入BsmBI酶切位點）、如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5所示的 柔性連接肽編碼cDNA(每個序列上游含有BsmBI酶切位點，下游含有Bsal酶切位點），以及如 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID 從):8所示的1861、1862和1864的？(：片段的編碼。0嫩；
[0032] 用于Fc片段易錯PCR突變的引物設(shè)計如下：
[0033] 根據(jù)對IgGl、IgG2和IgG4的Fc編碼DNA序列的同源比對，用于PCR的上游引物分a和 b兩部分，其中b部分位于引物的3'端，含有通用序列，其與不同F(xiàn)c編碼DNA的5'端同源序列 (參見附圖2中框線標(biāo)示部分)相匹配;a部分位于引物5'端，對應(yīng)不同F(xiàn)c的核苷酸序列，同時 在引物的5 '端引入Bsal酶切位點，以便與柔性肽進行拼接，3種上游引物如SEQ ID N0: 9、 SEQIDNO:lO、SEQIDNO:10；f*。
[0034] 下游引物為通用引物，與Fc編碼DNA序列的3'端同源序列互補，并引入Sail酶切位 點，以便與P-displayS載體連接，序列如SEQIDN0 :12所示。
[0035] 所有DNA序列和引物均由Genescript公司合成。
[0036] 1.2PCR突變擴增
[0037]按如下表1配制并進行PCR擴增：
[0038] 表1:易錯PCR反應(yīng)液配制表
[0039]
[0040] PCR擴增條件：94°C 3min; 94°C lmin，53 °C lmin，72°C 2min，30個循環(huán)，最后72°C 1 Omin。易錯PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化。
[00411 分別采用限制性內(nèi)切酶Sfil/Sall雙酶切pDisplay展示載體、Sfil/BsmbI雙酶切 GLP-l序列SEQIDN0:l、BsaI/BsmbI雙酶切柔性連接肽編碼序列SEQIDN0:2-5的混合物、 Bsal/Sall雙酶切易錯PCR產(chǎn)物，所有酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后通過DNA連接酶連接在一起，轉(zhuǎn)化 E.coli T0P10感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后菌液涂布于LB平板上(含100g/L Amp)，12h后將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn) 移至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得突變質(zhì)粒文庫pDisplay-GLP-1-Fcs。
[0042]實施例2:突變質(zhì)粒的篩選 [0043] 2.1突變質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染293T:
[0044] 將實施例1獲得的突變質(zhì)粒庫pDisplay-GLP-1-Fcs用PEI試劑（Invitrogen公司） 瞬時轉(zhuǎn)染到293T細胞中，60小時后，用無胰酶消化液（Invitrogen公司）將細胞消化成單 個，PBS洗3遍，備用。
[0045] 2.2磁珠篩選去除與?(：丫1-111具有反應(yīng)性的細胞：
[0046] 生物素化重組人⑶64、⑶32a、⑶16a蛋白均購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。 鏈親和素磁珠分選柱VarioMACS為德國美天旎公司產(chǎn)品。
[0047] 將突變質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)染的細胞計數(shù)，約IX 108細胞，經(jīng)300 Xg離心10min去除上清， 再用標(biāo)記緩沖液重懸，加入lμg/ml生物素化的重組人⑶64、⑶32a、CD16a蛋白標(biāo)記lOmin;用 3ml標(biāo)記緩沖液離心洗滌3次，重懸于900yL標(biāo)記緩沖液中，加入100yL鏈親和素磁珠，于4°C 擺動搖床上孵育15min，用3ml標(biāo)記緩沖液離心洗滌3次，細胞重懸于500yL分離緩沖液中。 [0048]將VarioMACS置于磁力分選架上，用60ml分離緩沖液淋洗，然后將細胞懸液上樣到 柱子上，收集穿透液中未結(jié)合細胞;再用30ml分離緩沖液淋洗，收集穿透液。合并穿透液300 Xg離心10min收集細胞，用于一下步流式分選。
[0049] 2.3流式分選：
[0050]用10nM標(biāo)記有FITC的羊抗人IgG與經(jīng)磁珠分選的細胞共同孵育，室溫lhr，經(jīng)PBS洗 滌3次，用流式細胞儀對其進行分選，收集熒光最強的0.2 %-0.4%的細胞。從第一輪篩選得 到的細胞中提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，提取質(zhì)粒后再次瞬轉(zhuǎn)到293T細胞中，進行 第二輪篩選，同時將羊抗人IgG濃度降低為InM以提高篩選特異性。兩輪分選后，通過對回收 質(zhì)粒進行測序分析，得到GLP-1-Fc融合蛋白的編碼DNA序列，其中出現(xiàn)頻率最高的序列如 SEQ ID N0:13所示。
[0051 ]實施例3:重組GLP-1-Fc融合蛋白的表達與鑒定 [0052] 3.1穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建與篩選：
[0053] 借助PCR在GLP-1-Fc融合蛋白編碼DNA序列的上、下游分別引入Hind III和EcoR I 酶切位點，并將其連接到同樣經(jīng)Hind III和EcoRI雙酶切的SGLs載體中，構(gòu)建表達質(zhì)粒。經(jīng) 酶切和測序鑒定正確的表達質(zhì)粒，以Pvul酶切線性化，利用電穿孔轉(zhuǎn)染CH0S細胞。轉(zhuǎn)染后細 胞鋪于96孔板中，加入25μΜ的MSX進行加壓篩選，獲得單克隆細胞用于重組GLP-1-Fc融合蛋 白的表達與純化。
[0054] 3.2重組61^_1+(：融合蛋白的表達
[0055] 篩選獲得的細胞株接種于搖瓶中，于C02培養(yǎng)搖床中連續(xù)培養(yǎng)12天，收集細胞培養(yǎng) 上清，利用Protein Α親和層析純化融合蛋白（純化體系:ρΗ7.4的10mM PBS平衡液，ρΗ3.0的 50mM檸檬酸緩沖液，pH9.0的Tris-HCl中和液中和)采BCA定量試劑盒對超濾濃縮后的純化 蛋白進行定量。
[0056] 實施例4重組GLP-1-Fc融合蛋白的降糖作用測定
[0057] 以自發(fā)性II型糖尿病動物模型KKAy小鼠為模型動物，采取皮下給藥方式，測試實 施例3制備得到的重組GLP-1-Fc融合蛋白的降糖作用。分別設(shè)立空白對照組和陽性對照組 (Dulagultide藥物組，lmg/kg體重），同時重組GLP-1-Fc融合蛋白分別設(shè)立低、中、高3個劑 量組(0.3/l/3mg/kg體重），結(jié)果如圖3所示。從結(jié)果可知:本發(fā)明的重組GLP-1-Fc融合蛋白 0.3mg/kg組保持了不低于杜拉魯肽(Dulagultide)對照藥物的降糖活性，而與對照藥物杜 拉魯肽同等劑量的lmg/kg組顯示出明顯優(yōu)于對照藥物的降糖作用。
[0058] 實施例5重組GLP-1-Fc融合蛋白的半衰期測定
[0059] 參照W.Glaesner等，Diabetes Metab Res Rev 2010;26:287-296中的方法進行測 定。按照0. lmg/kg體重，單次給予獼猴皮下注射本發(fā)明的重組GLP-1-FC融合蛋白，同等方式 注射同樣劑量的同類已上市藥物dulaglutide作為陽性對照，分別于給藥后第2、4、8、12小 時，2、3、4、8、10、12天采集0.6mL靜脈血，以夾心ELISA測定樣品中GLP-1-Fc含量，采用 WinNonlin軟件計算獼猴血清中GLP-1-Fc的PK參數(shù)，結(jié)果如下表2所示。藥代動力學(xué)參數(shù)表 明，本發(fā)明的重組GLP-1-Fc融合蛋白具有較高的藥時曲線下面積，其半衰期約為57hr，比同 類已上市藥物dulaglutide的半衰期(51.6hr)長10 %左右。
[0060] 表2:重組GLP-1-FC融合蛋白藥代參數(shù)測定
[0061]
序列表 <110>北京正且國際科技育限責(zé)任公司 :<_120> -種長效童姐GLP-1融合蛋?及其制備法和用.途 <130> <160> 14 <170> Patentln version 3..4： <210/ i <2?1> 93 <2L2> DM <213> 人工序列 <220 少
[0062] <221> SLP-1 編碼基因 <222，(?,).. (93) <400> 1 catMMtM^ag gcacttttac ct tcctcatatl laMaKMauca ugctRccaLta 60 eatMyttMKt coaggyaMgM Mgt :9忒 <210/ 2 <211> 30 <212> DNA ，2i3~人工序列 <220> <221>丈性連接肽 <222> (1)..(30) ，棚 2 ggtggcggag ggtx'tggtgg cggagggtcc 30 ，210> 3 y211x 45 <212V DNA. 213,人工序到 <220^ C21 柔性連接肽 '222〉(1),. (44) ，220> <221>柔性連接肽 <222 ^ ⑴...（45) <：400> 3 R^^ciggigg： cggyggglcc 丨ggLca 45
[0063] <210 4 <211> 60 <212> DNA <213> 人丁序列 <220> <2LM>柔性連接肽 ^22> 0).. (60) <400> 4 ggtggcggc-ig ggtctggtgg Cggagggtcc ggtggcggag ggtcaggtgg cggagggtcg 6；0 <210、 5 <2175 ^212> DNA <213>人工序列
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
【主權(quán)項】
1. 一種重組融合蛋白，其包括GLP-1，連接肽和人免疫球蛋白Fc變體。2. 權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白，其中所述的連接肽由2-5組的Gly4Ser組成，其中優(yōu) 選為3組。3. 權(quán)利要求1或2所述的重組融合蛋白，其具有SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列。4. 一種GLP-1-Fc融合蛋白編碼基因，其包含編碼GLP-1的cDNA，編碼柔性連接肽的 cDNA，以及編碼Fc的突變cDNA序列。5. 權(quán)利要求4所述的GLP-1-Fc融合蛋白編碼基因，其中所述的編碼GLP-1的cDNA具有如 SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。6. 權(quán)利要求4或5所述的GLP-1-Fc融合蛋白編碼基因，其中所述的編碼柔性連接肽的 cDNA具有選自SEQ ID NOs: 2-5所示的核苷酸序列。7. 權(quán)利要求4所述的GLP-1-FC融合蛋白編碼基因，其具有如SEQIDN0:13所示的核苷 酸序列。8. -種用于降血糖治療II型糖尿病的藥物組合物，其中包含權(quán)利要求1至3任一項所述 的重組融合蛋白和藥物學(xué)上可接受的載體。9. 權(quán)利要求1至3任一項所述的重組融合蛋白或者權(quán)利要求4-7任一項所述的GLP-1-Fc 融合蛋白編碼基因在制備用于防治II型糖尿病的藥物中的用途。10. -種制備GLP-1-Fc重組融合蛋白的方法，包括：（a)合成編碼GLP-1的cDNA序列；（b) 合成編碼柔性連接肽的cDNA序列；（c)擴增編碼Fc的突變cDNA，（i)合成IgGl、IgG2和 IgG4cDNA; (i i)合成引物；（i i i)以IgGl、IgG2和IgG4cDNA混合物為模板(例如1:1:1混合）， 使用（ii)合成的引物，進行PCR擴增，得到不同的Fc的突變cDNA;⑷將編碼GLP-1的cDNA序 列、編碼柔性連接肽cDNA序列、不同的Fc突變cDNA序列通過限制性酶切后連接，得到含有不 同F(xiàn)c突變序列的GLP-1-Fc cDNA文庫；（e)利用哺乳動物表面展示載體p-DisplayS表達并展 示突變cDNA文庫編碼的GLP-1-Fc融合蛋白，經(jīng)過磁珠和流式細胞儀分選，最終獲得具有目 的功能的融合蛋白編碼序列；（f)將編碼序列構(gòu)建到哺乳動物細胞表達載體中，轉(zhuǎn)染哺乳動 物宿主細胞制備重組GLP-1-Fc融合蛋白。
【文檔編號】A61K38/26GK106008717SQ201610046012
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年1月22日
【發(fā)明人】宋海峰, 高新, 楊懿, 萬德有, 馮紅茹, 崔新玲, 劉蘊慧, 楊利, 陳方
【申請人】北京正旦國際科技有限責(zé)任公司