β1-α1及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地指一種重組蛋白M0G35-55-I-Abβ1- α 1及 其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 主要組織相容性分子（MajorHistocompatibilityComplex,MHC)對(duì)于機(jī)體 免疫應(yīng)答的發(fā)生與強(qiáng)度具有十分重要的作用。在天然情況下，抗原提呈細(xì)胞（Antigen presentingcell,APC)將抗原膚提呈給T細(xì)胞，CD4叮細(xì)胞識(shí)別抗原膚/MHC-II類分子復(fù) 合物；而CD8叮細(xì)胞識(shí)別抗原膚/Mffi：-I類分子復(fù)合物。在此過(guò)程中，T細(xì)胞的充分活化需 要雙信號(hào)： 陽(yáng)00引①TCR與共受體CD4/CD8與pM肥特異性結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第一信號(hào)；
[0004] ②APC和T細(xì)胞表面的多種共刺激分子相互作用，提供T細(xì)胞激活所必須的共刺 激信號(hào)。
[0005] 如果只有提供的第一信號(hào)，缺乏共刺激信號(hào)，則該特異性T細(xì)胞會(huì)發(fā)生克隆 無(wú)能（clonalanergy)，表現(xiàn)為特異性免疫耐受?；谶\(yùn)個(gè)原理，近二十年來(lái)，國(guó)內(nèi)、外實(shí)驗(yàn) 室研究開(kāi)發(fā)出多種形式的可溶性pMHC分子，它們能夠有效地結(jié)合、封閉抗原特異性T細(xì)胞， 但是由于缺乏共刺激分子所提供的第二信號(hào)，導(dǎo)致相應(yīng)的T細(xì)胞發(fā)生克隆無(wú)能及免疫耐 受，在同種移植排斥、自身免疫性疾病、超敏反應(yīng)等多個(gè)疾病領(lǐng)域表現(xiàn)出重要的治療潛力。
[0006] 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)是人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis,IVB)的動(dòng)物模型，髓銷憐脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（myelinoligoden化oc^e glycoprotein，M0G)的優(yōu)勢(shì)表位M0G35-55能夠在巧7BL/6小鼠中誘生自身反應(yīng)性Τ細(xì)胞 從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研制一種可溶性pMHC分子對(duì)小鼠ΕΑΕ模型進(jìn)行治療，可為人類多發(fā) 性硬化的治療提供依據(jù)。
[0007] 目前，還沒(méi)有一種用于治療人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的藥品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種重組蛋白M0G35-55-I-Abβ1- α 1及其 基因和應(yīng)用。該重組蛋白可W用于治療人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的藥品的研發(fā)。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種重組蛋白Μ0635-55-Ι-Α"β1-α1，其氨基酸 序列如SEQIDNo. 1所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種編碼重組蛋白M0G35-55-I-Abp1-α1的基因 MOG35-55-I-Ab0 1-α1，其核巧酸序列如沈QIDNo. 2。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求2所述基因的原核表達(dá)載 體；其中，所述的原核表達(dá)載體為祀T30a表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有上述重組表達(dá)載體的大腸桿菌化21表達(dá)菌株。
[0013] 下述各項(xiàng)之一在合成用于治療人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的藥品中應(yīng)用。
[0014] 1)含有編碼重組蛋白MOG35-55-I-Ab0 1-α1 的基因MOG35-55-I-Ab0 1-α1 的重 組表達(dá)載體，
[0015] 2)含有上述的重組表達(dá)載體的大腸桿菌化21表達(dá)菌株。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種重組蛋白在治療人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的藥品 中應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[001引本發(fā)明根據(jù)原核表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性設(shè)計(jì)了一段融合基 因MOG35-55-I-Ab0 1-α1，并在大腸桿菌化2UDE3)中表達(dá)此可溶性蛋白 MOG35-55-I-Ab0 1-α1。該可溶性蛋白有望通過(guò)封閉M0G35-55特異性Τ細(xì)胞緩解ΕΑΕ，為 后續(xù)進(jìn)一步誘導(dǎo)巧7BL/6小鼠Τ細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為融合蛋白MOG35-55-I-Ab0 1-α1的蛋白表達(dá)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了更好地解釋本發(fā)明，W下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于W下實(shí)施例。
[0021] 實(shí)驗(yàn)材料
[0022] 祀T30a質(zhì)粒、BL21 (DE3)菌株為我室保存；ProteinMarker購(gòu)自化rmentas，貨號(hào) 26610 ;Ac;r、Bis、T;ris等購(gòu)自Sigma公司；SDS購(gòu)自Amresco公司；Ty巧tone、"'ieastExtract 購(gòu)自O(shè)XOID公司。 陽(yáng)〇2引實(shí)施例1
[0024] 1、重組融合基因M0G35-55-I-Abβ1-α1的密碼子優(yōu)化及全基因合成 陽(yáng)02引在Genebank分別查出M0G35-55、I-Abβ1和I-Abα1的核巧酸序列，進(jìn)行拼接，得 到一段融合蛋白的氨基酸序列MOG35-55-I-Ab0 1-α1如SEQIDNo. 1所示。
[00%] 按照原核表達(dá)系統(tǒng)使用密碼子的偏性對(duì)表達(dá)上述融合蛋白的基因序列進(jìn)行優(yōu)化， 加入起始密碼子與終止密碼子，得到優(yōu)化后的融合重組MOG35-55-I-Ab01-α1，其核巧酸 序列如SEQIDNo. 2。
[0027] 并將上述序列亞克隆到祀T30a載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET30a[M0G35-55-I-Abβ1-α1]。基因測(cè)序結(jié)果與目的序列進(jìn)行分析比對(duì)。 陽(yáng)0測(cè) 實(shí)施例2
[0029] 1、蛋白表達(dá)
[0030] 1)將祀T[M0G35-55-I-Abβ1-α1]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
[0031] 2)挑取陽(yáng)性克隆接種到5ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基。
[0032] 3)37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，第二天按1:100接種到5ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，共 4組。37°C振蕩培養(yǎng)到0D550 = 0. 5,按照下面條件進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)：
[0033] (l)IPTGOmM37°C培養(yǎng)化
[0034] 0)IPTG0. 5mM37°C誘導(dǎo) 3h
[0035] 做IPTG 0. 5mM 30°C誘導(dǎo)12h
[0036] (4) IPTG0.5mM 37°C誘導(dǎo)24h
[0037] 4)收集誘導(dǎo)完畢的細(xì)胞，超聲裂解，離屯、收集上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳 檢測(cè)目的蛋白分布。 W測(cè)2結(jié)果
[0039] 2. 1融合基因M0G35-55-I-Ab β 1-α1的鑒定
[0040] 將密碼子優(yōu)化后的融合基因進(jìn)行全基因合成，對(duì)合成好的基因進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè) 序結(jié)果與目的基因比對(duì)的結(jié)果證明合成基因正確無(wú)誤，附比對(duì)結(jié)果。
[0041] 2. 2融合基因MOG35-55-I-Ab0 1-α 1的表達(dá) 陽(yáng)0創(chuàng)全基因合成M0G35-55-I-Ab 0 1- α 1融合基因，亞克隆到祀T30a載體，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌化2UDE3)感受態(tài)，挑取克隆在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。采用37°C，30°C，13°C^個(gè)誘導(dǎo)條件進(jìn)行誘導(dǎo)小試。實(shí)驗(yàn)表明，融合蛋白 MOG35-55-I-Ab0 1-α 1在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得了成功表達(dá)，并且，30°C誘導(dǎo)1化的表達(dá)量最 高，多數(shù)蛋白分布在沉淀中，少量蛋白分布在上清中，圖1。
[0043] 其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的 描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可W根據(jù)本實(shí)施例在不 經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，運(yùn)些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組蛋白MOG35-55-I-Ab0 1-α1，其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因MOG35-55-I-Abf3 1-α1，其核苷酸序列如SEQID No. 2 〇3. -種重組表達(dá)載體，其特征在于：它含有權(quán)利要求2所述基因的原核表達(dá)載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述的原核表達(dá)載體為pET30a 表達(dá)載體。5. 含有權(quán)利要求3和4所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。6. 下述各項(xiàng)之一在合成用于治療人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的藥品中應(yīng)用。 1) 權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體， 2) 含有權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。7. -種權(quán)利要求1所述的重組蛋白在治療人類自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥的藥品 中應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組蛋白MOG35-55-I-Abβ1-α1及其基因和應(yīng)用。該重組蛋白MOG35-55-I-Abβ1-α1，其氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本發(fā)明根據(jù)原核表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏好性設(shè)計(jì)了一段融合基因MOG35-55-I-Abβ1-α1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)此可溶性蛋白MOG35-55-I-Abβ1-α1。該可溶性蛋白有望通過(guò)封閉MOG35-55特異性T細(xì)胞緩解EAE，為后續(xù)進(jìn)一步誘導(dǎo)C57BL/6小鼠T細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
【IPC分類】A61K48/00, C12N15/62, A61K38/36, A61K35/74, C07K19/00, C12N15/70, A61P25/00, A61P37/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105254765
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510653952
【發(fā)明人】龔業(yè)莉
【申請(qǐng)人】江漢大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月10日