專利名稱：一種人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞系，尤其涉及一種人結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)正常干細(xì)胞自我更新相關(guān)因子，具有高克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力，具有腫瘤干細(xì)胞特征，及其可應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞的研究、藥物開發(fā)和相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重威脅人類生存和健康的疾病。近幾十年來，隨著科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)于癌癥的認(rèn)識(shí)有了顯著的深入。但是傳統(tǒng)的治療方式并不能徹底治愈癌癥，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移往往是導(dǎo)致癌癥病人死亡的原因。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織無論是原發(fā)腫瘤還是轉(zhuǎn)移癌中都包含有不同特征和功能的癌細(xì)胞:高度分化的癌細(xì)胞增殖能力較弱；而具有低分化表型的癌細(xì)胞卻具有很強(qiáng)的增殖能力，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生和原發(fā)腫瘤表型類似的腫瘤，有此功能的這部分細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(Al-Hajj and Clarke，2004)。
近年來，支持腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的研究不斷涌現(xiàn)，目前從腦瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌等癌組織中分離和鑒定出腫瘤干細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞具有與正常干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性(Spillane and Henderson, 2007 ；Sagar et al., 2007),包括自我更新、分化、死亡耐受、膜轉(zhuǎn)運(yùn)活躍、侵襲和轉(zhuǎn)移等。目前通過對(duì)腫瘤干細(xì)胞的研究認(rèn)識(shí)到，癌癥的發(fā)生和生長(zhǎng)是由一小部分腫瘤干細(xì)胞群決定的，腫瘤干細(xì)胞有著不同于普通癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的生物學(xué)特征，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的特征包括I)在腫瘤中存在比例很低，僅有數(shù)很少的一群癌細(xì)胞具有無限增殖能力；2)具有腫瘤形成能力，通過流式細(xì)胞技術(shù)或其他免疫分選技術(shù)根據(jù)表面特異分子分離出來的細(xì)胞接種到動(dòng)物體內(nèi)能夠形成新的腫瘤。
腫瘤干細(xì)胞一般在腫瘤中所占比例低，它們通常處于細(xì)胞周期的GO期，具有較高的耐藥性，對(duì)射線不敏感性。常規(guī)的化療或放療只能殺死快速分裂的普通癌細(xì)胞，而對(duì)這一小群腫瘤干細(xì)胞作用甚微。逃脫藥物和射線殺傷作用的腫瘤干細(xì)胞成為癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。腫瘤干細(xì)胞能夠啟動(dòng)腫瘤發(fā)生,并且這一小群細(xì)胞能夠維持腫瘤生長(zhǎng),腫瘤干細(xì)胞的特征為開發(fā)新型高效的診斷和治療手段提供了新思路。按照腫瘤干細(xì)胞的理論模型，常規(guī)的治療方式不能有效地清除腫瘤干細(xì)胞，殺死普通癌細(xì)胞只能暫時(shí)緩解癌癥，癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)在所難免。盡管目前臨床上有多種非常成功的治療腫瘤的藥物，可以有效緩解腫瘤，但是這種藥物并沒有治愈疾病，相當(dāng)大比例的患者會(huì)發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)。原因是傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的篩選是根據(jù)短期臨床治療效果評(píng)估的，因此那些能迅速殺死大量普通癌細(xì)胞的藥物往往被篩選出來，能夠殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物反而因?yàn)樽饔脮r(shí)間長(zhǎng)、短期療效不明顯而被剔除。而針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的藥物雖然`在短期內(nèi)效果不太明顯，但是由于遏制癌癥發(fā)展的源頭，長(zhǎng)期效果更加顯著。腫瘤干細(xì)胞模型為設(shè)計(jì)高效徹底治愈癌癥的治療方法提供了思路:通過傳統(tǒng)治療殺死普通癌細(xì)胞，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞特異性靶點(diǎn)來抑制腫瘤干細(xì)胞功能或清除腫瘤干細(xì)胞，可能會(huì)達(dá)到既療效顯著又能徹底治愈的效果。更精確地靶向腫瘤干細(xì)胞的藥物療效將會(huì)更加持久，副作用更小，可能達(dá)到完全治愈的目的。
腫瘤干細(xì)胞的概念為癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的思路，這方面的深入研究有可能為腫瘤的治療和早期診斷帶來新的契機(jī)。尋找腫瘤干細(xì)胞特異標(biāo)志及信號(hào)通路，找到能有效殺傷腫瘤干細(xì)胞的方法和手段，將為癌癥的治療提供新的思路。然而制約腫瘤干細(xì)胞研究的主要困難在于腫瘤干細(xì)胞數(shù)目稀少，且在體外培養(yǎng)容易分化為普通癌細(xì)胞。
目前國(guó)內(nèi)外尚無腫瘤干細(xì)胞系的報(bào)道，腫瘤干細(xì)胞主要來源于運(yùn)用流式細(xì)胞分選技術(shù)從臨床樣本中獲得特定表面蛋白(如⑶44，⑶133，⑶24等)標(biāo)記的原代癌細(xì)胞，這就導(dǎo)致了腫瘤干細(xì)胞活力低和樣本之間差異大的問題。由于原代腫瘤干細(xì)胞在普通體外培養(yǎng)條件下極易分化程普通癌細(xì)胞，極大制約了腫瘤干細(xì)胞的深入研究。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有條件的不足，提供一種具有腫瘤干細(xì)胞特征的細(xì)胞系，從而能夠更為有效地進(jìn)行殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物開發(fā)，從根本上治療腫瘤。
本發(fā)明的另一目的是提供一種腫瘤干細(xì)胞的建系方法，其用于分離、鑒定腫瘤干細(xì)胞特征，還提供一種長(zhǎng)期培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞系的技術(shù)，用于在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)體系內(nèi)獲得穩(wěn)定和充足的腫瘤干細(xì)胞來源。
針對(duì)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)CD44膜蛋白的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為保藏號(hào)為CGMCC N0.5558的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系P6C (該細(xì)胞系的分類命名為人結(jié)腸癌干細(xì)胞，并于2011年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；郵編:100101)。
另一方面，本發(fā)明提供一種人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系P6C的指示細(xì)胞系，所述細(xì)胞系通過將0tc3/4啟動(dòng)子連接EGFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于本發(fā)明所述的細(xì)胞系而得。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞系能夠形成腫瘤。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞系形成的腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤。
優(yōu)選地，所述形成的腫瘤能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移。
更優(yōu)選地，所述形 成的腫瘤能夠轉(zhuǎn)移到肝臟。
再一方面，本發(fā)明提供一種高表達(dá)CD44膜蛋白的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟:
I)分離原代結(jié)腸癌干細(xì)胞:取結(jié)腸癌組織剪碎后，消化獲得單細(xì)胞懸液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647單抗和小鼠抗人⑶44FITC單抗孵育；再用無菌流式細(xì)胞分選技術(shù)分離出原代結(jié)腸癌細(xì)胞；
2)原代結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外培養(yǎng):稀釋步驟I)獲得的原代細(xì)胞，接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)；
3)結(jié)腸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:當(dāng)原代細(xì)胞形成的懸浮球狀克隆直徑達(dá)到0.5毫米左右時(shí)，離心去上清，再將其消化后，以1: 5的比例重新接種到新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中，篩選體內(nèi)成瘤能力和體外克隆形成能力的P6C細(xì)胞；
4)將步驟3)獲得的結(jié)腸癌干細(xì)胞再次按與步驟I)、2)和3)相同的方法分離、培養(yǎng)篩選表達(dá)⑶44膜蛋白的腫瘤干細(xì)胞系P6C，即得。
優(yōu)選地，還包括將0tc3/4啟動(dòng)子連接于EGFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于步驟4)獲得的腫瘤干細(xì)胞系。
又一方面，本發(fā)明提供一種上述所述的細(xì)胞系或所述的方法制得的細(xì)胞系在制備用于誘導(dǎo)腫瘤形成的藥物中的應(yīng)用。
另一方面，本發(fā)明提供一種上述所述的細(xì)胞系或所述的方法制得的細(xì)胞系在制備用于轉(zhuǎn)移腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
再一方面，本發(fā)明提供一種上述所述的細(xì)胞系或所述的方法制得的細(xì)胞系在制備篩選抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的腫瘤干細(xì)胞系表達(dá)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白，具有極高的克隆形成你能力和體內(nèi)成瘤能力，并對(duì)多種臨床抗腫瘤藥物具有極強(qiáng)的耐藥性，能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)，從而細(xì)胞系材料應(yīng)用于腫瘤和腫瘤干細(xì)胞的藥物開發(fā)。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
圖1表明流式細(xì)胞儀分選EpCAM+CD44+的原代結(jié)腸癌細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果圖，其中，圖1A為流式細(xì)胞儀分選EpCAM+原代結(jié)腸癌細(xì)胞的點(diǎn)樣分布圖，圖中I為不表達(dá)EpCAM的細(xì)胞，2為表達(dá)EpCAM的細(xì)胞；圖1B為流式細(xì)胞儀分選EpCAM+CD44+原代結(jié)腸癌細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果圖2表明EpCAM+⑶44+原代結(jié)腸癌干細(xì)胞的克隆形成能力；
圖3表明EGFP指示本發(fā)明所述腫瘤干細(xì)胞系P6C的指示細(xì)胞系的0ct3/4啟動(dòng)子的激活狀態(tài)；
圖4表明流式細(xì)胞技術(shù)分析本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C膜蛋白表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果，其中，圖4A為本發(fā)明所述腫瘤干細(xì)胞系P6C的膜蛋白表達(dá)的流式細(xì)胞分析圖，其中Ml表示不表達(dá)該膜蛋白，即陰性；M2表示表達(dá)該膜蛋白，即陽性；圖48為本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C膜蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖5表明本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C表達(dá)干細(xì)胞因子0ct3/4，其中，圖5A為細(xì)胞系P6C表達(dá)的內(nèi)源性0ct3/4免疫熒光結(jié)果，圖5B為細(xì)胞系P6C的DAPI染核結(jié)果，圖5C為A與B熒光疊加結(jié)果；
圖6表明本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C具有很高的克隆形成能力，其中，圖6A為發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6 C、HCTl 16和SW480的克隆結(jié)果圖，圖6B為本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C、HCT116和SW480克隆數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖7表明本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C的皮下成瘤能力；
圖8表明本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C能夠在原位形成腫瘤，并能夠轉(zhuǎn)移到肝臟。
圖9表明本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C對(duì)喜樹堿(camptothecin)具有很高的耐藥性，其中，圖9A為喜樹堿處理本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C、HCT116和SW480的細(xì)胞形態(tài)圖，其中的對(duì)照為未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞形態(tài)，圖9B為喜樹堿處理本發(fā)明所述的腫瘤干細(xì)胞系P6C、HCTl 16和SW480存活細(xì)胞統(tǒng)計(jì)本發(fā)明的生物材料的保藏信息:
保藏號(hào)為CGMCC N0.5558的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系P6C，該細(xì)胞系的分類命名為人結(jié)腸癌干細(xì)胞，并于2011年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；郵編:100101ο具體實(shí)施方式
除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的裸鼠品種均為BALB/c nude，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所；結(jié)腸癌組織，取自北京腫瘤醫(yī)院；結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480均購(gòu)自ATCC。
除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的細(xì)胞培養(yǎng)液均為:2%胎牛血清(購(gòu)自Hyclone公司)，8%血清替代物(購(gòu)自Gibco), IX非必須氨基酸(購(gòu)自Gibco), 100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(購(gòu)自Gibco)。
除非特別指明，以下實(shí)施例所用的DAPI染核方法參見:Karen G.Porter andYvette S.Feig,The Use of DAPI for Identifying and Counting Aquatic Microflora,Limnology and oceanography，1980 年，25 (5)期(卷)，943-948 頁。
實(shí)施例1分離、鑒定原代結(jié)腸癌干細(xì)胞
a)分離原代結(jié)腸癌干細(xì)胞:取結(jié)腸癌病人新鮮結(jié)腸癌組織(取自北京腫瘤醫(yī)院)，在含有300單位/毫升(U/mL)青霉素和300U/mL鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗3次；用無菌眼科剪將其剪碎；加入I毫克/毫升(mg/mL)膠原酶(購(gòu)自Sigma公司)和lmg/mL透明質(zhì)酸酶(購(gòu)自Sigma公司)消化液,于37°C消化30分鐘(min);離心去上清,PBS重懸后用40微米細(xì)胞篩過濾獲得單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞與小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647單抗(I: 50，購(gòu)自Cell Signaling公司)，小鼠抗人CD44FITC單抗(I: 50，購(gòu)自BD公司)一起4°C孵育15分鐘；然后用無菌流式細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)分離出EpCAM+CD44+的原代結(jié)腸癌細(xì)胞。圖1A中紅色點(diǎn)即2為表達(dá)EpCAM的細(xì)胞，即EpCAM+ ;圖1B細(xì)胞均為圖1A中紅色點(diǎn)細(xì)胞(圖1中的2)，即EpCAM+，其中P2為表達(dá)EpCAM，表達(dá)⑶44的細(xì)胞，即EpCAM+⑶44+，P3為表達(dá)EpCAM，不表達(dá)CD44的細(xì)胞，即EpCAM+CD44_。
b)原代結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外培養(yǎng):稀釋原代細(xì)胞，以平均0.5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，培養(yǎng)條件為2%胎牛血清(購(gòu)自Hyclone公司)，8%血清替代物(購(gòu)自Gibco)，I X非必須 氨基酸(購(gòu)自Gibco)，100U/mL青霉素，100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(購(gòu)自Gibco),于37°C、5% 二氧化碳、95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱(購(gòu)自Sanyo公司)中進(jìn)行培養(yǎng)。三天換細(xì)胞培養(yǎng)液一次，取單細(xì)胞來源的克隆。
c)結(jié)腸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:當(dāng)原代細(xì)胞形成的懸浮球狀克隆直徑達(dá)到0.5毫米左右時(shí)，300g離心5分鐘，去上清；加入0.25%胰蛋白酶(購(gòu)自Sigma公司)，37°C消化10分鐘；輕輕將細(xì)胞球吹散后以1: 5的比例重新接種到新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中。體內(nèi)成瘤能力和體外克隆形成能力是鑒定腫瘤干細(xì)胞特征的兩個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)。上述低粘附板中的球狀克隆長(zhǎng)至0.5_直徑時(shí)，用玻璃管小心吸出單個(gè)克隆球，接種到裸鼠(BALB/c nude，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所)皮下，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄腫瘤大小，計(jì)算體積。當(dāng)皮下腫瘤長(zhǎng)軸達(dá)到5mm或40天時(shí)，處死裸鼠，剝?nèi)∑は履[瘤。部分腫瘤繼續(xù)接種到裸鼠皮下，檢測(cè)次級(jí)皮下腫瘤的發(fā)生；部分腫瘤固定在10%中性福爾馬林溶液中，石蠟包埋切片，免疫組化方式檢測(cè)CD44等腫瘤干細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)，蘇木素/伊紅(H&E)染色觀察皮下腫瘤的組織形態(tài)；還有部分腫瘤用膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞技術(shù)分析CD44等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)。除體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)以外，傳代中的單細(xì)胞懸液經(jīng)過計(jì)數(shù)以后接種1000個(gè)到0.35%軟瓊脂中，21天以后用結(jié)晶紫染色，所有克隆均可以被染上藍(lán)紫色(圖2)。只統(tǒng)計(jì)直徑大于等于0.5mm的克隆的數(shù)目，計(jì)算克隆形成能力(=克隆數(shù)目/1000X 100%)o
實(shí)施例2建立具有腫瘤干細(xì)胞特征的細(xì)胞系
a)表達(dá)CD44膜蛋白的腫瘤干細(xì)胞系的建立:用上述方法分離、培養(yǎng)獲得的結(jié)腸癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征，具有極高的腫瘤形成能力和克隆形成能力，命名為P6C。P6C能在體外穩(wěn)定傳代，目前已經(jīng)傳代到第120代。P6C在低粘附培養(yǎng)條件下形成懸浮的克隆球，在粘附條件下能貼壁形成干細(xì)胞樣克隆(holoclone)。
b)0ct3/4啟動(dòng)子激活指示細(xì)胞系的建立:0ct3/4啟動(dòng)子被調(diào)控激活狀態(tài)下EGFP表達(dá)發(fā)出綠色熒光，以此指示干細(xì)胞因子0ct3/4的活化狀態(tài)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞系P6C的前一天，將細(xì)胞系P6C從克隆球中用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，預(yù)鋪于鋪有明膠的六孔板中(2X IO5個(gè)細(xì)胞/孔)。0ct3/4promoter EGFP質(zhì)粒(該質(zhì)粒為0ct3/4啟動(dòng)子克隆到EGFP基因上游的質(zhì)粒)，購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，取2 μ g該質(zhì)粒與6 μ L脂質(zhì)體lipo2000 (購(gòu)自Invitrogen公司)的混合物；6小時(shí)后吸去質(zhì)粒_脂質(zhì)體，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，隔天換細(xì)胞培養(yǎng)液(與前述細(xì)胞培養(yǎng)液一致)。第三天收集所有細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選表達(dá)EGFP的細(xì)胞，于新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)；1周以后再次收集細(xì)胞，流式分選表達(dá)EGFP的細(xì)胞；重復(fù)分選I次，把分選到的細(xì)胞以平均0.5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中，得到EGFP綠色突光指示0ct3/4啟動(dòng)子激活狀態(tài)的P6C指示細(xì)胞,如圖3所示。
實(shí)施例3腫瘤干細(xì)胞系P6C的分化特性檢測(cè)
a)將貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞系P6C用0.2%胰蛋白酶37°C消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，加入PH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)至終濃度為IO6個(gè)細(xì)胞/毫升。
b)分別加入熒光標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體ant1-⑶24 (I: 50，購(gòu)自Biolegend) ;anti_CD44(l: 50,購(gòu)自 BD pharmingen) ;anti_CD133 (1: 50,購(gòu)自Miltenyi) ;ant1-CD45_FITC(I: 50，購(gòu)自 BD pharmingen) ;anti_CD31(l: 50，購(gòu)自 BDpharmingen) ;anti_CKl (1: 50,購(gòu)自 Santa Cruz) ；ant1-CK20 (1: 50,購(gòu)自 Santa Cruz)；ant1-CDX2(l: 100，購(gòu)自 DAKO)。
c)4°C孵育20分 鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)應(yīng)抗原的表達(dá)情況；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG與P6C細(xì)胞系孵育作為陰性對(duì)照。
如圖4所示，表明細(xì)胞系P6C表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物⑶24，癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物⑶44，⑶133 ;不表達(dá)內(nèi)皮來源標(biāo)志物⑶45，⑶31 ;低表達(dá)分化的癌細(xì)胞標(biāo)志物CK1、CK20、⑶X2。球狀克隆狀態(tài)的P6C(P6MC)表達(dá)更多的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白⑶44和⑶133。結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480作為分化癌細(xì)胞對(duì)照。
實(shí)施例4腫瘤干細(xì)朐系P6C表汰干細(xì)朐閔子0ct3/4
a)在低粘附培養(yǎng)板中如實(shí)施例1所述條件下培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞系P6C，收集P6C球狀克隆。
b)加入多聚甲醒(購(gòu)自Sigma公司)固定20分鐘，2N HCl處理20分鐘。
c)加入小鼠抗人0ct3/4單克隆抗體(購(gòu)自Santa Cruz公司)，室溫孵育3小時(shí)。
d)加入Cy3標(biāo)記的抗小鼠IgG 二抗。
e) DAPI復(fù)染細(xì)胞核后封片。
如圖5所示，熒光顯微鏡下檢測(cè)到P6C表達(dá)內(nèi)源性0ct3/4，且與DAPI染色結(jié)果重合，表明0ct3/4定位于細(xì)胞核中。
實(shí)施例5腫瘤干細(xì)胞系P6C體外克隆形成能力檢測(cè)
a)細(xì)胞系P6C用0.2%胰蛋白酶37°C消化10分鐘，玻璃管吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。
b) IOOOrpm離心去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液(同前所述)至終濃度IO4個(gè)細(xì)胞/毫升。
c)取20微升P6C單細(xì)胞懸液接種于六孔板，每4_5天更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。
d)21天以后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，pH7.2磷酸鹽緩沖液洗I次。
e)加入1%結(jié)晶紫(購(gòu)自Sigma公司)染色，PBS洗一次。計(jì)算每孔克隆數(shù)量，結(jié)果如圖6所示，顯示P6C的克隆形成能力顯著高于結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480。
實(shí)施例6腫瘤干細(xì)胞系P6C在免疫缺陷小鼠皮下形成腫瘤
a) 2 X IO6個(gè)P6C細(xì)胞接種在六孔板中，加入如前所述的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)。
b)將DsRed紅色熒光質(zhì)粒(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所)I μ g與3 μ L轉(zhuǎn)染試劑(購(gòu)自O(shè)rigen公司)在200 μ L無血清DMEM中混合均勻，滴入預(yù)鋪P6C細(xì)胞的六孔板中，共同孵育6小時(shí)。
c)吸去細(xì)胞培養(yǎng)液混合物，加入如前所述細(xì)胞培養(yǎng)液，24小時(shí)之后在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光，估算轉(zhuǎn)染效率。
d)往細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.5 μ g/mL終濃度的嘌呤霉素(puromycin)(購(gòu)自Sigma公司)，隔天吸去死細(xì)胞并加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液(含嘌呤霉素)，重復(fù)4次，獲得穩(wěn)定表達(dá)DsRed紅色熒光蛋白的P6C細(xì)胞。
e)0.2%胰蛋白酶消化此細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，并以平均0.5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中。14天后取形成的單細(xì)胞克隆接種于裸鼠(BALB/cnude，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所)皮下，用活體熒光成像的方法檢測(cè)皮下腫瘤的形成，如圖7所示。
實(shí)施例7腫瘤干細(xì)胞系P6C能在免疫缺陷小鼠盲腸形成原位腫瘤
a)以3X IO5個(gè)細(xì)胞/mL細(xì)胞培養(yǎng)液的密度將穩(wěn)定表達(dá)DsRed紅色熒光的P6C腫瘤干細(xì)胞系接種在底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中，加入如前所述的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
b)0.2%胰蛋白酶消化此細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并以2X107個(gè)細(xì)胞/mL的濃度重懸在磷酸鹽緩沖液PBS中。
c) 100 μ L 3%戊巴比妥溶液腹腔注射聯(lián)合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所)，待5分鐘小鼠麻醉后在超凈工作臺(tái)剪開小鼠腹膜，暴露盲腸。
d)用胰島素針吸取50 μ L P6C細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液移植到盲腸腸壁。
e)手術(shù)縫合小鼠腹膜和皮膚，4周后用活體熒光成像的方法檢測(cè)盲腸原位腫瘤的形成，如圖8所示。
實(shí)施例8腫瘤干細(xì)胞系P6C形成的腫瘤能夠轉(zhuǎn)移到肝臟
a)以3X IO5個(gè)細(xì)胞/mL細(xì)胞 培養(yǎng)液的密度將穩(wěn)定表達(dá)DsRed紅色熒光的P6C腫瘤干細(xì)胞系接種在底面積為25cm2的培養(yǎng)瓶中，加入如前所述的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
b)0.2%胰蛋白酶消化此細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并以2X107個(gè)細(xì)胞/mL的濃度重懸在磷酸鹽緩沖液PBS中。
c) 100 μ L 3%戊巴比妥溶液腹腔注射聯(lián)合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所)，待5分鐘小鼠麻醉后在超凈工作臺(tái)剪開小鼠腹膜，暴露盲腸。
d)用胰島素針吸取50 μ L P6C細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液移植到盲腸腸壁。
e)手術(shù)縫合小鼠腹膜和皮膚，12周后用活體熒光成像的方法檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移到肝臟，如圖8所示。
實(shí)施例9腫瘤干細(xì)胞系P6C的耐藥性
a)將P6C細(xì)胞克隆球用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，預(yù)鋪于鋪有明膠的六孔板中(2 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24小時(shí)。
b)加入終濃度為2 μ M, 5 μ M喜樹堿(Camptothecin,購(gòu)自Sigma公司),培養(yǎng)24小時(shí)至48小時(shí)。
c)明場(chǎng)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，按與步驟b)相同的方法處理的普通結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116(購(gòu)自ATCC)和SW480作為一般結(jié)腸癌細(xì)胞系耐藥性對(duì)照，未加喜樹堿處理的P6C、HCT116和SW480細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
d)收集所有貼壁和懸浮的細(xì)胞，AnnexinV/PI染色(Manon van Engeland, LucJ.W.Nieland, Fran s C.S.Ramaekers, Bert Schutte, and Chris P.M.Reutelingsperger,Annexin V-Affinity Assay:Α Review on an Apoptosis Detection System Based onPhosphatidylserine Exposure，Cytometry, 1998 年，31 期，1-9 頁)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)活細(xì)胞比例。
試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，圖示濃度和作用時(shí)間下細(xì)胞形態(tài)的檢測(cè)(圖9A)和MTT細(xì)胞活力檢測(cè)(Denis Gerlier, Nicole Thomasset，Use of MTT colorimetric assay tomeasure cell activation,Journal of Immunological Methods，94 卷，1-2 期，57-63 頁，1986年)(圖9B)都顯示相對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480，P6C都具有高耐藥性。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)CD44 I吳蛋白的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為保減號(hào)為CGMCCN0.5558的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系P6C。
2.一種人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系P6C的指示細(xì)胞系，所述細(xì)胞系通過將Otc3/4啟動(dòng)子連接EGFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系能夠形成腫瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述腫瘤能夠發(fā)生轉(zhuǎn)移，優(yōu)選地，所述腫瘤能夠轉(zhuǎn)移到肝臟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟: 1)分離原代結(jié)腸癌干細(xì)胞:取結(jié)腸癌組織剪碎后，消化獲得單細(xì)胞懸液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647單抗和小鼠抗人⑶44 FITC單抗孵育；再用無菌流式細(xì)胞分選技術(shù)分離出原代結(jié)腸癌細(xì)胞； 2)原代結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外培養(yǎng):稀釋步驟I)獲得的原代細(xì)胞，接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)； 3)結(jié)腸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:當(dāng)原代細(xì)胞形成的懸浮球狀克隆直徑達(dá)到0.5毫米左右時(shí)，離心去上清，再將其消化后，以1: 5的比例重新接種到新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中，篩選體內(nèi)成瘤能力和體外克隆形成能力的P6C細(xì)胞； 4)將步驟3)獲得的結(jié)腸癌干細(xì)胞再次按與步驟I)、2)和3)相同的方法分離、培養(yǎng)篩選表達(dá)⑶44膜蛋白的腫瘤干細(xì)胞系P6C，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，還包括將Otc3/4啟動(dòng)子連接EGFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于步驟4)獲得的腫瘤干細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞系或權(quán)利要求6或7所述的方法制得的細(xì)胞系在制備用于腫瘤形成或轉(zhuǎn)移腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞系或權(quán)利要求6或7所述的方法制得的細(xì)胞系在制備篩選抗腫瘤發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述 的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用，所述細(xì)胞系為保藏號(hào)為CGMCC No.5558的人結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞系P6C，所述細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟1)分離原代結(jié)腸癌干細(xì)胞；2)原代結(jié)腸癌干細(xì)胞的體外培養(yǎng)3)結(jié)腸癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定；4)將步驟3)獲得的結(jié)腸癌干細(xì)胞再次按與步驟1)、2)和3)相同的方法分離、培養(yǎng)篩選表達(dá)CD44膜蛋白的腫瘤干細(xì)胞系所述細(xì)胞系的應(yīng)用為其在制備用于誘導(dǎo)腫瘤形成的藥物、用于腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物和篩選抗腫瘤發(fā)生、抗腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/10GK103243074SQ20121003312
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月14日
發(fā)明者陳佺, 杜蕾, 王珺, 金海京, 王曉慧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所