煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法和用途。煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物是通過煙臺補血草醇提后，獲得環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水四個有效部位。煙臺補血草有效部位可以抑制多種癌細胞株增殖，特別對白血病HL?60和K562細胞、乳腺癌MCF?7細胞、肺癌A549細胞、宮頸癌Hela細胞、肝癌HepG?2細胞等腫瘤細胞株的抑制作用顯著，以乙酸乙酯部位抗腫瘤活性最明顯，抗癌譜較廣，并且煙臺補血草有效部位具有誘導白血病細胞HL?60分化的作用，因此，可用于制備開發(fā)抗腫瘤藥物，尤其是對于白血病治療研究具有重要的意義。
【專利說明】
煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物及其制備方法和用途
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及天然藥物提取及應用領域，具體是指具有抗腫瘤活性的煙臺補血草提取物及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤發(fā)病率不斷升高，目前已經(jīng)成為人類因疾病死亡的主要原因。其中，肺癌、肝癌和胃癌是主要的實體腫瘤死亡原因，三者約占總惡性腫瘤死亡率的60%，而白血病是危害血液系統(tǒng)的主要惡性疾病。目前針對惡性腫瘤主要的治療手段是放療、化療，但放化療在臨床上副作用大易產(chǎn)生耐藥，使得臨床療效減低。因此，開發(fā)新的低毒、高效、安全的藥物成為治療腫瘤的迫切需要。中國的傳統(tǒng)醫(yī)藥歷史悠久，很多中藥本身具有抗腫瘤活性，并且可以起到調節(jié)免疫功能抑制腫瘤，具有整體治療的效果。從天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤活性的先導化合物，一直是國內外抗癌藥物研究的熱點，并且有效的活性單體和中草藥有效部位的抗癌復方劑都具有重要的臨床應用價值。
[0003]煙臺補血草L i mon i uni f ran ch e t i i COebx.)Kuntze 屬白花丹科(Plumbaginaceae，又稱藍雪科)補血草屬(胤MitwzMiller)，為中國特有種；因其花冠淡紫色(有時上部無色)，萼檐由淡紫紅色漸變?yōu)榘咨址Q為紫花補血草。本種為稀有種，僅分布于遼寧、山東半島至江蘇東北部，被列為國家第二批稀有瀕危植物。全世界補血草屬植物資源約有300種，我國有17種，分布南北各省。該屬植物含黃酮、生物堿、多糖、有機酸、鞣質、揮發(fā)油等成分，具有補血、止血、散瘀、抗菌消炎及抗腫瘤等功效，而最新的研究表明補血草屬植物還具有保肝、抗病毒、抑制α—葡萄糖苷酶等藥理活性。補血草屬植物化學成分的研究是近年來的熱點，主要有中華補血草化學成分的研究、黃花補血草揮發(fā)性化學成分研究、二色補血草化合物含量測定以及化合物提取工藝的研究等。目前，尚無相關煙臺補血草化學成分及其藥理活性的文獻報道，也未見與本發(fā)明中的煙臺補血草提取物制備方法、用途有關的報道。

【發(fā)明內容】

[0004]發(fā)明所要解決的技術問題的目的在于克服上述不足之處，研究設計煙臺補血草提取物及其提取分離方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0005]本發(fā)明的目的之一是，提供一種從煙臺補血草中提取具有抗腫瘤作用的有效部位。
[0006]本發(fā)明的目的之二是，提供一種簡單的制備方法提取得到煙臺補血草中具有抗腫瘤作用的提取物。
[0007]本發(fā)明的目的之三是，提供一種以所說部位為有效成分的藥物組合物。
[0008]本發(fā)明的目的之四是，提供所說有效部位在制備抗腫瘤及相關藥物中的應用。
[0009]本發(fā)明的技術方案如下:
煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物，它是煙臺補血草全草干燥后粉碎，加入95%乙醇浸提三次，合并提取液，減壓濃縮，濾液蒸去乙醇后，加蒸餾水攪拌均勻成懸浮液，水層按照極性由小到大的順序，先后用環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。將環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇及水萃取物分別減壓濃縮回收溶劑后，得到四個部位煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物。
[0010]—種制備上述的煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物的方法，它包括以下步驟:
(I)煙臺補血草為原料，藥材煙臺補血草干燥后粉碎，加入95%乙醇均勻攪拌，靜置24h，重復三次，過濾，合并得到提取液。
[0011](2)步驟(I)的提取液濃縮去除乙醇后，得到總浸膏，加2-5倍體積水攪拌成懸浮液，將水提液與環(huán)己烷體積比1:1進行萃取，萃取三次，合并環(huán)己烷萃取液?；厥窄h(huán)己烷，40°C真空干燥機干燥，得到環(huán)己烷部位。
[0012](3)將環(huán)己烷萃取后的水層與乙酸乙酯體積比1:1進行萃取，萃取三次，合并萃取液?；厥找宜嵋阴ィ?0°C真空干燥機干燥，得到乙酸乙酯部位。
[0013](4)將已經(jīng)過環(huán)己烷和乙酸乙酯萃取過的水層溶液與正丁醇體積比1:1進行萃取，萃取三次，合并萃取液?；厥照〈?，60°C真空干燥機干燥，得到正丁醇部位。
[0014](5)將水提取物采用冷凍干燥的方法濃縮干燥，得到水部位。以上四個極性部位即為煙臺補血草有效組分提取物。
[0015]本發(fā)明進一步提供了煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。以人白血病細胞株HL-60及K562、人肝癌細胞株HepG2、人肺腺癌細胞株A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人子宮頸癌細胞株Hela為檢測瘤株，以抑制腫瘤細胞增殖能力為活性指標進行抗腫瘤活性實驗。實驗結果表明，在體外細胞毒實驗中，四個部位可以抑制腫瘤細胞的增殖，具有細胞毒作用，乙酸乙酯部位表現(xiàn)更好的抗腫瘤活性。并且，環(huán)己烷部位和水部位表現(xiàn)為對人白血病細胞株HL-60很好的誘導分化的活性，可用于制備抗腫瘤治療藥物。
[0016]本發(fā)明還提供了以所述方法制備的有效部位的藥物組合物。所述藥物組合物是以本發(fā)明的有效部位為有效成分，與藥學上可接受的載體所組成，并以適合藥用的制劑形式存在，這些制劑形式可以是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊劑、口服液、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸劑和貼劑等。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。
[0017]有益效果
(I)本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于采用溶劑提取、萃取等常規(guī)方法，首次發(fā)現(xiàn)煙臺補血草環(huán)己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位具有抗腫瘤活性，該有效組分經(jīng)實驗證明具有體外抑制腫瘤細胞生長的活性。
[0018](2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)煙臺補血草的環(huán)己烷部位和水部位具有誘導人白血病細胞HL-60細胞分化的活性，適宜開發(fā)成抗白血病中藥新藥。
[0019](3)本發(fā)明拓展了抗腫瘤藥物的原料渠道，擴大了煙臺補血草的用途，使煙臺補血草發(fā)展成為抗腫瘤藥物的新原料，可顯著提高煙臺補血草的藥用價值。
【附圖說明】
圖1是煙臺補血草提取物抗腫瘤活性實驗IC50值(yg/mL)的示意圖。
圖2是瑞氏染色觀察煙臺補血草提取物對HL-60細胞分化影響的示意圖。
【具體實施方式】
[0020]以下所列實施有助于本領域技術人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0021 ]實施例1:煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物的制備
將煙臺補血草全草干燥粉碎，取混合物1500g，加入8-10倍量的95%乙醇浸泡2-3天，萃取醇溶性成分，重復三次，合并3次提取液，30°04(TC減壓回收乙醇至無醇味，得到總浸膏，加蒸餾水攪拌均勻成懸浮液，裝入分液漏斗中，加等體積的環(huán)己烷萃取三次，合并環(huán)己烷萃取液，減壓回收，40°C真空干燥機干燥至恒重，得到環(huán)己烷部位。剩下的水液減壓除去殘留的環(huán)己烷后，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收，30°C真空干燥機干燥至恒重，得到乙酸乙酯部位。剩下的水層溶液減壓除去殘留的乙酸乙酯后，用等體積的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，減壓回收，60°C真空干燥機干燥至恒重，得到正丁醇部位。最后將水提取物采用冷凍干燥的方法濃縮干燥，得到水部位。
[0022]實施例2:煙臺補血草提取物抗腫瘤活性的研究
以實施例1得到的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物為受試藥物，取處于對數(shù)生長期的多種腫瘤細胞(采用的腫瘤細胞株有如下幾種:人白血病細胞株HL-60及K562、人肝癌細胞株HepG2、人肺腺癌細胞株A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人子宮頸癌細胞株HeIa)，用含10%小牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度，每孔8000個細胞180yL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中過夜，次日加藥。將不同提取部位的樣品溶液配制成初始濃度為lmg/mL的母液，對倍稀釋，每孔加入稀釋好的藥物20yL，以PBS為陰性對照。加樣培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20yL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后快速翻板法棄去孔內液體，每孔加10yL的DMSO，振蕩1min，于酶標儀上570nm波長處檢測各孔的OD值，并使用GraphPad Prism軟件計算各提取部位的IC50值。結果見表I。由結果可知，煙臺補血草提取物四個部位具有良好的腫瘤抑制效果，以乙酸乙酯部位抗腫瘤效果最明顯。
[0023]實施例3:煙臺補血草提取物對急性髓系白血病HL-60細胞誘導分化的影響
以實施例1得到的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物為受試藥物，用終濃度25yg/mL的不同部位提取物處理處于對數(shù)生長期的HL-60細胞，以5X 14個/mL細胞濃度鋪于24孔板，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，收集各組細胞，涂片，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并照相，觀察細胞大小、核漿比、細胞核形狀、胞漿染色等特點。結果表明，煙臺補血草四個部位的提取物處理白血病HL-60細胞5d后，光鏡下觀察細胞形態(tài)學發(fā)生明顯變化(見圖1)。表現(xiàn)為核染色質濃縮，核漿比例降低，核偏于一側，有凹陷和分葉，細胞向成熟階段分化，尤其以環(huán)己烷部位和乙酸乙酯部位最為明顯，說明煙臺補血草提取物對HL-60細胞均有一定的誘導分化的能力。因此，煙臺補血草提取物可以用于制備抗腫瘤的藥物，尤其可以作為誘導分化劑用于白血病的治療。
【主權項】
1.煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物，其特征是:煙臺補血草全草干燥后粉碎，加入95%乙醇提取，濾液蒸去乙醇后得到浸膏，水溶解，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮干燥后得到煙臺補血草環(huán)己烷部位部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位，為煙臺補血草抗腫瘤有效組分提取物。2.根據(jù)權利要求1所述的一種具有抗腫瘤活性的中藥提取物，其特征在于:所述被提取的煙臺補血草為經(jīng)過乙醇浸泡并干燥的全草，包括根、莖、葉和花。3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的煙臺補血草有效組分提取物是煙臺補血草的環(huán)己烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物或水提取物。4.一種制備權利要求3所述的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物的方法，其特征是它包括如下步驟: 步驟1:將煙臺補血草全草粉碎，用95%乙醇浸提三次，合并提取液，減壓濃縮去乙醇，得總浸膏； 步驟2:將步驟I得到的總浸膏，加蒸餾水攪拌均勻成懸浮液，裝入分液漏斗中，水層按照極性由小到大的順序，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇溶液進行萃取。將環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇及水萃取液旋轉蒸發(fā)分別減壓濃縮后，即得煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物。5.權利要求1所述的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。6.根據(jù)權利要求5所述的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是:所述抗腫瘤的腫瘤細胞為白血病HL-60及K562細胞、乳腺癌MCF-7細胞、宮頸癌Hela細胞及肝癌H印G-2細胞，煙臺補血草提取物可以抑制腫瘤細胞體外增殖。7.根據(jù)權利要求5所述的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述的煙臺補血草提取物在體外抑制白血病HL-60及K562細胞增殖，還可以誘導白血病細胞HL-60及K562定向分化。8.根據(jù)權利要求5所述的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是:所述的抗腫瘤藥物是煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物與藥學上可接受的載體或輔料組成。9.根據(jù)權利要求5所述的煙臺補血草抗腫瘤有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于:所述藥物組合物是以本發(fā)明的有效部位為有效成分，與藥學上可接受的載體所組成，并以適合藥用的制劑形式存在，這些制劑形式可以是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊劑、口服液、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸劑和貼劑等。
【文檔編號】A61P35/00GK106038624SQ201610376979
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】姜琳琳, 張興曉, 張建龍, 周菊華, 黃清榮, 解衛(wèi)海, 肖波, 李文君, 陳夢雅
【申請人】魯東大學