專利名稱：光可斷裂的標記核苷酸和核苷與標記的核苷酸和核苷以及其在dna測序中的使用方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及用于DNA測序和其它類型DNA分析的化合物和方法。更具體而言， 本發(fā)明涉及利用光可斷裂基團標記的核苷酸和核苷、利用不可斷裂基團標記的核苷酸和核苷以及其在DNA測序和分析中的使用方法。
背景技術：
快速DNA測序方法已經成為分析種群中疾病和突變以及開發(fā)治療方法的需求。最常觀察到的人序列變異形式是單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其以大約1/300至1/1000個基因組序列堿基對而存在?；谌嘶蚪M全序列，正在努力通過繪制SNP譜或直接關聯(lián)來確認成為常見疾病原因的基因關聯(lián)。基于快速、高通量和低成本的DNA測序技術的開發(fā)將促進對遺傳信息(例如SNP)在應用醫(yī)學中的理解和應用。一般而言，10% -15%的SNP將通過改變特定氨基酸殘基來影響蛋白質功能、通過改變剪切機制來影響對基因的適當加工、或者通過改變調節(jié)機制來影響基因或蛋白質的正常表達水平。設想信息性SNP的鑒定將導致對遺傳病的更準確診斷、對風險易感性的更好預測、或對組織中偶發(fā)性突變的識別。個體SNP特性的一個應用將是利用預防性藥物治療來顯著延遲疾病的發(fā)生或進展。此外，藥物代謝基因的SNP特性可用于制定具體的給藥方案以提供更安全和更有效的結果。為實現(xiàn)這些宏大的目標，基因組測序將進入具有對大多數(shù)種群進行部分測序可能性的重測序(resequencing)階段，其將涉及對特定區(qū)域或分布在整個人類基因組中的單堿基對進行平行測序以獲得特定復雜疾病的SNP特性。成為大多數(shù)常見疾病原因的序列變異很可能與分散在全部相關基因中并以低頻率存在的多個SNP有關。因此，與僅靶向已知SNP的技術相比，利用從頭測序策略的DNA測序技術更可能檢測和/或發(fā)現(xiàn)這些少見的、廣泛分布的變異體。傳統(tǒng)上，通過“Sanger”法或“雙脫氧”法實現(xiàn)DNA測序，其包括通過利用DNA聚合酶引入2，，3，-雙脫氧核苷酸(ddNTP)的DNA合成的鏈終止(Sanger, F.，Nicklen, S.，and Coulson, A. R. (1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) 所述反應還包括天然2，-脫氧核苷酸(dNTP)，其通過DNA 合成擴增DNA鏈。鏈擴增與鏈終止之間的大體平衡的競爭導致形成一系列套式DNA(nested DNA)片段，其均勻地分布在數(shù)以千計的堿基中并且在堿基對增長尺寸方面不同。利用電泳根據套式DNA片段的各自尺寸對其進行拆分。測序反應中的dNTP/ddNTP比決定鏈終止的頻率，并因此決定終止鏈的長度分布。然后，當利用合適的激光源照射時，通過之前的4種不同熒光團與4種DNA堿基(即A、C、G和T)的結合發(fā)出其各自顏色的熒光來檢測所述片段。目前，Srnger 測序通過直接 PCR 測序(Gibbs，R. Α·，Nguyen，P. -N.，McBride，LJ.， Koepf, S. M.，and Caskey, C. Τ. (1989) Identification of mutations leading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated direct DNA sequencing of in vitro amplified cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1919-1923)或基因組測序(Hunkapiller，Τ.，Kaiser, R. J.，Koop，B. F.，and Hood, L. (1991) Large-scale and automated DNA sequencing Determination.Science 254，59—67 ；International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. (2001)Nature 409,860-921)已經成為用于發(fā)現(xiàn)SNP的最廣泛應用的方法。另一種具有前景的測序方法是周期可逆終止(CRT)，其為一種測多模板的同步單個堿基加成的周期性方法。該方法本身與Sanger法(Metzker，M.L. (2005)Genome Rex 15， 1767-1776)的不同之處在于其可不需要凝膠電泳(其為推進該領域的主要瓶頸)而進行。 然而，與Sanger測序相似，讀取長度較長意味著需要較少次測序試驗來覆蓋整個基因組。仍然難于實現(xiàn)長CRT讀取的目標，因為利用可商購的DNA聚合酶，可逆的終止子通常起到弱底物的作用。利用3’-0_阻滯基團和通過連接基團與熒光染料結合的核堿基構成可逆的終止子。在隨后的堿基加成之前，阻滯基團和染色基團均需要除去。這些核苷酸修飾不能良好地耐受DNA聚合酶，這可通過多種策略進行突變來提高酶性能。脫保護時，將核堿基連接物置于一邊，隨著其后的CRT循環(huán)，在生長中的DNA雙螺旋中進行依次累積。據信弱的酶動力學和隨后修飾的DNA雙螺旋限制了較長的讀取長度。本發(fā)明部分地描述了需要終止部分和熒光染色部分的單一結合來提高酶動力學和脫保護效率的新的可逆核苷酸結構。 這些可逆終止子通過多種可商購的DNA聚合酶而被有效地引入，所述生長中的DNA雙螺旋通過脫保護步驟轉變?yōu)槠涮烊粻顟B(tài)。CRT技術的DNA測序讀取長度由每個核苷酸加成循環(huán)的總效率所決定。例如，如果認為50%原始材料的終點具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于評價循環(huán)效率對讀取長度的作用(RL廣eff = 0.5，其中RL是堿基的讀取長度，CefT是總循環(huán)效率。換句話說，可以通過90%的總循環(huán)效率實現(xiàn)7個堿基的讀取長度，通過99%的循環(huán)效率實現(xiàn)70個堿基的讀取長度，可通過99. 9%循環(huán)效率實現(xiàn)700個堿基的讀取長度。為實現(xiàn)對大長度測序的目標，所述方法必須提供非常高的循環(huán)效率或者所述恢復可降至可接受的信噪比以下。表現(xiàn)出較高引入效率和脫保護效率的可逆終止子將實現(xiàn)較高的循環(huán)效率，因而實現(xiàn)較大的讀取長度。為使CRT終止子適當?shù)仄鹱饔?，必須在溫和條件下有效地斷裂掉所述保護基。保護基的除去通常涉及利用強酸或強堿、催化或化學還原的處理，或者這些方法的組合。這些條件對于所述DNA聚合酶、核苷酸、寡核苷酸引物模板、或固體載體而言可能是反應活性的，產生不希望的結果。使用光化學保護基是一種有吸引力的替代強烈化學處理的方法，并且可以非侵入方式進行使用。已有多種光可除去的保護基(例如2-硝基芐基、芐氧基羰基、3-硝基苯基、苯甲酰甲基、3，5-二甲氧基苯偶姻基(3，5-dimeth0Xybenz0inyl)、2，4-二硝基苯硫基及其各自的衍生物)被用于合成肽、多糖和核苷酸(Pillai，V. N. R. (1980)Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis. Synthesis, 1-26)。在這些保護基中，光敏感的2-硝基芐基保護基已成功用于以下的基團用于二核糖核苷合成的核糖核苷的2' -0H(0htsuka, Ε.，Tanaka, S.禾口 Ikehara，Μ· (1974)Studies on transfer ribonucleic acids and related compounds. IX(I)Ribooligonucleotide synthesis using a photosensitive o-nitrobenzyl protection at the2 ' -hydroxy1 group. Nucleic Acids Res. 1,1351-1357),自動化核酶合成中的核苷亞磷酰胺(ribophosphoramidite) 的 2，-0H(Chaulk，S. G.禾口 MacMi1lan，A. M. (1998)Caged RNA :photo-control of a ribozyme. Nucleic Acids Res. 26,3173-3178)、Affymetrix 化學中用于寡核苷酸合成的亞磷酰胺的 3，-OH(Pease, Α. C, Solas, D.，Sullivan, Ε. J.，Cronin, Μ. Τ.，Holmes, C. P.禾口 Fodor, S. P. Α. (1994)Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91，5022-5026)以及用于 DNA 測 jS M 的 3’ -OH(Metzker, Μ. L. ， Raghavacharl, R. ， Richards, S. ， Jacutin, S. Ε.， Civitello, Α. , Burgess, K.禾口 Gibbs, R. Α. (1994)Termination of DNA synthesis by novel 3 ' -modified deoxyribonucleoside triphosphates. Nucleic Acids Res. 22, 4259-M67)。在脫保護條件(紫外線> 300nm)下，可以在不影響嘧啶或嘌呤堿基的情形下有效地斷裂 2-硝基芐基(Pease，Α. C，Solas, D.，Sullivan, Ε. J.，Cronin, Μ. Τ.，Holmes，
C.P.禾口Fodor，S.P. Α. (1994)Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,5022-5026) VXR (Bartholomew,
D.G.禾口Broom，A.D. (1975)One-step Chemical Synthesis of Ribonucleosides bearing a Photolabile Ether Protecting Group. J. Chem. Soc. Chem. Commun.，38)0在當今跨越不同研究部門(包括比較基因組學和進化學、法醫(yī)學、流行病學、以及用于診斷和治療的應用醫(yī)學)的應用下，對于開發(fā)新的測序技術的需求從來沒有這樣強烈過。對于在人序列變異研究中的廣泛應用而言，目前的測序技術太昂貴、費力且耗時。基因組中心的成本是基于每1，000個( 2(ι堿基的美元數(shù)來計算的，并且通?？煞殖蓛x器、人員、 試劑、材料以及管理花費等類別。目前，這些中心以不到1美元/1，000個Q2tl堿基進行運作，其中至少50%的成本單獨由DNA測序儀器產生。對于新的檢測方法、儀器小型化、微流體分離技術的開發(fā)以及每次運行的試驗數(shù)的增加將最有可能對降低成本產生最大的影響。因此，本發(fā)明的一個目的是提供可用于在高通量測序反應中對基因組信息進行有效測序的新化合物。本發(fā)明的另一個目的是提供新的試劑和試劑組合，所述新的試劑和試劑組合可以有效并可買得起的方式提供基因組信息。本發(fā)明的又一個目的是提供用于診斷方法和用于開發(fā)針對個體的靶向治療劑的試劑的文庫和陣列。

發(fā)明內容
光可斷裂的標記核苷酸和核苷本發(fā)明提供了可用在DNA測序技術中的核苷化合物及其磷酸酯和鹽。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標記的光可斷裂基團。所述包含光可斷裂保護基的核苷酸和核苷化合物被設計成終止DNA合成然后有效斷裂，使得可以平行模式對所述核酸寡聚體進行快速測序。所述核苷酸和核苷化合物上這種利用熒光染料標記的可斷裂基團的存在可提高對大的DNA寡聚體進行平行測序的速度和準確度，以使得可進行例如對整個基因組的快速測序以及對多態(tài)性和其它有價值遺傳信息的鑒定。提供了含有核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其包含可斷裂基團和/或可被衍生化而包含可檢測的標記物(例如染料)。在一個實施方案中，所述核苷的堿基與2-硝基芐基共價連接，所述2-硝基芐基的 α碳位置任選地被本文中所述的一個烷基或芳基取代。所述2-硝基芐基可被官能化以提高終止性能和光催化的脫保護速率。即使在核糖上的3’ -OH基未被封閉時，與所述核堿基相連的2-硝基芐基或α碳被取代的2-硝基芐基的終止性能仍然存在。這些3’ -OH基未封閉的終止子可良好耐受多種可商購的DNA聚合酶，這代表了優(yōu)于3’-0封閉的終止子的一個關鍵優(yōu)點。所述α碳被取代的2-硝基芐基還可被衍生化而包含所選的熒光染料。
在一個實施方案中，所述核苷的堿基與2-硝基芐基共價連接，所述2-硝基芐基任選地被本文中所述的供電子和吸電子基團中的一種或多種所取代。所述2-硝基芐基可被官能化以提高光催化脫保護的速度。所述2-硝基芐基還可被衍生化而包含可檢測的熒光染料。具體而言，通過利用2-硝基芐基修飾的四種核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同熒光染料標記的衍生物的組合，提供了用于DNA測序的方法，其可用于鑒別所引入的堿基以揭示作為其基礎的DNA序列。標記的核苷酸和核苷還提供了可用在DNA測序技術中的核苷化合物及其磷酸酯和鹽。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標記的不可斷裂基團。所述核苷酸和核苷化合物被設計成終止DNA合成，使得可以平行模式對核酸寡聚體進行快速測序。提供了含有核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其可被衍生化而包含可檢測的標記物(例如染料)。在一個實施方案中，所述核苷的堿基與芐基共價連接，所述芐基的α碳位置任選地被本文中所述的一種烷基或芳基所取代。所述芐基可被官能化以提高終止性能。即使在核糖上的3’_0Η基未被封閉時，與核堿基相連接的任選地α碳被取代的芐基的終止性能仍然存在。這些3’ -OH基未封閉的終止子可良好耐受多種可商購的DNA聚合酶，這代表了優(yōu)于3’ 0封閉的終止子的一個關鍵優(yōu)點。所述連接基團還可被衍生化而包含所選的熒光染料。具體而言，通過利用不可斷裂的終止基團修飾的四種核苷三磷酸化合物和本文所述的利用不同熒光染料標記的衍生物的組合，提供了用于DNA測序的方法，其可用于鑒別所引入的堿基以揭示作為其基礎的DNA序列。
具體實施例方式光可斷裂標記的核苷酸和核苷本發(fā)明提供了可用在快速DNA測序技術中的核苷酸和核苷化合物及其鹽、酯和磷酸酯。所述化合物任選地是核糖核苷三磷酸(NTP)和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)化合物的形式。在一個實施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標記的光可斷裂基團。所述核苷酸和核苷化合物包含被設計成終止DNA合成以及快速斷裂的光可移除保護基，使得這些單體可用于以平行模式快速測序。所述核苷酸和核苷化合物上這種利用熒光染料標記的可快速斷裂基團的存在可提高大的DNA寡聚體的平行測序的速度和準確度，以使得可以例如對整個基因組進行快速測序以及鑒定多態(tài)性和其它有價值的遺傳信息。提供了包含核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物的多種核苷酸和核苷化合物，其包含可斷裂基團和/或可被衍生化而包含可檢測的標記物(例如染料)。在一個實施方案中，所述核堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其天然存在的衍生物可與光可除去的保護基如2-硝基芐基共價連接。所述2-硝基芐基可被衍生化以提高其對DNA合成的終止以及脫保護速度，因此增強了其在DNA測序中的用途。還可利用熒光染料通過與光可除去的保護基共價連接而對所述光可除去的保護基(例如2-硝基芐基)進行衍生化。I.光可斷裂的標記核苷酸和核苷化合物用于測序的優(yōu)點提供了可用于DNA測序技術的核苷酸和核苷化合物。循環(huán)可逆終止(CRT)是一種檢測多個模板的同步、單個堿基加成的周期性方法。該方法本身與Sanger法的不同之處在于其可以在不需要凝膠電泳和高度平行的模式下(其為推進該領域的主要瓶頸)進行，。 然而，與Sanger測序相似，較長讀取長度意味著需要較少次測序試驗來需要覆蓋整個基因組。所述CRT循環(huán)包括三個步驟引入、成像和脫保護。對于該過程而言，循環(huán)效率、循環(huán)時間和靈敏度是重要的因素。循環(huán)效率是脫保護和引入效率的結果，并且決定了 CRT讀取長度。CRT循環(huán)時間是引入、成像和脫保護時間的總和。對于針對整個基因組測序的快速CRT 而言，可使用本文所公開的可表現(xiàn)出快速和有效的脫保護性能的核苷酸和核苷化合物。這些化合物可利用熒光染料進行標記，直接與2-硝基芐基相連，從而提供具有相似脫保護性能的熒光可逆終止子。CRT技術的讀取長度由每個核苷酸加成循環(huán)、脫保護和引入效率的結果的總效率決定。例如，如果認為50%原始材料的終點具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于評價循環(huán)效率對讀取長度的作用(RL)Ceff = 0. 5其中RL是堿基的讀取長度，Ceff是總循環(huán)效率。換句話說，可以通過90%的總循環(huán)效率實現(xiàn)7個堿基的讀取長度，可通過99%的循環(huán)效率實現(xiàn)70個堿基的讀取長度，可通過99. 9%循環(huán)效率實現(xiàn)700個堿基的讀取長度。本發(fā)明化合物的引入效率可以為引入類似的天然核苷的約70%至約100%。優(yōu)選地，所述引入效率為約85%至約100%。光可斷裂的效率優(yōu)選為約85%至約100%。此外，當引入本發(fā)明化合物時，核酸延伸的終止為約90% 至約100%。在一個實施方案中，核苷酸和核苷化合物的循環(huán)效率為至少80% ,90^^91%、 92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4 %,99. 5 %, 99. 6%、99. 7%、99. 8%或99. 9%。當用于基因組DNA時，可將所述化合物用在CRT中以直接由基因組DNA進行讀取。片段基因組DNA可與含有橫跨所選染色體的引發(fā)位點的高密度寡核苷酸芯片進行雜交。通過CRT法的所評估的讀取長度來分離每個引發(fā)序列。在兩次堿基加成之間，熒光成像儀可同時對整個高密度芯片成像，評價在速度和靈敏度方面的提高。 通過紫外照射除去本文所述的與所述2-硝基芐基相連的熒光團或其衍生物，釋放出2-硝基芐基用于下一輪的堿基加成。然后在大約500個CRT循環(huán)后，可將所述完全的且不間斷
21的基因組序列信息與參比人基因組相比較，以確認單個樣品中序列變異的程度和類型。II.光可斷裂的標記核苷酸和核苷化合物本發(fā)明提供了多種核苷以及其單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯化合物。所述化合物可用于DNA測序技術。在一個實施方案中，所述核苷酸和核苷化合物包含利用熒光染料標記的光可斷裂的終止基團，所述熒光染料可在CRT反應中被檢測到并有效斷裂。所述核苷酸和核苷化合物可轉化成其各自的天然核苷單磷酸酯用于隨后的DNA聚合酶反應。在一個具體實施方案中，提供了含有脫氧核糖或核糖和堿基的核苷酸和核苷化合物，其中所述堿基與光可斷裂的終止基團2-硝基芐基共價連接。所述2-硝基芐基可被提高DNA合成終止和脫保護速度的基團所取代。此外，所述2-硝基芐基可通過與報告物基團(例如染料) 相連而可被檢測。所述染料可任選地通過雙官能團連接物與2-硝基芐基相連。本發(fā)明的化合物可通過下式表示
權利要求
1.下式的化合物
2.權利要求1的化合物，其中所述終止部分是光可斷裂的。
3.權利要求1的化合物，其中所述終止部分是光不可斷裂的。
4.權利要求1的化合物，其進一步限定為選自下列的化合物式I 式II
5.權利要求4的化合物，其中&是NO2,R3和R4至少之一是H。
6.權利要求4的化合物，其中&不是NO2。
7.權利要求5或6的化合物，其中R5、R6和R7之一是下述結構的基團
8.權利要求5或6的化合物，其中R3和R4獨立地選自H、-CH3>_CH2CH3、_CH2CH2CH3、異丙基、叔丁基、苯基、2-硝基苯基和2，6-二硝基苯基。
9.權利要求8的化合物，其中R3或R4是-CH3、異丙基或叔丁基。
10.權利要求5或6的化合物，其中民和R4獨立地選自H、烷基和芳香基，所述烷基或芳香性基團中任選地含有至少一個雜原子，并且其中所述芳香性基團可任選地是芳基或者是多環(huán)基團。
11.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(I)的化合物。
12.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(II)的化合物。
13.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(III)的化合物。
14.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(IV)的化合物。
15.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(V)的化合物。
16.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(VI)的化合物。
17.權利要求5或6的化合物，其進一步限定為式(VII)的化合物。
18.權利要求4的化合物，其進一步限定為
19.權利要求4的化合物，其進一步限定為
20.權利要求4的化合物，其進一步限定為
21.權利要求4的化合物，其進一步限定為
22.權利要求4的化合物，其進一步限定為
23.權利要求4的化合物，其進一步限定為
24.權利要求4的化合物，其進一步限定為
25.權利要求4的化合物，其進一步限定為
26.權利要求4的化合物，其進一步限定為
27.權利要求4的化合物，其進一步限定為
28.權利要求4的化合物，其進一步限定為
29.權利要求4的化合物，其進一步限定為
30.權利要求4的化合物，其進一步限定為
31.權利要求4的化合物，其進一步限定為
32.權利要求4的化合物，其進一步限定為
33.權利要求4的化合物，其進一步限定為
34.權利要求4的化合物，其進一步限定為
35. 一種靶核酸的測序方法，所述方法包括下述步驟 (i)將引物5’端連接到固體表面上；( )將靶核酸與所述連接到固體表面上的引物進行雜交，形成雜交的引物/靶核酸復合物；(iii)獲得聚合酶和一種或多種權利要求5的化合物，前提是不同的式I-VII的化合物具有不同的熒光團；(iv)將所述雜交的引物/靶核酸復合物與聚合酶以及一種或多種步驟(iii)的化合物反應，以通過聚合酶反應形成生長中的引物鏈；(ν)通過熒光團對生長中的引物鏈成像以鑒定步驟(iv)引入的化合物；(vi)將具有所述生長中引物鏈的固體表面暴露于光源以除去下式的光可斷裂的終止
36. 一種靶核酸的測序方法，所述方法包括下述步驟 (i)將核酸5’端連接到固體表面上；(ii)將引物與所述連接到固體表面上的核酸進行雜交，形成雜交的引物/靶核酸復合物；(iii)獲得聚合酶和一種或多種權利要求5的化合物，前提是不同的式I-VII的化合物具有不同的熒光團；(iv)將所述雜交的引物/靶核酸復合物與聚合酶以及一種或多種步驟(iii)的化合物反應，以通過聚合酶反應形成生長中的引物鏈；(ν)通過熒光團對生長中的引物鏈成像以鑒定步驟(iv)引入的化合物； (vi)將具有所述生長中引物鏈的固體表面暴露于光源以除去下式的光可斷裂的終止部分
37.權利要求35和36中任一項的方法，其中步驟(iv)的至少一種化合物的引入效率為其天然核苷酸對應物的引入效率的約70%至約100%。
38.權利要求37的方法，其中所述引入效率為約85%至約100%。
39.權利要求35和36中任一項的方法，其中所述聚合酶選自逆轉錄酶、末端轉移酶和 DNA聚合酶。
40.權利要求35和36中任一項的方法，其中在步驟(vi)中通過暴露于光源除去約 85%至約100%的光可斷裂的終止部分。
41.權利要求35和36中任一項的方法，其中在根據步驟(iv)引入至少一種化合物之后以約90%至約100%的效率終止鏈的生長。
42.權利要求35和36中任一項的方法，其中使用脈沖多線激發(fā)檢測器進行步驟(ν)中的成像。
43.權利要求35和36中任一項的方法，其還包括步驟(vi)前清洗生長中的引物鏈。
44.權利要求35和36中任一項的方法，其還包括步驟(iv)后清洗延伸的引物。
45.權利要求35和36中任一項的方法，其還包括在步驟(iv)前對步驟(iv)中未反應的任何弓丨物或生長中的引物鏈加帽。
46.權利要求35和36中任一項的方法，其還包括同步地對多個靶核酸測序。
47.一種將核酸分子中的非天然成分轉化成天然成分的方法，所述方法包括以下步驟(i)引入權利要求5的化合物；( )將所得核酸暴露于光源以除去所述核酸中光可斷裂的終止部分
48.權利要求47的方法，其還包括將多個核酸分子中的非天然成分同步地轉化為天然成分。
49.權利要求48的方法，其還包括同步地終止多個核酸的合成。
50.一種終止核酸合成的方法，所述方法包括將權利要求1至34中任一項的3’-0H未封閉的核苷酸或核苷置于聚合酶的環(huán)境中以及將所述3’ -OH未封閉的核苷酸或核苷引入到核酸分子中的步驟。
51.權利要求50的方法，其中通過引入所述3’-0H未封閉的核苷酸或核苷終止DNA合成的效率為約90%至約100%。
52.權利要求50的方法，其中所述3’-0H未封閉的核苷酸或核苷的引入效率為具有與所述3’ -OH未封閉的核苷酸或核苷相同的堿基的天然核苷酸或核苷的引入效率的約70% 至約100%。
53.一種進行Sanger或Sanger型測序的方法，所述方法包括使用權利要求1至34中任一項的化合物作為終止核苷酸類似物。
54.一種測定靶核酸序列的方法，所述方法包括下述步驟 (i)將靶核酸加入到Sanger或Sanger型測序裝置；( )向所述測序裝置中加入一種或多種權利要求1至34中任一項的化合物，前提是其中如果存在超過一種類型的堿基，則每種堿基與不同熒光團相連接；(iii)加入互補引物和聚合酶；(iv)進行聚合酶反應以將步驟(ii)的至少一種化合物引入到生長中的核酸鏈中，以及(ν)用熒光測序設備或脈沖多線激發(fā)熒光分析Sanger測序反應的結果， 其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進行。
55.權利要求M的方法，其中在根據步驟(iv)引入至少一種化合物后以約90%至約 100%的效率終止核酸鏈的生長。
56.權利要求M的方法，其中步驟(iv)的至少一種化合物的引入效率為聚合酶反應中具有相同堿基的天然底物的引入效率的約70%至約100%。
57.權利要求56的方法，其中所述引入效率為約85%至約100%。
58.權利要求討的方法，其中所述聚合酶選自逆轉錄酶、末端轉移酶和DNA聚合酶。
59.一種將非天然成分引入到核酸中的方法，所述方法包括以下步驟 (i)將靶核酸加入到測序裝置中；( )將一種或多種權利要求1至34中任一項的化合物加入到所述測序裝置中，前提是其中如果存在超過一種類型的堿基，則每種堿基與不同熒光團相連接； (iii)加入聚合酶；以及(iv)進行聚合酶反應以將步驟(ii)的至少一種化合物引入到生長中的核酸鏈中， 其中步驟(i)-(iii)可以任意順序進行。
60.權利要求59的方法，其還包括(ν)分析用于引入步驟(ii)的至少一種化合物的聚合酶鏈式反應的結果。
61.權利要求59的方法，其中在根據步驟(iv)引入至少一種化合物后以約90%至約 100%的效率終止鏈的生長。
62.權利要求59的方法，其中根據步驟(iv)引入至少一種化合物的效率為聚合酶反應中具有相同堿基的天然底物的引入效率的約70%至約100%。
63.一種進行微測序或微測序型測序的方法，所述方法包括將權利要求1至34中任一項的化合物加入到微測序或微測序型測序方法中。
全文摘要
本發(fā)明提供了可用在DNA測序技術和其它類型的DNA分析中的本文所述的新的核苷酸、核苷及其衍生物。在一個實施方案中，具有未保護的3’-OH的核苷酸或核苷在核堿基上被衍生成包括通過連接物與不可斷裂的終止基團連接的熒光染料。所述不可斷裂的熒光基團被設計成終止DNA合成，使得可以平行模式對DNA寡聚體進行有效測序。在另一個實施方案中，具有未保護的3’-OH的核苷酸或核苷在核堿基上被衍生成包括通過連接物與光可斷裂的終止基團連接的熒光染料。所述光可斷裂的熒光基團被設計成終止DNA合成以及被斷裂，使得可以平行模式對DNA寡聚體進行有效測序。
文檔編號C12Q1/68GK102443030SQ20111037672
公開日2012年5月9日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權日2006年12月5日
發(fā)明者吳衛(wèi)東, 布賴恩·P·斯圖皮, 弗拉迪斯拉夫·A·利托什, 邁克爾·L·梅茨克 申請人:激光基因公司