本發(fā)明涉及用于檢測(cè)靶基因的核苷酸多態(tài)性的修飾的PNA探針、使用包含報(bào)告物(reporter)和與其偶聯(lián)的淬滅物(quencher)的PNA探針的熔解曲線分析方法，使用所述PNA探針?lè)治霭谢虻暮塑账岫鄳B(tài)性的方法，和包含PNA探針的用于檢測(cè)靶基因的核苷酸多態(tài)性的試劑盒，且更具體地，涉及使用PNA探針的熔解曲線分析方法，通過(guò)熔解曲線分析的核苷酸多態(tài)性分析方法，和核苷酸多態(tài)性分析試劑盒，其中所述PNA探針含有負(fù)電荷分子。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由DNA核苷酸中一個(gè)核苷酸的取代引起的基因變異，其為每個(gè)人帶來(lái)在疾病原因、對(duì)治療劑的反應(yīng)等方面的個(gè)體差異。注意力已聚焦于SNP的檢測(cè)和確認(rèn)上，因?yàn)樗鼈兣c新藥開發(fā)以及個(gè)體化用藥相關(guān)聯(lián)。

為了迅速檢測(cè)SNP，已使用了多種檢測(cè)方法，其中應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。作為多種檢測(cè)方法的代表性實(shí)例，存在使用DNA嵌入式熒光材料的分析方法、使用DNA探針的方法、使用PNA探針的方法等。

使用DNA嵌入式熒光材料的單核苷酸多態(tài)性分析方法可通過(guò)DNA嵌入式熒光材料的飽和濃度來(lái)區(qū)分PCR擴(kuò)增子的核苷酸中的變化而無(wú)需對(duì)實(shí)施PCR反應(yīng)后獲得的產(chǎn)物進(jìn)行額外操作。然而，該方法在使用DNA嵌入式熒光材料中具有局限，且具有的劣勢(shì)在于僅一個(gè)單核苷酸能夠被分析且應(yīng)使用用于分析熔解曲線的程序[Kirk M.Ririe等,ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 245:154160,1997；U.Hladnik等,Clin Exp Med 2:105108,2002]。

作為用于熔解曲線分析的DNA探針，存在MGB Taqman探針、Molecular Beacon(分子信標(biāo))(MB)探針和二元探針。上述方法具有的優(yōu)勢(shì)在于顯示了優(yōu)異的SNP區(qū)分能力，但具有的劣勢(shì)在于因?yàn)镈NA探針的最小長(zhǎng)度長(zhǎng)約20～40聚物因此難以通過(guò)一個(gè)反應(yīng)檢測(cè)鄰近的SNP[Hidefumi Sasaki等,Clin Cancer Res 11:2924-2929,2005；Manna Zhang等,HEPATOLOGY 36:3,2002]。

使用特征在于含有負(fù)電荷分子的PNA探針的熔解曲線分析方法具有的優(yōu)勢(shì)在于，相比已有PNA探針，PNA探針能夠迅速而強(qiáng)烈地與靶DNA偶聯(lián)，且由于強(qiáng)偶聯(lián)能力，能夠使用具有長(zhǎng)度較短的探針，使得鄰近的單核苷酸多態(tài)性能夠被檢測(cè)。

相關(guān)領(lǐng)域的文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

(非專利文獻(xiàn)1)Chen,C.Y.等,Clin.Chem 50:481-489,2004

(非專利文獻(xiàn)2)M Beau-Faller等,British Journal of Cancer 100:985-992,2009

概述

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠檢測(cè)靶基因的核苷酸多態(tài)性的PNA探針。具體地，其特征在于PNA探針含有負(fù)電荷分子。

本發(fā)明的另一目的是提供使用PNA探針用于檢測(cè)靶基因的核苷酸多態(tài)性的熔解曲線分析方法和包括所述PNA探針的核苷酸多態(tài)性分析方法。

本發(fā)明的另一目的是提供含有所述PNA探針的用于檢測(cè)靶基因的核苷酸多態(tài)性的試劑盒。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示與靶DNA偶聯(lián)的PNA探針的示意圖和熔解曲線圖；

(a)使用與具有負(fù)電荷的氨基酸側(cè)鏈偶聯(lián)的PNA探針的情況。

(b)使用未修飾的PNA探針的情況。

圖2顯示通過(guò)將PNA探針與具有單核苷酸多態(tài)性的雜合樣品偶聯(lián)而獲得的熔解曲線圖；

(a)使用含有未修飾的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和11的DNA寡聚物的樣品的情況。

(b)使用含有與γ-谷氨酸偶聯(lián)的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和11的DNA寡聚物的樣品的情況。

(c)使用含有未修飾的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO: 10和12的DNA寡聚物的樣品的情況。

(d)使用含有與γ-谷氨酸偶聯(lián)的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和12的DNA寡聚物的樣品的情況。

(e)使用含有未修飾的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和13的DNA寡聚物的樣品的情況。

(f)使用含有與γ-谷氨酸偶聯(lián)的PNA探針和以1:1比例混合的表2中的SEQ ID NO:10和13的DNA寡聚物的樣品的情況。

圖3顯示通過(guò)將PNA探針與具有單核苷酸多態(tài)性的雜合樣品偶聯(lián)獲得的熔解曲線圖；

(a)未與γ-谷氨酸偶聯(lián)的PNA探針的情況。

(b)與兩個(gè)γ-谷氨酸偶聯(lián)其間具有兩個(gè)核苷酸的PNA探針的情況。

(c)與兩個(gè)γ-谷氨酸連續(xù)偶聯(lián)而其間無(wú)兩個(gè)核苷酸的PNA探針的情況。

(d)與兩個(gè)γ-谷氨酸偶聯(lián)其間具有一個(gè)核苷酸的PNA探針的情況。

圖4顯示使用與γ-谷氨酸偶聯(lián)的三個(gè)PNA探針的多重檢測(cè)，黑線指示通過(guò)SEQ ID NO:2的PNA探針的熔解曲線，藍(lán)線指示通過(guò)SEQ ID NO:7的PNA探針的熔解曲線，且紅線指示通過(guò)SEQ ID NO:8的PNA探針的熔解曲線。

(a)使用由三個(gè)PNA探針和與每個(gè)探針互補(bǔ)結(jié)合的靶DNA寡聚物組成的純合樣品的實(shí)驗(yàn)情況，其中所述三個(gè)PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

(b)使用由三個(gè)PNA探針和由于單核苷酸多態(tài)性所致的與每個(gè)探針錯(cuò)配的靶DNA寡聚物組成的純合樣品的實(shí)驗(yàn)情況，其中所述三個(gè)PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

(c)使用含有三個(gè)PNA探針和彼此以1:1的比例混合的上述(a)和(b)中使用的靶DNA寡聚物的雜合樣品的實(shí)驗(yàn)情況，其中所述三個(gè)PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

圖5顯示多重檢測(cè)，該情況中包含與其偶聯(lián)γ-谷氨酸的三個(gè)PNA探針與單核苷酸多態(tài)性相鄰；且黑線指示SEQ ID NO:2的PNA探針的熔解曲線，藍(lán)線指示SEQ ID NO:7的PNA探針的熔解曲線，且紅線指示SEQ ID NO:8的PNA探針的熔解曲線。

(a)使用三個(gè)PNA探針和表2中SEQ ID NO:19的DNA寡聚物的情況，其中所述三個(gè)PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

(b)使用三個(gè)PNA探針和表2中SEQ ID NO:20的DNA寡聚物的情況，其中所述三個(gè)PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

(c)使用三個(gè)PNA探針和彼此以1:1的比例混合的表2中SEQ ID NO:19和20的DNA寡聚物的情況，其中所述三個(gè)PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

圖6顯示通過(guò)將PNA探針與具有單核苷酸多態(tài)性的多個(gè)雜合樣品偶聯(lián)而獲得的熔解曲線圖；

(a)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:21和22的DNA寡聚物的樣品的情況。

(b)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:25和26的DNA寡聚物的樣品的情況。

(c)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:21和23的DNA寡聚物的樣品的情況。

(d)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:25和27的DNA寡聚物的樣品的情況。

(e)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:21和24的DNA寡聚物的樣品的情況。

(f)使用含有表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和彼此以1:1的比率混合的表2中的SEQ ID NO:25和28的DNA寡聚物的樣品的情況。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供用于檢測(cè)靶基因的核苷酸多態(tài)性的PNA探針，其包含報(bào)告物和與其偶聯(lián)的淬滅物。

其特征在于PNA探針包含負(fù)電荷分子，其中所述負(fù)電荷分子可為選自由所有的酸組成的組的至少一種，所有的酸包括氨基酸、氨基酸側(cè)鏈、磷酸、羧酸、磺酸、硝酸和硼酸。

此外，負(fù)電荷分子可與PNA探針的N末端、C末端，或PNA骨架的α、β和γ位置偶聯(lián)，且至少一種負(fù)電荷分子可與探針的堿基連續(xù)或間歇偶聯(lián)。

本發(fā)明提供使用PNA探針的熔解曲線分析方法，所述PNA探針包含報(bào)告物和與其偶聯(lián)的淬滅物。

其特征在于所述熔解曲線分析方法中使用的PNA探針含有負(fù)電荷分子，且由于使用含有負(fù)電荷分子的PNA探針，熔解曲線的解析/分辨率(resolution)增加，從而易于分析雜合樣品。

根據(jù)本發(fā)明含有負(fù)電荷分子的PNA探針可含有選自由所有的酸組成的組的至少一種負(fù)電荷分子，所有的酸包括氨基酸、氨基酸側(cè)鏈、磷酸、羧酸、磺酸、硝酸和硼酸。負(fù)電荷分子可與PNA探針的N末端、C末端，或PNA骨架的α、β和γ位置偶聯(lián)，且至少一種負(fù)電荷分子可與探針的堿基連續(xù)或間歇偶聯(lián)。

此外，PNA探針可含有熒光材料。熒光材料可以是報(bào)告物、淬滅物或嵌入式熒光材料。

本發(fā)明提供使用含有負(fù)電荷分子的PNA探針的靶基因的核苷酸多態(tài)性分析方法。

可通過(guò)分析熔解曲線使用靶基因的核苷酸多態(tài)性分析方法。

由于PNA具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性，及與DNA相比對(duì)靶DNA的高識(shí)別能力和與靶DNA的高偶聯(lián)能力，PNA可用作實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的探針用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。然而，由于實(shí)時(shí)PCR方法使用熒光材料檢測(cè)樣品中的靶DNA，為了檢測(cè)在一個(gè)位置的SNP，存在的問(wèn)題是需要具有兩種熒光材料(其具有不同波長(zhǎng))的探針。上述問(wèn)題在實(shí)施多重檢測(cè)中是顯著的限制，而本發(fā)明可通過(guò)熒光探針的熔解曲線分析解決了所述問(wèn)題。然而，在其中使用未修飾的PNA探針實(shí)施熔解曲線分析的情況中，由于在熔解曲線圖一半最大值處的半寬度是大的，存在的劣勢(shì)是用雜合樣品的分析結(jié)果并不精確。因此，本發(fā)明的發(fā)明人嘗試將PNA探針的骨架與具有負(fù)電荷的氨基酸的側(cè)鏈偶聯(lián)，從而隨著溫度增加，PNA探針和靶DNA迅速解離，由此能夠精確分析熔解曲線。因此簡(jiǎn)化的示意圖示于圖1。

由于在熔解曲線圖的半最大值處較小的半寬度，根據(jù)本發(fā)明的PNA探針可應(yīng)用于多種分子診斷技術(shù)，如下述實(shí)例。例如，在其中核苷酸多態(tài)性發(fā)生于短核苷酸序列中多個(gè)位置處的密碼子的情況中，由于熔解曲線的解析/分辨率很高，可使用一個(gè)PNA探針檢測(cè)核苷酸多態(tài)性是否在一個(gè)位置或在兩個(gè)或多個(gè)位置發(fā)生。此外，由于高解析/分辨率，熔解曲線可根據(jù)核苷酸多態(tài)性發(fā)生的位置處的堿基而區(qū)分，且因此，具有修飾的核苷酸序列可簡(jiǎn)單地得出而無(wú)需單獨(dú)的分析(如序列分析)。

由于增加的熔解曲線解析/分辨率，根據(jù)本發(fā)明使用PNA探針用于檢測(cè)核苷酸多態(tài)性的熔解曲線分析方法可使得實(shí)施核苷酸多態(tài)性的多重檢測(cè)成為可能，且此外，甚至在其中SNP彼此相鄰的情況中，可實(shí)施多重檢測(cè)。

此外，甚至其中引入根據(jù)本發(fā)明與具有負(fù)電荷的氨基酸的側(cè)鏈偶聯(lián)的PNA探針以及在并非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置形成錯(cuò)配的堿基的情況中，可獲得與上述情況類似的效果。

本發(fā)明提供靶DNA的核苷酸多態(tài)性分析方法，其包括：

從測(cè)試樣品分離靶DNA；

將靶DNA與PNA探針雜交，所述PNA探針含有報(bào)告物和與其偶聯(lián)的淬滅物；

通過(guò)熔解由雜交獲得的產(chǎn)物同時(shí)改變溫度而獲得熔解曲線；并

分析獲得的熔解曲線。

其特征在于靶基因的核苷酸多態(tài)性分析方法中使用的PNA探針，和熔解曲線分析方法含有負(fù)電荷分子，其中含有負(fù)電荷分子的PNA探針可含有選自由所有的酸組成的組的至少一種負(fù)電荷分子，所有的酸包括氨基酸、氨基酸側(cè)鏈、磷酸、羧酸、磺酸、硝酸和硼酸。負(fù)電荷分子可與PNA探針的N末端、C末端，或PNA骨架的α、β或γ位置偶聯(lián)，且至少一種負(fù)電荷分子可與PNA探針的每個(gè)堿基連續(xù)或間歇偶聯(lián)。

此外，在根據(jù)本發(fā)明的核苷酸多態(tài)性分析方法和熔解曲線分析方法中使用的PNA探針可包含熒光材料。探針可具有報(bào)告物和淬滅物的熒光材料，所述淬滅物能夠淬滅與其兩末端都偶聯(lián)的報(bào)告物的熒光，并可包含嵌入式熒光材料。報(bào)告物可為選自下組的至少一種：FAM(6-羧基熒光素)、德州紅(Texas red)、JOE、TAMRA、CY5和CY3，且淬滅物優(yōu)選是TAMRA(6-羧基四甲基-羅丹明)、BHQ1、BHQ2或Dabysyl，但本發(fā)明不限于此。嵌入式熒光材料可選自下組：吖啶同二聚體及其衍生物、吖啶橙及其衍生物、7-氨基放線菌素D(7-AAD)及其衍生物、放線菌素D及其衍生物、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠及其衍生物、溴化乙錠及其衍生物、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)及其衍生物、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)及其衍生物、乙錠單疊氮化物(ethidium monoazide)及其衍生物、碘化己啶及其衍生物、雙苯酰亞胺(bisbenzimide)、Hoechst 33258及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥芪巴脒(hydroxystilbamidine)及其衍生物、LDS751及其衍生物、碘化丙啶(PI)及其衍生和Cy-染料衍生物。

用于靶基因的核苷酸多態(tài)性分析方法的PNA探針可含有報(bào)告物和淬滅物，其中所述PNA探針含有與其偶聯(lián)的負(fù)電荷分子。含有負(fù)電荷分子、報(bào)告物和淬滅物的PNA探針與靶DNA雜交且隨后生成熒光信號(hào)，且隨溫度增加，由于負(fù)電荷效應(yīng)，PNA探針和靶DNA在探針的最佳熔解溫度迅速熔解，從而淬滅熒光信號(hào)。與無(wú)負(fù)電荷的PNA探針相比，含有負(fù)電荷的PNA探針迅速?gòu)陌蠨NA解離以增加熔解曲線的解析/分辨率。通過(guò)從根據(jù)溫度變化的熒光信號(hào)獲得的具有高解析/分辨率的熔解曲線分析，可分析靶DNA的核苷酸多態(tài)性。

此外，用于靶基因的核苷酸多態(tài)性的PNA探針可含有嵌入式熒光材料，其中所述PNA探針含有與其偶聯(lián)的負(fù)電荷分子。含有與其偶聯(lián)的嵌入式熒光材料和負(fù)電荷分子的探針與靶DNA雜交且隨后生成熒光信號(hào)，且由于負(fù)電荷效應(yīng)，PNA探針和靶DNA在探針的最佳熔解溫度迅速熔解，從而淬滅熒光信號(hào)。通過(guò)根據(jù)熒光信號(hào)的溫度獲得的具有高解析/分辨率的熔解曲線分析，可分析靶DNA的核苷酸多態(tài)性。

此外，根據(jù)本發(fā)明的靶基因的核苷酸多態(tài)性分析方法可包括分析通過(guò)使用熒光信號(hào)檢測(cè)獲得的熔解曲線而不將嵌入式熒光材料與探針直接偶聯(lián)。

本發(fā)明提供使用PNA探針的熔解曲線分析方法用于分析靶基因的核苷酸多態(tài)性的試劑盒，所述PNA探針包含報(bào)告物和與其偶聯(lián)的淬滅物。

其特征在于PNA探針含有負(fù)電荷，且試劑盒優(yōu)選含有PNA探針，所述PNA探針包含報(bào)告物和與其偶聯(lián)的淬滅物，但本發(fā)明不限于此。

用于分析核苷酸多態(tài)性的試劑盒可通過(guò)分析多重靶DNA或單靶DNA的核苷酸多態(tài)性而使用。

此后，將參照下述實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于例示本發(fā)明，且根據(jù)本發(fā)明的精髓對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明的范圍不應(yīng)理解為受限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1熔解曲線分析實(shí)驗(yàn)中使用的PNA探針、靶DNA寡聚物合成和熔解曲線分析方法

為了實(shí)施本發(fā)明的熔解曲線分析，合成了如下表1所示的PNA探針來(lái)使用。

[表1]本發(fā)明中使用的PNA探針的序列

在上文表1中，O指示接頭，粗體字母指示γ-谷氨酸-PNA單體且K指示賴氨酸。

根據(jù)韓國(guó)專利公開號(hào)464261[Lee等,Org.Lett.,9:3291-3293,2007]所述的方法，通過(guò)固相合成通過(guò)從苯并噻唑磺?；?Bts)保護(hù)的PNA單體和官能化的樹脂合成PNA寡聚物而制備PNA探針。除上述的方法外，PNA探針可使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧基羰基(t-Boc)合成方法合成[Kim L.等,J.Org.Chem.59:5767-5773,1994；Stephen A.等,Tetrahedron,51:6179-6194,1995]。根據(jù)本領(lǐng)域廣泛已知的方法在PNA探針上標(biāo)記報(bào)告物材料和淬滅物材料。

作為將與PNA探針偶聯(lián)的靶DNA寡聚物，使用了由Bioneer Corporation(韓國(guó))合成的DNA寡聚物。

[表2]本發(fā)明中使用的DNA寡聚物的序列

添加了1.25μM上表1中所列的PNA探針、0.25μM上表2中所列的DNA寡聚物和PCR擴(kuò)增溶液(Enzynomics Co.,Ltd.,Korea)并彼此混合，然后是使用實(shí)時(shí)PCR儀(CFX96^TM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng))在95℃反應(yīng)5分鐘，溫度以0.1℃/秒的速率減少直至40℃并將反應(yīng)物保持5分鐘，然后測(cè)量熒光同時(shí)從40℃以0.5℃將溫度增加至95℃，由此實(shí)施熔解曲線分析。

實(shí)施例2使用包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸的PNA探針進(jìn)行的具有單核苷酸多態(tài)性的雜合樣品的熔解曲線分析

為了比較包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸的PNA探針與未修飾的PNA探針之間的熔解曲線中的差異，通過(guò)實(shí)施例1的方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析了熔解曲線，所述實(shí)驗(yàn)使用包含表1中的SEQ ID NO:1和2的PNA探針和寡聚物的樣品，所述寡聚物通過(guò)將表2中SEQ ID NO:10的DNA寡聚物以1:1的比例分別與表2中的SEQ ID NO:11至13的DNA寡聚物之一混合而制備。

其結(jié)果示于圖2。可以理解的是在其中使用了包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸的PNA探針(即，包含引入其中的負(fù)電荷分子的PNA探針)的情況中，由于負(fù)電荷效應(yīng)，根據(jù)溫度的增加，PNA探針從靶DNA迅速解離，從而具有SNP的雜合樣品中熔解曲線的解析/分辨率顯著增加。

實(shí)施例3根據(jù)與PNA探針偶聯(lián)的γ-谷氨酸的位置具有單苷酸多態(tài)性的雜合樣品的熔解曲線分析

為根據(jù)γ-谷氨酸(其為與PNA探針偶聯(lián)的負(fù)電荷分子)的位置比較熔解曲線的差異，通過(guò)上述實(shí)施例1的方法，使用樣品通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析了熔解曲線，所述樣品分別包含表1中的SEQ ID NO:3、4、5和6的PNA探針和以1:1的比例彼此混合的表2中的NO:13至14的DNA寡聚物。其結(jié)果示于圖3。

在使用與兩個(gè)γ-谷氨酸偶聯(lián)、其間具有兩個(gè)核苷酸的PNA探針的情況中，將兩條熔解曲線在具有SNP的雜合樣品中最精確地彼此分開。

實(shí)施例4含有三個(gè)不同PNA探針的三個(gè)不同的純合樣品或包含單核苷酸多態(tài)性的雜合樣品的熔解曲線分析，其中三個(gè)不同PNA探針含有與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸

通過(guò)確認(rèn)上述實(shí)施例2是否能夠用于多重檢測(cè)，進(jìn)行了實(shí)施例4。通過(guò)上述實(shí)施例1的方法，分別使用下述樣品通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析熔解曲線：包含表1中SEQ ID NO:2的PNA探針與靶寡聚物的組合的樣品，所述靶寡聚物通過(guò)包含表2中SEQ ID NO:10或11的DNA寡聚物或通過(guò)以1:1的比率彼此混合兩種DNA寡聚物而制備；包含表1中SEQ ID NO:7的PNA探針與靶寡聚物的組合的樣品，所述靶寡聚物通過(guò)包含表2中SEQ ID NO:15或16的DNA寡聚物或通過(guò)以1:1的比率彼此混合兩種DNA寡聚物而制備；和包含表1中SEQ ID NO:8的PNA探針與靶寡聚物的組合的樣品，所述靶寡聚物通過(guò)包含表2中SEQ ID NO:17或18的DNA寡聚物或通過(guò)以1:1的比率彼此混合兩種DNA寡聚物而制備。

其結(jié)果示于圖4。確認(rèn)了多重檢測(cè)能夠使用PNA探針執(zhí)行，所述PNA探針包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸。

實(shí)施例5使用三個(gè)不同的PNA探針在具有相鄰的不同的單核苷酸多態(tài)性的雜合樣品中的熔解曲線分析，其中三個(gè)不同的PNA探針包含與其偶聯(lián)γ-谷氨酸

通過(guò)確認(rèn)由上述實(shí)施例4確認(rèn)的多重檢測(cè)能力是否能夠甚至在SNP彼此相鄰的情況中進(jìn)行，進(jìn)行了實(shí)施例5。使用包含表1中的SEQ ID NO:2、7和8的三個(gè)PNA探針和靶寡聚物的樣品通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析了熔解曲線，所述靶寡聚物通過(guò)包含表2中的SEQ ID NO:19或20的DNA寡聚物或通過(guò)以1:1的比率將兩者DNA寡聚物彼此混合而制備。

其結(jié)果示于圖5。通過(guò)使用包含與其偶聯(lián)的γ-谷氨酸的PNA探針，確認(rèn)了多重檢測(cè)甚至在SNP彼此相鄰的情況中能夠執(zhí)行。

實(shí)施例6使用PNA探針在具有不同的單核苷酸多態(tài)性的雜合樣品中的熔解曲線分析，所述PNA探針具有引入其中的堿基，所述堿基在并非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置處形成錯(cuò)配

為比較具有引入其中的在并非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置處形成錯(cuò)配的堿基的PNA探針的效果，通過(guò)實(shí)施例1的方法，分別使用下述樣品通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析了熔解曲線：包含表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和靶寡聚物的樣品，所述靶寡聚物通過(guò)將SEQ ID NO:21的DNA寡聚物與表2中的SEQ ID NO:22至24的DNA寡聚物之一以1:1比例混合而制備，包含表1中SEQ ID NO:9的PNA探針和靶寡聚物的樣品，所述靶寡聚物通過(guò)將SEQ ID NO:25的DNA寡聚物與表2中的SEQ ID NO:26至28的DNA寡聚物之一以1:1比例混合而制備。

其結(jié)果示于圖6。通過(guò)使用具有引入其中的在并非靶DNA的SNP修飾位置的不同位置處形成錯(cuò)配的堿基的PNA探針，確認(rèn)了兩條熔解曲線在具有SNP的雜合樣品中最精確地彼此分開。

在本發(fā)明中開發(fā)的PNA熒光探針不僅可用于上文實(shí)施例清楚描述的熔解曲線分析方法，還可用于能夠使用熒光探針?lè)治霭蠨NA的所有方法，例如，實(shí)時(shí)PCR方法；然而，其僅通過(guò)實(shí)施例的方式描述，且本發(fā)明并不限于此。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是可使用所有已知的方法。

工業(yè)實(shí)用性

根據(jù)本發(fā)明的PNA探針的骨架可與具有負(fù)電荷的氨基酸的側(cè)鏈偶聯(lián)，從而PNA探針可具有對(duì)于靶DNA的高識(shí)別能力和對(duì)于靶DNA的高偶聯(lián)能力且可通過(guò)熱迅速解離。因此，本發(fā)明的使用包含負(fù)電荷的PNA探針的核苷酸多態(tài)性分析方法具有的優(yōu)勢(shì)在于甚至在顯示兩條熔解曲線圖的雜合樣品中可相對(duì)容易地進(jìn)行核苷酸多態(tài)性分析，且可同時(shí)分析兩個(gè)和更多個(gè)鄰近的單核苷酸多態(tài)性。此處，容易實(shí)施的熔解曲線分析不限于雜合樣品，還可應(yīng)用于包括純合樣品的所有樣品。

已基于其具體特征詳細(xì)描述了本發(fā)明，而且對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是這些特定的技術(shù)僅為優(yōu)選的實(shí)施方案且因此本發(fā)明的范圍不限于所述實(shí)施方案。因此，本發(fā)明實(shí)質(zhì)的范圍由所附的權(quán)利要求及其等同物限定。

序列表自由文本

附于本文件。

序列表

<110> 帕納金股份有限公司(PANAGENE INC.)

<120> 使用PNA探針的熔解曲線分析、使用熔解曲線分析用于分析核苷酸多態(tài)性的方法和試劑盒

<130> PF-B1787

<140> PCT/KR2014/002909

<141> 2014-04-04

<160> 28

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 861-F71

<400> 1

caaacagctg gg 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 861-glu2-71-65

<400> 2

caaacagctg gg 12

<210> 3

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 858-F-78

<400> 3

ttgggcgggc c 11

<210> 4

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 858-glu2-70

<400> 4

ttgggcgggc c 11

<210> 5

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 858-glu270

<400> 5

ttgggcgggc c 11

<210> 6

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 858-glu-270

<400> 6

ttgggcgggc c 11

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 18-2-3

<400> 7

tagttgggat gtac 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K13_melt

<400> 8

acgccaccag ctcc 14

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K

<400> 9

gagcttggtg gcg 13

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 58T-61T

<400> 10

cgcacccagc tgtttggcct gcccaaaatc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 58T-61A

<400> 11

cgcacccagc agtttggcct gcccaaaatc 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 58T-61G

<400> 12

cgcacccagc ggtttggcct gcccaaaatc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 58C-61C

<400> 13

cgcacccagc cgtttggcct gcccaaaatc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 58A-61C

<400> 14

cgcacccagc cgtttggcca gcccaaaatc 30

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> Tm-13-04

<400> 15

catgtacgtc ccaactacat g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> Tm-13-01

<400> 16

catgtacgtc acaactacat g 21

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 2120758-G(W)

<400> 17

aaggttggag atggtggcgt aggcta 26

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 2120758-C

<400> 18

aaggttggag atgctggcgt aggcta 26

<210> 19

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 3Target_W

<400> 19

cacccagctg tttggaagca tggtacgcca ctaagctcca aggaatcggt tggagatggt 60

ggcgtaggct a 71

<210> 20

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 3Target_M

<400> 20

cacccagcag tttggaagca tggtacgcca gtaagctcca aggaatcggt tggagatgct 60

ggcgtaggct a 71

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)

<400> 21

catgcgccac caagctccat g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-0A

<400> 22

catgcgccac taagctccat g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-0C

<400> 23

catgcgccac gaagctccat g 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-0T

<400> 24

catgcgccac aaagctccat g 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-0A

<400> 25

catgcgccac taagctccat g 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-1A

<400> 26

catgcgccaa taagctccat g 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-2A

<400> 27

catgcgccag taagctccat g 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> K(D)-3A

<400> 28

catgcgccat taagctccat g 21