專利名稱：：一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法及其專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法及其專用載體。
背景技術(shù)：
：超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,簡(jiǎn)稱SOD)廣泛存在于各類生物體中，是機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基(02—)的天然消除劑，對(duì)機(jī)體細(xì)胞起保護(hù)作用。因此，SOD在防御02—的毒性、抗衰老以及預(yù)防腫瘤和抗炎等方面起著重要的生理作用，受到國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥日用化工、食品及生化界的極大關(guān)注。根據(jù)SOD所含金屬輔基的不同，一般可將其分為Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三種類型。SOD在臨床上有較廣泛的應(yīng)用，如用于骨關(guān)節(jié)炎、急肝與慢活肝的炎癥反應(yīng)，SOD可去除由炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的大量的超氧化自由基，對(duì)消退炎癥，恢復(fù)肝功能起到一定作用；用于治療因超氧陰離子傷害引起的疾病，如心肌缺血與缺血再灌注綜合癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、放射性膀胱炎、紅斑狼瘡等(FattmanCL，EnghildJJ,CrapoJD，Wa/.Purificationandcharacterizationofextracellularsuperoxidedismutaseinmouselung.B/oc/ze/wCo附mww,2000,275:542—548;HuangP,FengL,OldhamEA，a/.Superoxidedismutaseasatargetfortheselectivekillingofcancer.iVam"，2000，407(6802):390-395;賈寧人，王麗珠等.化學(xué)發(fā)光法測(cè)定超氧化物歧化酶.臨床檢驗(yàn)雜志，1996,14(2):59-62)。SOD在食品工業(yè)中主要應(yīng)用四方面1)作為保健食品的功效因子或食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，添加到各種食品中。2)制成多種劑型的SOD或復(fù)合型食品。3)用作食品的天然抗氧化劑。4)以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妝品中可起到防曬、防止脂褐素的形成、防治皮膚病以及防治瘢痕形成等作用(崔慧斐，張?zhí)烀?超氧化物歧化酶在食品和化妝品中的應(yīng)用及其發(fā)酵法生產(chǎn)進(jìn)展.藥物生物技術(shù),2000,7(3):187-189)。超氧化物歧化酶SOD作為自由基清除劑，是一種可以增進(jìn)人體健康的重要活性物質(zhì)，我國(guó)自上世紀(jì)八十年代以來，對(duì)SOD的應(yīng)用研究主要側(cè)重于動(dòng)植物SOD的提取和純化，國(guó)內(nèi)SOD產(chǎn)品大部分是從動(dòng)物血液中制備的，但由于原材料有限及衛(wèi)生安全性等原因，導(dǎo)致制品產(chǎn)量有限，特別是隨著世界各地瘋牛病、禽流感、口蹄疫等惡性傳染病的不時(shí)報(bào)道，動(dòng)物源血液制品的風(fēng)險(xiǎn)加大，純度要求的增高也增加了產(chǎn)品的成本，特別是由于瘋牛病的影響，歐盟規(guī)定從1997年1月起，禁止使用牛血SOD作為食品添加劑使用后，利用基因工程是廣開SOD酶源、降低成本和獲得具有天然活性的SOD的有效途徑。釀酒酵母(Sacc/zaraw;;cesce"Ww'ae)，又名面包酵母，在釀酒業(yè)和面包業(yè)中的使用已有數(shù)千年的歷史，被認(rèn)為是GRAS生物(generallyrecognizedassafe)，已被美國(guó)FDA認(rèn)定為安全性的生物，其表達(dá)產(chǎn)物不需經(jīng)過大量宿主安全性實(shí)驗(yàn)(宋麗雅，于群，卜鳳榮.幾種主要的酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展.中國(guó)輸血雜志,2003,16(3):209-211)。釀酒酵母作為一種模式生物，是迄今了解最完全的真核生物，上千個(gè)基因已被分析，完整的基因組測(cè)序已于1996年完成。自1981年Hitzeman等用釀酒酵母表達(dá)人干擾素獲得成功后，人們還用釀酒酵母表達(dá)了多種原核和真核蛋白。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)相比畢赤酵母等表達(dá)系統(tǒng)具有其自身表達(dá)量較低等的不足，但是，它卻具有其它表達(dá)系統(tǒng)不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。作為酵母的一種，其培養(yǎng)條件普通，生長(zhǎng)繁殖迅速；用于表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，工藝簡(jiǎn)單，能夠耐受較高的流體靜壓，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低生產(chǎn)成本；作為一種GRAS生物，它已廣泛用于釀酒和食品工業(yè)，不會(huì)產(chǎn)生毒素，安全可靠；作為單細(xì)胞真核生物，它表達(dá)外源基因時(shí)具有一定的翻譯后加工能力，具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性；作為一種模式生物，它的遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作，可以利用基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行高水平表達(dá)。目前大量表達(dá)蛋白最常使用的表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，雖然它能進(jìn)行高密度發(fā)酵表達(dá)，發(fā)酵過程簡(jiǎn)單，成本也較低廉。但由于畢赤酵母不是一種食品微生物，表達(dá)過程產(chǎn)生的物質(zhì)不能完全確認(rèn)安全；其常用的分泌型載體pPICZalphaA又含有Zeocinr抗性基因，在篩選過程中必須添加高濃度抗生素來篩選高拷貝重組子；載體含目前己知畢赤酵母中的最強(qiáng)啟動(dòng)子A0X1，故發(fā)酵時(shí)需要添加甲醇誘導(dǎo)，所以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)完全不符合食品級(jí)安全要求，要用它來生產(chǎn)藥品或食品需要進(jìn)行多步驟的后續(xù)加工，還沒有被廣泛接受。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法。本發(fā)明的另一目的在于提供上述食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，包括如下步驟首先，超氧化物歧化酶基因插入釀酒酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處后，構(gòu)建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，通過限制性內(nèi)切酶A^I和^戸LI雙酶切該表達(dá)載體，完全去除Ampicimr^抗生素篩選標(biāo)志，同時(shí)切去了URA3基因片段的部分片段；然后，將被酶切去除的URA3片段部分重新與含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體連接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)、URA3片段以及不含有Ampidllii/抗生素篩選標(biāo)志的食品級(jí)釀酒酵母表達(dá)載體即食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體，將改造好的釀酒酵母食品級(jí)表達(dá)載體導(dǎo)入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)。一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，包括如下步驟(1)選定中國(guó)擬青霉CPfle"7omyc")Cu,Zn-SOD(簡(jiǎn)寫為psSOD)基因mRNA全長(zhǎng)序列，進(jìn)行全基因合成，psSOD基因mRNA全長(zhǎng)序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(2)設(shè)計(jì)并合成一對(duì)基因特異引物pYESpsSODf正向引物和pYESpsSODr反向引物，其序列為如下pYESpsSODf:5，-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3';pYESpsSODr:5，-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3，。以步驟(1)得到的含psSOD基因片段的質(zhì)粒為模板，pYESpsSOD(f+r)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增psSOD，并使克隆的psSOD兩端分別加上了/^mnn和laI酶切位點(diǎn)(恰為多克隆位點(diǎn)兩端酶切位點(diǎn))；得到的基因片段與pMD18-T載體連接，命名為pMD18-T-psSOD質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序與上述mRNA全長(zhǎng)序列相符。(3)用限制性內(nèi)切酶i^"JIII和laI雙酶切釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT及上述pMD18-T-psSOD質(zhì)粒，得到雙酶切載體與目的基因純化液；將回收純化的雙酶切載體與目的基因純化液以T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到的重組載體命名為pYES-psSOD。(4)上述構(gòu)建的重組載體pYES-psSOD通過J/^LI和7VcoI雙酶切，去除Ampr抗性基因即Ampicillir^抗生素篩選標(biāo)志，同時(shí)切去了Ampf抗性基因下游URA3基因片段的部分片段，把被酶切去除的URA3基因片段部分重新與pYES-psSOD重組載體連接。根據(jù)釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體的序列，設(shè)計(jì)上下游引物ura2和ura3，以擴(kuò)增載體28233513bp之間片段，并在片段的一端(即載體第2823bp端)引入^^LI酶切位點(diǎn)所述ura2:5,-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3,;所述扁3:5，-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3，;以pYES2/CT質(zhì)粒為模板，ura2、ura3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段URA3后，將目的片段URA3與pMD18-T連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-ura，所述URA3片段序列為如下Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatectgttg3ccc3atgcgtctcccttgtc3tcte犯ccc3c紅gggtgtcat犯tc犯cc犯tcgt犯ccttc3tctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg;(5)將已經(jīng)構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES-psSOD及pMD18-T-ura重組質(zhì)粒，用J/aLI禾PiVcoI進(jìn)行雙酶切，分別回收純化pYES-psSOD的5103bp大片段及pMD18-T-ura的700bp大小片段；將回收純化的雙酶切pYES-psSOD載體的5103bp大片段與pMD18-T-ura的700bp大小片段以T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒命名為pYES-psSOD-F，即為食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體。(6)將上述的食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體pYES-psSOD-F導(dǎo)入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)。所述釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體，它采用GAL1啟動(dòng)子，可以以食品級(jí)的誘導(dǎo)物半乳糖啟動(dòng)目的基因的表達(dá)；其上的URA3片段，與酵母宿主菌株上wra3-7互補(bǔ)，利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型，達(dá)到篩選目的，是食品級(jí)的選擇標(biāo)記；因此，通過改造去除Ampicillir/抗生素篩選標(biāo)記后的pYES2/CT載體為最優(yōu)選的釀酒酵母食品級(jí)表達(dá)載體。步驟(6)中，所述的釀酒酵母為"ra3-7基因突變型的釀酒酵母，可通過尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基篩選重組酵母。所述將食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體pYES-psSOD-F導(dǎo)入釀酒酵母中的優(yōu)選方法為氯化鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法，也可以采用其它生物工程領(lǐng)域中常用的方法，例如電激轉(zhuǎn)化法等。所述篩選獲得重組釀酒酵母的方法為涂布尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基。所述誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)時(shí)需加入半乳糖，半乳糖誘導(dǎo)濃度為2%(m/v)，誘導(dǎo)時(shí)間為4896小時(shí)。本發(fā)明所提供的超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)的方法，是構(gòu)建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，對(duì)重組載體進(jìn)行食品級(jí)改造，將改造好的釀酒酵母食品級(jí)表達(dá)載體導(dǎo)入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)。所述的食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體，是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)、URA3片段以及不含有AmpidllinR抗生素篩選標(biāo)志的釀酒酵母表達(dá)載體。所述超氧化物歧化酶基因位于釀酒酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)的III和^&al限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)之間。所述超氧化物歧化酶基因可為任意一種超氧化物歧化酶基因，包括Cu，Zn-SOD、Mn-SOD或Fe-SOD。本發(fā)明采用了食品級(jí)基因表達(dá)系統(tǒng)，其必須具備以下要求(1)食品級(jí)宿主菌在食品工業(yè)中得到長(zhǎng)期而廣泛應(yīng)用的菌株；(2)食品級(jí)載體不得含有非食品級(jí)功能性DNA片段；(3)食品級(jí)選擇標(biāo)記不能選用可能會(huì)引起抗性基因在物種間的水平轉(zhuǎn)移，對(duì)生物安全性有潛在的危險(xiǎn)的抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記；(4)食品級(jí)誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)物必須選用可食用的物質(zhì)。本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有的釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體進(jìn)行了改造，去除了含有抗性基因的Ampr片段即Ampicillii/抗生素篩選標(biāo)記，但保留了URA3基因，構(gòu)建了食品級(jí)載體；選用的釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT上的URA3片段，與酵母宿主菌株上wro5-7互補(bǔ)，利用尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型，達(dá)到篩選目的，是食品級(jí)的選擇標(biāo)記，不必加入抗生素；pYES2/CT載體采用啟動(dòng)子GALl，以可食用的半乳糖啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，是食品級(jí)的誘導(dǎo)物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明所提供的超氧化物歧化酶基因在釀酒酵母中的食品級(jí)表達(dá)方法，能直接表達(dá)出食品級(jí)的超氧化物歧化酶產(chǎn)物，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)SOD制備方法以及畢赤酵母和原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)方式的表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)復(fù)雜步驟純化后才能用于食品生產(chǎn)中的不足；若將本發(fā)明應(yīng)用于工業(yè)化SOD生產(chǎn)，產(chǎn)物可不經(jīng)過傳統(tǒng)的純化工藝而直接應(yīng)用于食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域，也可直接用于食品發(fā)酵，用以生產(chǎn)功能食品。此外，本發(fā)明還具有原料生物體生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景和實(shí)際意義。圖1為釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT圖譜。圖2為psSOD的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。其中，M:DL2000,hpsSOD擴(kuò)增片段。圖3為pYES-psSOD轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定圖。其中，Ml:MarkerIII;M2:DL2000;1、2:pYES2/CT菌落PCR產(chǎn)物;3、4:pYES-psSOD菌落PCR產(chǎn)物。圖4為pYES-psSOD載體的食品級(jí)改造流程圖。圖5為pYES-psSOD和pMD18-T-ura的雙酶切"paLWcoI)結(jié)果圖。其中，Ml:MarkerIII;M2:DL2000;1:pYES2/CT(JpaL1/7VcoI);24:pYES-psSOD(々aLI/7VcoI);5:pMD18-T-um(—LI/7Vco1)。圖6為w303-pYES-psSOD-F轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定圖。其中，M:DL2000;18:w303-pYES2/CT菌落PCR產(chǎn)物;9~12:w303-pYES-psSOD-F菌落PCR產(chǎn)物。圖7為w303-pYES-psSOD-F表達(dá)產(chǎn)物破壁液的SDS-PAGE分析圖。其中，M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:陰性對(duì)照；2:w303-pYES-psSOD-F誘導(dǎo)24h菌體破壁液；3:誘導(dǎo)48h菌體破壁液；4:誘導(dǎo)72h菌體破壁液；5:誘導(dǎo)96h菌體破壁液。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1中國(guó)擬青霉Cu,Zn-SOD在釀酒酵母中的食品級(jí)表達(dá)方法1、中國(guó)擬青霉Cu，Zn-SOD基因片段的獲得1)基因合成從GenBank中找到冬蟲夏草無性型中國(guó)擬青霉(尸aecz7omyc^w'"era&)的Cu，Zn-SOD基因mRNA全長(zhǎng)序列(GenBank登陸號(hào)為AY438328)，進(jìn)行全基因合成，基因CDS全長(zhǎng)為465bp。其序列為如下Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgccgacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaacta2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)中國(guó)擬青霉Cu,Zn-SOD基因mRNA序列設(shè)計(jì)上下游引物pYESpsSOD(f+r)，通過引物在psSOD基因兩端分別加入歷"dIII和I酶切位點(diǎn)11pYESpsSODf:5，-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3';pYESpsSODr:5，-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3，。3)PCR擴(kuò)增以步驟l)合成的含psSOD基因的質(zhì)粒為模板，pYESpsSOD(f+r)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增psSOD，并使克隆的psSOD兩端分別加上了III和11酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，PCR擴(kuò)增體系如下上游引物(10pM)1W下游引物(10|aM)1WexTaqDNA聚合酶0.5pl10xPCRBuffer2.5(ildNTP(2.5mMeach)2^tl模板DNA0.5piddH2017.5^Total25pi熱循環(huán)儀加熱蓋，94。C4min，然后94°C30sec，55°C30sec，72°C40sec，30個(gè)循環(huán)；接著72。C8min，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)，得到的片段大小接近500bp，與預(yù)期大小約480bp相符。將目標(biāo)條帶割膠回收后，與pMD18-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定、序列測(cè)定分析后，得到含正確的psSOD基因序列的質(zhì)粒，命名為pMD18-T-psSOD。2、重組表達(dá)載體pYES-psSOD的構(gòu)建1)目的片段和載體的雙酶切用限制性內(nèi)切酶///"dIII和laI雙酶切37°C6h釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT及鑒定過的上述pMD18-T-psSOD質(zhì)粒，得到雙酶切載體與目的基因純化液。2)載體與目的片段的體外連接將回收純化的雙酶切載體與目的基因純化液以T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到的重組質(zhì)粒命名為pYES-psSOD。3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pYES-psSOD用熱激法轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，用含有100pg/mLAmp的LB平板37匸培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行篩選。4)轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定根據(jù)釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體序列(見圖1)，設(shè)計(jì)pYES2/CT載體的測(cè)序引物pYEStest(f+r)，上下游引物分別位于其多克隆位點(diǎn)(見圖1)上下游，由廣州英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為pYEStestf:5，-AATATACCTCTATACTTTAACGTC-3';pYEStestr:5，-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3，。用無菌牙簽挑取在Amp平板上長(zhǎng)出的DH5a單菌落于lmlLB(Amp+)培養(yǎng)基，30°C250rpm過夜培養(yǎng)。用上述菌液作模板，以pYEStest(f+r)為引物，進(jìn)行菌落PCR。PCR擴(kuò)增體系同psSOD擴(kuò)增，熱循環(huán)儀加熱蓋，94匸預(yù)變性10min，94°C40sec，55。C40sec，72°C40sec，30個(gè)循環(huán)后，72°C10min，擴(kuò)增完畢后置4。C終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，pYES2/CT空載體和pYES-psSOD的轉(zhuǎn)化子菌落PCR產(chǎn)物理論上應(yīng)有223bp和609bp條帶，結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)化子PCR擴(kuò)增時(shí)，能得到約600bp大小的片段，初步說明目的片段已與載體連接。5)序列測(cè)定與分析把經(jīng)菌落PCR鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定與分析，得到含正確psSOD基因的pYES-psSOD重組載體。3、食品級(jí)重組表達(dá)載體pYES-psSOD-F的構(gòu)建根據(jù)圖4進(jìn)行pYES-psSOD載體的改造。構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES-psSOD上，帶有Ampr抗性基因，不符合食品級(jí)的要求，根據(jù)pYES2/CT載體的序列可知，其Amp「抗性基因位于19632823bp，而J;aLI酶切位點(diǎn)有兩個(gè)，分別位于1458bp和2704bp處，通過JpaLI酶切可去除Ampr抗性基因的絕大部分片斷；而在Ampr抗性基因下游URA3基因中有iVcoI酶切位點(diǎn)，通過J/^LI和7VcoI雙酶切，可以完全去除Ampr抗性基因，達(dá)到防止抗性基因在物種水平間遷移的目的。但同時(shí)切去了Ampr抗性基因下游URA3基因片段的一部分，而由于URA3基因是重組表達(dá)載體在釀酒酵母中篩選所需的，因此必須把被酶切去除的URA3基因片段的一部分(即載體上28233513bp片段)重新與載體連接。所述URA3片段序列為如下Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg。1)載體補(bǔ)充片段(um)的獲得根據(jù)釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體的序列，設(shè)計(jì)上下游引物ura2和ura3，以擴(kuò)增載體28233513bp之間片段，并在片段的一端(載體第2823bp端)引入^^LI酶切位點(diǎn)腦2:5，隱GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3'ura3:5，-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3'以pYES2/CT質(zhì)粒為模板，ura2、ura3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同psSOD擴(kuò)增。割膠回收目的片段后，將目的片段URA3與pMD18-T連接，進(jìn)行轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定、序列測(cè)定分析。重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-ura。2)pMD18-T-ura和pYES-psSOD的雙酶切取已經(jīng)構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES2-psS0D及鑒定過的pMD18-T-ura重組質(zhì)粒，用JpaLI和iVcoI進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)結(jié)束后，酶切產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。pMD18-T-ura經(jīng)JpaLI禾QiVcoI雙酶切后，所得片段(ura)大小約為700bp;pYES2/CT載體經(jīng)相同雙酶切后，所得為一個(gè)大片段約4294bp和兩個(gè)分別為1246bp和809bp的小片段；pYES-psSOD產(chǎn)生的大片段為5103bp，電泳結(jié)果與此相符，如圖5所示。分別回收pYES2/CT和pYES-psSOD酶切后的大片段及pMD18-T-ura的700bp片段，用于下一步連接反應(yīng)。3)重新連接表達(dá)載體將回收純化的雙酶切pYES-psSOD載體的5103bp大片段與pMD18-T-ura的700bp片段以T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒命名為pYES-psSOD-F。該載體是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)、完整URA3片段以及不含有AmpicillinK抗生素篩選標(biāo)志的食品級(jí)釀酒酵母表達(dá)載體。4)重組表達(dá)載體pYES-psSOD-F的食品級(jí)鑒定把連接好的食品級(jí)載體pYES-psSOD-F轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cc中(同時(shí)做pYES2/CT空載體轉(zhuǎn)化為對(duì)照)，轉(zhuǎn)化后取200|il菌液涂布于含有Amp(100嗎/mL)的LB平板上，37"C倒置培養(yǎng)16h后pYES2/CT長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，而pYES-psSOD-F在37。C培養(yǎng)72h后仍沒有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，說明Ampf抗性基因已失效，不存在抗生素抗性基因在物種水平間遷移的危險(xiǎn)，達(dá)到食品級(jí)的要求。4、psSOD在釀酒酵母中食品級(jí)表達(dá)菌株釀酒酵母w303-lA由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，基因型為(MATa,ura3畫l，leu2-3-112，trpl畫l,his3-11,ade2畫l，canl畫100)。YPD培養(yǎng)基稱取蛋白胨20g、酵母粉5g、葡萄糖20g，加ddH20定容至1L，高壓滅菌，4"C保存。缺乏脲嘧啶的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷混合物(drop-outmix)組成每升溶液加入以下固體，過濾除菌。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>液體選擇培養(yǎng)基200ml營(yíng)養(yǎng)缺陷混合物(drop-outmix)，100ml20。/。葡萄糖，100ml6.7%YNB(過濾除菌)，加滅菌ddH20到lOOOml。固體選擇培養(yǎng)基600mLddH20中加入瓊脂粉20g，高壓滅菌后冷卻至60°C，加入200mldrop-outmix,100ml20%葡萄糖，100ml6.7%YNB(過濾除菌)。選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基在選擇培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，20%葡萄糖換成20%半乳糖。1)釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備及化學(xué)轉(zhuǎn)化(1)挑取釀酒酵母w303-lA單菌落接種至3mL液體YPD，30。C下振蕩培養(yǎng)過夜；(2)測(cè)定過夜培養(yǎng)物OD6。。，計(jì)算菌體密度(lOD=107cells/ml);(3)以YPD培養(yǎng)液將酵母密度稀釋至5xl06cells/ml，置3(TC，250r/min振蕩培養(yǎng)至菌體密度達(dá)2xl07cells/ml(約34h);(4)用10ml無菌離心管以4,000rpm離心3min，收集細(xì)胞，每5ml菌液細(xì)胞集于1管。(5)把細(xì)胞重新懸浮在500pl無菌水中，并將重懸液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，13,000rpm離心12sec;(6)棄上清，把細(xì)胞重懸于200)il的0.1mol/L醋酸鋰(LiAc)中，30°C溫浴15min，每5min輕輕振搖一次；(7)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化混合液，在離心管中小心加入5plCarrierDNA(鮭魚精10mg/mL)、45|ilddH20，混合后煮沸8-10min，然后加入36|il1mol/LLiAc禾口24jil10xTE。(8)將溫浴產(chǎn)物13,000rpm離心12sec，棄上清后加入240^140%PEG-3350、110pl轉(zhuǎn)化混合液和5(ilpYES-psSOD-F質(zhì)粒(同時(shí)轉(zhuǎn)化pYES2/CT空載體做對(duì)照)；震蕩混勻后25'C溫浴30min;(9)加入40iiLDMSO(對(duì)酵母細(xì)胞有毒害作用，加入后迅速混勻)；(10)42。C水浴熱激18min;(11)熱激完畢后取出置冰上lmin，13，000rpm離心15sec棄上清，收集菌體；(12)以100200plddH20重懸菌體，取100(il菌液涂布Ur&選擇培養(yǎng)基平板，30。C靜置約3060min，待液體全部吸收后，倒置培養(yǎng)23天。將重組酵母命名為w303-pYES-psSOD-F。2)重組酵母的菌落PCR鑒定w303-lA菌株是尿嘧啶URA營(yíng)養(yǎng)缺陷型，選擇培養(yǎng)基同樣是尿嘧啶缺失，因此理論上只有pYES載體上的URA3序列與宿主菌的ura3-l互補(bǔ)后才能在選擇培養(yǎng)基中長(zhǎng)出。用滅菌牙簽挑取上述轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的w303-lA單菌落于10|ilddH2O中，沸水浴10min后作為模板，以pYEStest(f+r)為引物進(jìn)行菌落。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，理論上，w303-pYES2/CT空載體轉(zhuǎn)化子菌落PCR產(chǎn)物應(yīng)有223bp條帶，w303-pYES-psSOD-F重組轉(zhuǎn)化子則有約609bp的條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，挑取的轉(zhuǎn)化子條帶與目標(biāo)相符，可初步斷定為重組轉(zhuǎn)化子。3)重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)pYES系列載體是GALl啟動(dòng)子，葡萄糖可抑制其轉(zhuǎn)錄開始(West"a/.,1984)，半乳糖誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄開始(Giniger^"/"簡(jiǎn))。(1)挑取經(jīng)鑒定的w303-pYES-ps-SOD-F單菌落至15mlw303-lA選擇培養(yǎng)基(含2%葡萄糖)，3(TC下250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；(2)測(cè)定過夜培養(yǎng)物OD6Q。，根據(jù)公式計(jì)算稀釋至50mlOD6。。二0.4時(shí)所需要的培養(yǎng)液數(shù)量。例如0D,測(cè)定后為3，則所需要的培養(yǎng)液為50ml*0.4OD/30D=6.67ml。(3)取出所需數(shù)量培養(yǎng)液，1，500g離心5min收集菌體；(4)以50ml選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含2。/^半乳糖)重懸菌體，30。C250rpm培養(yǎng)；(5)在24h、48h、72h、96h分別取樣5ml。4)重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的鑒定玻璃珠法破碎重組酵母細(xì)胞所用溶液BreakingBuffer:10mM磷酸鈉，lmMEDTA，0.1%TritonX-100，pH7.8。鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活力所用Buffer:BufferA:lOOmMTris-HCl緩沖液；BufferB:2mMDTPA;BufferC:BufferA與BufferB按體積比1:1混合，調(diào)至pH8.2;BufferD:10mMHC1，將36%HC11ml溶于116mlddH20;BufferE:20mM鄰苯三酚(lOOx，以BufferD溶解)避光放置。Bradford蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法所用溶液考馬斯亮蘭G-250染料試劑稱lOOmg考馬斯亮蘭G-250,溶于50ml95%的乙醇后，再加入100ml85%的磷酸，用水稀釋至l升，濾紙過濾，4。C保存于棕色瓶中；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用牛血清清蛋白(BSA)配制成0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，室溫穩(wěn)定2小時(shí)。5)重組酵母的破壁檢測(cè)以玻璃珠法進(jìn)行釀酒酵母細(xì)胞的破壁處理A、根據(jù)菌液OD6(M)值計(jì)算其菌體密度OOD=107cells/ml)，取出含10xlO、ells的菌液，同時(shí)記錄所取用的菌液體積，作后續(xù)酶活力的換算使用；①1，500g，4。C離心5min棄上清，收集細(xì)胞；②加入500^1ddH20重懸菌體，轉(zhuǎn)移至1.5mL無菌離心管，以最大轉(zhuǎn)速離心30sec，棄上清，收集細(xì)胞；③加入500piBreakingbuffer重懸菌體，l,500g，4。C離心5min棄上清，收集細(xì)胞；加入200jilBreakingbuffer重懸菌體；(D加入等體積酸洗玻璃珠；⑥渦旋振蕩30sec后，馬上置于冰上30sec，重復(fù)10次；⑦以最高轉(zhuǎn)速(約12,00013，000g)離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新EP管，上清液即為酵母破壁液。B、破壁液的SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測(cè)取誘導(dǎo)表達(dá)24h、48h、72h、96h各時(shí)間段樣品的破壁液2(Vl，加入20^12x上樣緩沖液，沸水煮5分鐘，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。每孔點(diǎn)樣15)il。采用不連續(xù)體系，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%。以半乳糖誘導(dǎo)w303-pYES-psSOD-F重組菌，對(duì)經(jīng)誘導(dǎo)的重組釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁處理后，以破壁液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)用空載體pYES2/CT轉(zhuǎn)化的宿主菌的破壁液作空白對(duì)照。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7顯示，從48h開始，出現(xiàn)一條約21kDa的蛋白條帶(箭頭所示處)，應(yīng)為psSOD蛋白，此psSOD的表觀分子量稍大于其16kDa的理論分子質(zhì)量，這一點(diǎn)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的相同(YooHY,KimSS，RhoHM.OverexpressionandsimplepurificationofhumanSODinyeastanditsresistancetooxidativestress.■/S/ofec/z"o/,1999，68(l):29-35;何煒，袁漢英，高卜渝，陳向嶺，李育陽(yáng).超氧化物歧化酶在釀酒酵母系統(tǒng)中的高效表達(dá).復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,43(2):156-162;李雪蓮，馬一君，武峰，史兆興，王恒梁，黃留玉.人銅鋅超氧化物歧化酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在釀酒酵母中的分泌表達(dá).鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007,42(1):127-130)。C、破壁液的SOD酶活力檢測(cè)采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行破壁液的SOD酶活力的測(cè)定。①溶液體系按照以下配方混合溶液:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>②標(biāo)準(zhǔn)曲線制定首先測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率，取反應(yīng)體系所需各種溶液，分別置于25士0.5"C水浴下預(yù)熱20min，然后迅速混合，振蕩混勻，以空白為對(duì)照測(cè)定OD42。，每間隔0.5min記錄一次讀數(shù)，連續(xù)記錄3min。描繪自氧化速率標(biāo)準(zhǔn)曲線。③破壁液SOD酶活力測(cè)定同上述流程，通過調(diào)節(jié)表達(dá)上清濃度，每0.5min記錄一次OD42。，描繪SOD抑制自氧化速率曲線圖，控制氧化速率在為鄰苯三酚自氧化的50%左右。④破壁液濃度測(cè)定利用Bradford法測(cè)定表達(dá)上清的蛋白濃度，方法如下a.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線__123456780.5mg/mlBSA0051015202530.15mMNaCl100100959085807570按上表中數(shù)量混合溶液，然后各試管中分別加入lml考馬斯亮蘭G-250試劑，每加完一管，立即混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。加完試劑2min后，測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為第1號(hào)試管，以蛋白濃度和光吸收作標(biāo)準(zhǔn)曲線。b.樣品測(cè)定把待測(cè)樣品稀釋至10-100嗎/ml的濃度，取100|il樣品稀釋液加入lml考馬斯亮藍(lán)，后續(xù)步驟同上。測(cè)得A595值后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出相應(yīng)濃度。結(jié)果計(jì)算酶活力單位的定義在lml反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。酶活力單位計(jì)算公式如下SOD活力(U/ml)=~"50%hA0—鄰苯三酚自氧化速率；A廣SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率；N—樣品測(cè)定前稀釋倍數(shù)；V。-反應(yīng)液總體積(4.5ml);V,--加入的SOD溶液體積(O.lml)。首先測(cè)定破壁液的SOD酶活力(U/ml);通過已知的各樣品每200|il破壁液對(duì)應(yīng)的發(fā)酵液體積，計(jì)算每ml發(fā)酵液的酶活力；然后利用Bradford法測(cè)定破壁液中的蛋白濃度，并通過微機(jī)掃描分析目標(biāo)表達(dá)蛋白表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的百分比，從而計(jì)算每毫克psSOD蛋白的SOD酶活力(U/mg):半乳糖誘導(dǎo)48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)后，表達(dá)產(chǎn)物蛋白的SOD酶活力分別為789.48、1320.28和1158.33U/mg。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>中山大學(xué)<120〉一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法及其專用載體<130>42<160>6<170>Patentlnversion3.2<210>1<211〉465<212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>psSOD基因mRNA全長(zhǎng)序列<400>1atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaatttt60gagcaggagtccgattcctcgcccaccaccatctcctgggagatctctaaccacgatgcc120gacgccaagcgtggcttccacatcacaccctttggtgacaataccaacggctgcacctct180gctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccga240cacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccata300aaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcatt360cacgccggcactgatgacctaggca鄉(xiāng)gtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaat420gctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa465<210>2<211>27<212〉DNA<213>Artificialsequence<220><223>pYESpsSODf正向引物<400>2atcaagcttatggtcaaagcagtttgc2721<210>3<211〉28<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220〉<223>pYESpsSODr反向引物<400>3acctctagattagttggcgacgccaatg28<210>4<211>26<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223〉引物ura2<400>4gaaggatccccatggagggcacagtt26<210>5<211>29<212>DNA<213〉A(chǔ)rtificialsequence<220><223>引物ura3<400>5gccaagcttgtgcacactcttcctttttc29<210>6<211〉700<212>DNA<213>Artificialsequence<220>〈223>URA3片段序列<400>6gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatt60tgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcat120cttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcc180cttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccaca240tcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccg300ggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaata360aagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattct420ccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcc480tttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccg540tgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaat600ttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttg660gcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg700權(quán)利要求1、一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，其特征在于包括如下步驟首先，超氧化物歧化酶基因插入釀酒酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處后，構(gòu)建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，通過限制性內(nèi)切酶NcoI和ApaLI雙酶切該表達(dá)載體，完全去除AmpicillinR抗生素篩選標(biāo)志，同時(shí)切去了URA3基因片段的部分片段；然后，將被酶切去除的URA3片段重新與含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體連接，得到含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)、URA3片段以及不含有AmpicillinR抗生素篩選標(biāo)志的食品級(jí)釀酒酵母表達(dá)載體即食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體；將改造好的釀酒酵母食品級(jí)表達(dá)載體導(dǎo)入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，其特征在于包括如下歩驟(1)將中國(guó)擬青霉Cu,Zn-SOD即psSOD基因mRNA全長(zhǎng)序列，進(jìn)行全基因合成，所述psSOD基因mRNA全長(zhǎng)序列如下Atggtcaaagcagtttgcgtccttcgcggcgactccaagatcaccgggatcgtcaattttgagcaggagtccgattcctcgccc3cc3ccatctcctggg3gatctct犯cc3cgatgccgacgcc^gcgtggcttcc3C3tc3C3Ccctttggtgacaataccaacggctgcacctctgctggcccgcactttaaccctcacggcaagactcacggcaacgtgaccgacgaaaaccgacacgttggcgacatgggcaacatcgagaccgattgcgacggcaactccaagggatccataaaggacaagctcatcaagctcattggcccccacagtgtcattggccgcaccgttgtcattcacgccggcactgatgacctaggcaagggtggcaacgacgagtcactcaagaccggcaatgctggcccccgtcctgcttgcggtgtcattggcgtcgccaactaa;(2)設(shè)計(jì)并合成一對(duì)基因特異引物pYESpsSODf正向引物和pYESpsSODr反向引物，其序列為如下pYESpsSODf:5，-ATCAAGCTTATGGTCAAAGCAGTTTGC-3，;pYESpsSODr:5，-ACCTCTAGATTAGTTGGCGACGCCAATG-3，;以步驟(1)得到的含psSOD基因片段的質(zhì)粒為模板，pYESpsSOD(f+r)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增psSOD，并使克隆的psSOD兩端分別加上了III和laI酶切位點(diǎn)；得到的基因片段psSOD與pMD18-T載體連接，命名為pMD18-T-psSOD質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序與上述mRNA全長(zhǎng)序列相符；(3)用限制性內(nèi)切酶III和1"I雙酶切釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT及上述pMD18-T-psSOD質(zhì)粒，分別得到雙酶切載體與目的基因純化液；將回收純化的雙酶切載體與目的基因純化液以T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到的重組載體命名為pYES-psSOD;(4)根據(jù)釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT載體的序列，設(shè)計(jì)上下游引物ura2和ura3，以擴(kuò)增載體28233513bp之間片段，并在片段的一端即載體第2823bp端引入^aLl酶切位點(diǎn)所述ura2:5，-GAAGGATCCCCATGGAGGGCACAGTT-3';所述ura3:5，-GCCAAGCTTGTGCACACTCTTCCTTTTTC-3，;以釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT質(zhì)粒為模板，ura2、ura3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段URA3后，將目的片段URA3與pMD18-T連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-ura，所述URA3片段序列如下Gtgcacactcttcctttttcaatgggtaataactgatataattaaattgaagctctaatttgtgagtttagtatacatgcatttacttataatacagttttttagttttgctggccgcatcttctcaaatatgcttcccagcctgcttttctgtaacgttcaccctctaccttagcatcccttccctttgcaaatagtcctcttccaacaataataatgtcagatcctgtagagaccacatcatccacggttctatactgttgacccaatgcgtctcccttgtcatctaaacccacaccgggtgtcataatcaaccaatcgtaaccttcatctcttccacccatgtctctttgagcaataaagccgataacaaaatctttgtcgctcttcgcaatgtcaacagtacccttagtatattctccagtagatagggagcccttgcatgacaattctgctaacatcaaaaggcctctaggttcctttgttacttcttctgccgcctgcttcaaaccgctaacaatacctgggcccaccacaccgtgtgcattcgtaatgtctgcccattctgctattctgtatacacccgcagagtactgcaatttgactgtattaccaatgtcagcaaattttctgtcttcgaagagtaaaaaattgtacttggcggataatgcctttagcggcttaactgtgccctccatgg;(5)將已經(jīng)構(gòu)建好的釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES-psSOD及pMD18-T-ura重組質(zhì)粒，用JpaLI和WcoI進(jìn)行雙酶切，分別回收純化pYES-psSOD的5103bp大片段及pMD18-T-ura的700bp片段；將回收純化的雙酶切pYES-psSOD載體的5103bp大片段與pMD18-T-ura的700bp片段以T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒命名為pYES-psSOD-F，即為食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體；(6)將上述的食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體pYES-psSOD-F導(dǎo)入釀酒酵母中，篩選獲得重組釀酒酵母，誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，其特征在于步驟(6)中，所述的釀酒酵母為wra3-7基因突變型的釀酒酵母。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，其特征在于步驟(6)中，所述將食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體導(dǎo)入釀酒酵母中的方法為氯化鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法或電激轉(zhuǎn)化法。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，其特征在于步驟(6)中，所述篩選獲得重組釀酒酵母的方法為涂布尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法，其特征在于步驟(6)中，所述誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)時(shí)需加入半乳糖，半乳糖誘導(dǎo)濃度為2%，誘導(dǎo)時(shí)間為4896小時(shí)。7、用于權(quán)利要求2所述的一種超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法的食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體，其特征在于所述食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體是含有超氧化物歧化酶基因、GAL1啟動(dòng)子和終止子序列、多克隆位點(diǎn)、URA3片段以及不含有Ampidllir^抗生素篩選標(biāo)志的釀酒酵母表達(dá)載體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于超氧化物歧化酶基因的食品級(jí)表達(dá)方法的食品級(jí)表達(dá)超氧化物歧化酶基因的專用載體，其特征在于所述超氧化物歧化酶基因位于釀酒酵母表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)的Hind111和XbaI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)之間。全文摘要本發(fā)明公開了一種超氧化物歧化酶基因食品級(jí)表達(dá)方法及其專用載體。該方法是構(gòu)建含有超氧化物歧化酶基因的釀酒酵母食品級(jí)表達(dá)載體，將構(gòu)建的釀酒酵母食品級(jí)表達(dá)載體導(dǎo)入釀酒酵母中，獲得重組釀酒酵母，誘導(dǎo)重組釀酒酵母使超氧化物歧化酶基因得到表達(dá)。本發(fā)明能直接表達(dá)出食品級(jí)的超氧化物歧化酶產(chǎn)物，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)SOD制備方法以及畢赤酵母和原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)方式的表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)復(fù)雜步驟純化后才能用于食品生產(chǎn)中的不足；本發(fā)明還具有原料生物體生長(zhǎng)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，提取成本低的優(yōu)點(diǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景和實(shí)際意義。文檔編號(hào)C12N15/53GK101255436SQ200810025998公開日2008年9月3日申請(qǐng)日期2008年1月24日優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日發(fā)明者張文慶,朱倩婷,趙士煒,黃曉峰申請(qǐng)人:中山大學(xué)