Thermoleophilum minutum生產(chǎn)耐熱超氧化物歧化酶(SOD)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]利用Thermoleophilum minutum生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用菌株Thermoleophilum minutum保藏號為ATCC35268，通過液態(tài)發(fā)酵獲得耐高溫SOD。
【背景技術(shù)】
[0002]超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷的能力。近年來，它已經(jīng)成為治療炎癥、腫瘤和自身免疫疾病的新型抗炎藥物；化妝品和食品行業(yè)中用于防曬、防皮膚衰老和抗炎的添加劑以及用于某些疾病探針的生化試劑。SOD廣泛存在于動物、植物、所有好氧微生物及少數(shù)厭氧微生物體內(nèi)。當(dāng)前，SOD主要從動物血液(如豬血或者牛血)中提取(袁燁.超氧化物歧化酶的制備方法[P].申請?zhí)枺?2147888.0, 2002-12-19 ;徐文中，閻家麒.超氧化物歧化酶大規(guī)模生產(chǎn)新工藝[P].申請?zhí)枺?1144922.5，2001-12-24)，產(chǎn)量受到很大限制，且容易受到原料來源、安全性及質(zhì)量不穩(wěn)定等因素的影響。由于動物、植物特別是動物血液來源困難，而微生物可以人工培養(yǎng)，有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)目前報(bào)道，已經(jīng)可以通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)S0D，但主要為胞內(nèi)酶(刁治民，姚銀霞，張文靜.酵母菌SOD發(fā)酵條件的研宄[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，4:48-51 ;楊明琰，郭愛蓮，沈儉，等.高產(chǎn)SOD酵母菌的誘變選育及發(fā)酵條件研宄[J].食品科學(xué)，2005，26(10): 147-150)，提取工藝較為繁瑣。
[0003]天然SOD熱穩(wěn)定性較差，在加工和使用過程中容易受熱失活。如何有效地解決SOD在高溫工藝條件下酶活力的穩(wěn)定問題，如何使含SOD的產(chǎn)品在生產(chǎn)工藝流程中不用顧忌高溫是高效利用SOD的關(guān)鍵。利用生物工程生產(chǎn)新一代高穩(wěn)定性、高耐熱性的SOD是當(dāng)前SOD開發(fā)最重要的途徑。
[0004]本發(fā)明米用Thermoleophilum minutum 生產(chǎn) SOD，Thermoleophilum minutum是一種耐熱菌，可以產(chǎn)生耐高溫的S0D，采用該菌發(fā)酵生產(chǎn)SOD具有發(fā)酵周期短，發(fā)酵液中SOD活力較高，且能耐高溫，開發(fā)前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]目前能夠產(chǎn)生SOD的菌株比較少，主要為一些酵母，且為胞內(nèi)酶，需要破壁后才能提取分離，操作成本高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)制備。本發(fā)明的目的是針對當(dāng)前問題，利用菌株Thermoleophilum minutum保藏號為ATCC 35268，通過液態(tài)發(fā)酵獲得胞外耐熱S0D。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l, K2HP04l-4g/l, MgS047H200.1-0.5g/l，NaCl l_2g/l。在一定體積的發(fā)酵罐內(nèi)裝入發(fā)酵體積60-70% (v/v)的培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入Thermoleophilum minutum，接種量為1-10 %，起始pH和發(fā)酵過程pH均為自然，發(fā)酵溫度為20-45°C，發(fā)酵周期為2_6天。最終發(fā)酵液中SOD活力最高可達(dá)1500U/ml。
[0007]本發(fā)明所有種子培養(yǎng)基配方與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。將斜面菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶后，種子的培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，種子的培養(yǎng)溫度為45°C。
[0008]菌種保存用斜面培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20g/l，MgS047H20 0.2g/l，酵母膏g/1，瓊脂20g/l，pH自然。
[0009]SOD活的測定方法是基于SOD抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的還原作用。SOD活力測定方法和 SOD 活力定義詳見:Chin_Wen Lin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su, Theextract1n and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-ffenLin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997，46(3):303-312.
[0010]本發(fā)明有如下特征:
[0011](I)Thermoleophilum minutum用于SOD發(fā)酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH4) 2S04、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米漿、黃豆餅粉。
[0012](2) Thermoleophilum minutum發(fā)酵SOD采用的發(fā)酵罐體積為5-50L。攪拌轉(zhuǎn)速為70-150r/min，通風(fēng)量1:0.1-1:0.5v/v/m。結(jié)合本領(lǐng)域的基本常識可根據(jù)生產(chǎn)情況調(diào)整發(fā)酵罐大小。
[0013]本發(fā)明的有益效果:首次采用Thermoleophilum minutum進(jìn)行了 SOD的發(fā)酵，不僅酶活高，而且生產(chǎn)的SOD具有良好的耐熱效果，該方法適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)耐熱S0D，不僅解決當(dāng)前SOD不耐熱的缺點(diǎn)，而且提供了大量的SOD來源。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1
[0015]將斜面菌種接種到裝有50ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏 10g/l，蛋白胨 10g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉 12g/l，pH 自然。55°C，發(fā)酵 72小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，將50ml發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/min離心，去除菌體。上清粗酶液用于測定酶的PH及溫度參數(shù)。取上清粗酶液0.5ml，分別置于pH 4，5，6，7，8的檸檬酸一磷酸緩沖液
3.5ml中，在55°C下測定SOD活力分別為600，1500，1000，600，300U/ml。因此該SOD的最適反應(yīng)pH是5。分別取上清粗酶液0.5ml,與3.5ml pH 5的檸檬酸一磷酸鹽緩沖液混合，在25，35，45，55，65°C下分別測得酶活為400，700，1200，1500，1200U/ml，因此該酶的最適溫度為55°C。分別取上清粗酶液0.5ml，與3.5ml pH 5的檸檬酸一磷酸鹽緩沖液混合，在25，35，45，55，65，75°C 下保溫 48 小時(shí)，然后測定酶活分別為 1500，1500，1500，1500，1200，1200U/ml，結(jié)果表明該酶具有良好的耐熱性。不同pH的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液的配制方法參見:諸葛健，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊，中國輕工業(yè)出版社，1994。
[0016]實(shí)施例2
[0017]將斜面菌種接種到裝有50ml的種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，種子培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉12g/l，pH自然，121滅菌20min，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，45°C下培養(yǎng)48小時(shí)。該過程有10個(gè)相同的三角瓶，共得到500ml種子液。
[0018]將500ml種子液接種入50L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨3g/l，NH4NO31g/!，玉米漿粉6g/l，pH自然，發(fā)酵溫度為45°C，裝液量70%，通風(fēng)量為1:1.5v/v/mo發(fā)酵時(shí)間為3天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為1200U/ml。
[0019]實(shí)施例3
[0020]將培養(yǎng)好的IL種子液接種到1L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:果糖30g/l，牛肉膏 10g/l，玉米漿粉 20g/l，K2HP044g/l，MgS047H20.5g/l，pH 自然。發(fā)酵溫度為20°C，裝液量70%，通風(fēng)量為1:0.3v/v/m,發(fā)酵時(shí)間為5天，在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為l500U/ml。
[0021]實(shí)施例4
[0022]將培養(yǎng)好的2L種子液接種到20L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:乳糖20g/1，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。接種量為10%，培養(yǎng)溫度為45°C，裝液量60%，通風(fēng)量為1:0.5v/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵時(shí)間為6天，在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為1100U/mlo
[0023]實(shí)施例5
[0024]將培養(yǎng)好的300ml種子液接種到5L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:蔗糖20g/l，NH4NO31g/!，蛋白胨10g/l，pH自然。發(fā)酵溫度為40°C，裝液量65 %，通風(fēng)量為1:0.lv/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為70r/min，發(fā)酵周期為3天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為950U/mlo
[0025]實(shí)施例6
[0026]將培養(yǎng)好的3.5L種子液接種到50L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:麥芽糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，黃豆餅粉5g/l，pH自然，發(fā)酵溫度為28°C，裝液量70%，通風(fēng)量為1:0.4v/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，發(fā)酵周期為5天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為750U/ml。
[0027]實(shí)施例7
[0028]將培養(yǎng)好的600ml種子液接種到1L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:半乳糖15g/l，酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l，尿素5g/l，pH自然。發(fā)酵溫度為30°C，裝液量60%，通風(fēng)量為1:0.3v/v/m，攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min，發(fā)酵時(shí)間為4天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD 活力為 1050U/ml。
[0029]實(shí)施例8
[0030]將培養(yǎng)好的250ml種子液接種到5L發(fā)酵罐中。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成均為:木糖10g/l，酵母膏 5g/l，NaCl lg/1，K2HP04lg/l，MgS047H200.lg/1, pH 自然。發(fā)酵溫度為 45°C，裝液量50%，通風(fēng)量為1: 1.2v/v/m,發(fā)酵時(shí)間為2天。在該條件下，發(fā)酵液中最終SOD活力為 450U/mlο
【主權(quán)項(xiàng)】
1.本發(fā)明利用Thermoleophilumminutum通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)耐熱的超氧化物歧化酶(SOD)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Thermoleophilumminutum，其特征在于可利用的產(chǎn)SOD的碳源為葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、乳清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Thermoleophilumminutum，其特征在于可利用的產(chǎn)SOD的氮源為無機(jī)銨鹽、無機(jī)硝酸鹽、蛋白胨、酵母膏、尿素、玉米漿、豆餅粉。
【專利摘要】利用Thermoleophilum minutum生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用Thermoleophilum minutum在液態(tài)發(fā)酵條件下生產(chǎn)SOD，為胞外酶。耐熱SOD產(chǎn)量最高可達(dá)1500U/ml，本發(fā)明具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12R1-01, C12N9-02
【公開號】CN104694509
【申請?zhí)枴緾N201510071046
【發(fā)明人】丁彥蕊, 牟兆琳, 饒榕, 王雪芹
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年2月10日