專利名稱：結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)'的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其吸收 光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍(lán)蛋白
(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍(lán)蛋白
(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含apha和beta亞基，每個(gè)亞基中 藻膽色素(phycobiin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸 殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽 色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約 580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的 可見光，發(fā)射約640nm的焚光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660~670nm的 熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié) 合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為 藻藍(lán)膽素(phycocyanobUin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671 )。與前人的方法不同，我 們發(fā)現(xiàn)Z"aZwe"。 sp. PCC7120中基因編碼betal55裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源 的betal55裂合酶。這類betal55裂合酶不僅能催化藻藍(lán)膽素PCB與PEC的beta亞基及其同 源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)，還能催化藻紅膽素PEB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基
(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成一種新型的結(jié)合了PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。 藻紅膽素PEB可由HOl、 PebA、 PebB協(xié)同催化生成(Alvey，R.M.,Karty,J.A.etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)，
2448-2463 (2003))。在絕大部分的藍(lán)藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏 PE而具有異形胞的藍(lán)藻中存在PEC;隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基因。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的藻 膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍(lán)藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723， 2002.04.17。 一種水華藍(lán)藻制備藻藍(lán)蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用 藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)新型的藻紅藍(lán)蛋白。藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)具 有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，這種結(jié)合PEB的新型藻紅藍(lán)蛋白，為開發(fā)新型炎光探針提供了更多的選 擇。本方法為藻紅藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域 奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，它 是應(yīng)用betal55裂合酶催化PEB與藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備新型藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)(天然狀態(tài)下藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白是與PCB結(jié)合)。將含有betal55裂 合酶基因、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌， 得到相應(yīng)的工程菌，通過如此設(shè)計(jì)的基因工程菌生產(chǎn)新型藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法， 包括下述歩驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到 betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá) 載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因/w/和pe力5或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到力o/和peZ^表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到表達(dá)質(zhì)粒；
(5) 將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o7和pe6A表達(dá)質(zhì)粒和pe^ 表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng) 用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì) 提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案也可以是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制
備方法，包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白 基因或其同源基因同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o/和pe/^或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到力W和/ eM表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe/W或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到/ e力/f表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力o7和pe/^表達(dá)質(zhì)粒和 表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng) 用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì) 提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的宿主菌為大腸桿菌； 所述的betal55裂合酶基因是指與//朋6a6v a sp. PCC7120中s^^^P基因同源的基因；所述 的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與如a6ae朋sp. PCC7120或7a/w770s"s sp. PCC7603 中pe"基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)-
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì)類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型藻紅藍(lán)蛋白，具有與天然藻紅藍(lán)蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒 光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。


圖1為本發(fā)明中A115339催化下生成的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的吸收與熒 光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。 實(shí)施例1
(1)從GeneBank中可以査到，藻種Z朋6ae/7a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， # 7柳i/70S〃s sp. PCC7603和Ca7"/ r/;r sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/l"atee朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(拜A s〃5息/(/. 7認(rèn)V o， sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec^); Ca7ot力rix sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工程方法，將/f朋tee朋 sp.PCC7120中的a^5, 朋基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-3W5JW，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將力朋力se朋sp. PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-/7ecA在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán) 蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o/-pe65，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe/vl，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^在pET30中是在5boRV和/力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 3L^3J9在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^ II和I之間；PEB合成酶基因是3 個(gè)(力o厶pe/W和/ ei^)， Zw7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，/w/在第一個(gè)多克隆位 點(diǎn)/Vco I和/^t I之間，peiW在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和/力o I之間，peM在pACYCDuet-l 中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《WII和Wol之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-ai75M久pET30-pec5、 pCDFDuet-/ o卜/ eZ^和pACYCDuet-peM轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODw,n為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破
6碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。其吸收與熒光光譜見圖1所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為 熒光光譜。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜；取100|aL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)至0Dfi(,。=0. 3~ 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4'C)棄去 上清，收集沉淀菌體；用lmL預(yù)冷的O. lmol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (10000g, 4°C) 去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好 的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42r熱休克90s，冰浴5min后加入300jiL LB培養(yǎng)基，37°C 低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37'C培養(yǎng)箱至 形成可見的單克隆菌斑。
提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37'C振蕩培養(yǎng)至0DTO=0. 5-0. 7時(shí)， 冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、2CTC、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離心收集細(xì) 胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行大量表 達(dá)。
實(shí)施例2
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/l"a6ae/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 傲7柳jV os"s sp. PCC7603和Ca7ot/ ri'xsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/!/736犯朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(/ eM、 a275"息力o/); 脫7細(xì)-膨"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(; ec5); Ca7ot力r/, sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和pe65)。通過基因工程方法，將力/ a力ae/ 3 sp. PCC7120中的a775"JJ9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a775JJ見在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將力/7ste6v s sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5(C84A)克隆于 Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-pecZ (C84A)，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; eM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^(C84A)在pET30中是在fcoRV和J/w I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合 酶基因a"53J9在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和/力o I之間；PEB合成酶基 因是3個(gè)(力o厶/ e^和pe65)，力o7和pe幼在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，/ W在第一個(gè)多 克隆位點(diǎn)/VcoI禾B Atl之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)/Votel禾Q Wol之間，/ e^在 pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)勘7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aWMJA pET30-pec^(C84A) 、 pCDFDuet-/ o7-peZ^和pACYCDuet-pe6力 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l ol/L， 2(TC至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞， 加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例3
(1)從GeneBank中可以査到，藻種/1/7a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， #. 7柳i/7os""5" sp. PCC7603和Ca^t/ r/,sp. PCC7601部分序列己經(jīng)測定。力朋tee朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為隨0019'可從所査到序列中找到所需基因(pec5、 a775息力o7); 必7編V o雄sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(pec^); CWot/ ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將力ra6ae/7asp. PCC7120中的a775JJ9基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec^克隆于Novagen公司的 pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-/ ec^"S^M教在大腸桿菌中能表達(dá)藻紅藍(lán)蛋白類脫輔 基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-pe6i9，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/7eW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^和裂合酶基因a^5^M在pETDuet-1中，pec^處于第一個(gè)多克 隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是化dU和At I ， a"5^39處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)免^n和/力oI之間； PEB合成酶基因是3個(gè)(/ 。/、 peM和pe6《)，/;oi和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o/ 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vco I和尸W I之間，/ e^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和J/ o I之間，pe6/1 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)餘7II和// oI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec^a775"M久pCDFDuet-力o卜/ e/by9和pACYCDuet-; e力/1轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基 中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例4
(1)從GeneBank中可以査到，藻種/I朋tee朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成,7a肌'/7os〃ssp. PCC7603和Ca7ot/ 門'xsp. PCC7601部分序列己經(jīng)測定。/I朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因a"5，、力o"; yK7層'/7。，sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(y! eM); Ca7otArj> sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。通過基因工程方法，將^(朋Z^e/7a sp. PCC7120中的a775J朋基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5 (C84A)克隆于Novagen 公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecS (C84A) -a^5^J^，在大腸桿菌中能表達(dá)藻 紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-Pe6/I，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因； ec5 (C84A)和裂合酶基因a77^M在pETDuet-1中，pec^處于第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是￡boR I和/^t I ， aW5M9處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g/II和Wo I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力。厶/ e歸力o/和; eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l 中，力o/在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vco I和尸W I之間，/7e65在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和J/w I 之間，/ e^在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和Z/w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec" (C84A) -a"MW、 pCDFDuet-力o7-pe6S和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-[3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種/1/ a&era sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， #. 7a/7;i/70S"s sp. PCC7603禾。Ca7otAr/xsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/f朋6se朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(/ ec5、 W75JJ義力o7): 脫7柳i/7o愿sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pecZ ); Ca7ot/ /^ sp.PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將Z朋6ae朋 sp. PCC7120中的sL 5JW基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-W75JJ義在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將/l朋&e/7a sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^5克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-pecA在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基 蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o7-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫p八CYCDuet-peZvl，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^在pCOLADuet-l第一個(gè)多克隆位點(diǎn)^coR I和Pst I兩個(gè)酶切位點(diǎn) 之間；裂合酶基因a775^J9在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《《/II和X力o I之間 PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peW和peM)，力o/和pe65在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o/ 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)〃co I和尸"I之間，pe/^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和J力o I之間，/7e6/J 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^HI和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
11T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-s^5JJ久pCOLADuet-pecA pCDFDuet-力W-/ e/^和pACYCDuet—peM轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD,為0.5至0.8,加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞， 加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例6
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力/ atee朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7柳i"o幼ssp. PCC7603和Cs7"力r"sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/^a6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(/^、 aU脫力W);
柳i'/ os〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(pec^): Ca7oWri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和pe/ 5)。通過基因工程方法，將/)朋6ae朋 sp. PCC7120中的sWMW基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a775^J義在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將/1/7s&e朋sp. PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5(C84A)克隆于 Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-/ ec^(C84A),在大腸桿菌 中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o/-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-Pe/M，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec5(C84A)在pCOLADuet-1第一個(gè)多克隆位點(diǎn)J coR I和I兩個(gè)酶 切位點(diǎn)之間；裂合酶基因aW5^^在pETDuet-1中的第二個(gè)多克隆位點(diǎn)處/II和Wol之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶pe6/f禾Qpe65)，力o/和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o/ 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)〃co I和/^t I之間，/ eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和Wo I之間，peM 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)化7II和J/w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別
帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aWMW 、 pC0LADuet-pec5(C84A) 、 pCDFDuet-力o7-pe6Z 禾口 pACYCDuet-peM轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D^為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-J3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌 體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N廣親和層析，可提純得到相應(yīng) 的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例7
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， # sp. PCC7603和Ca7o^r/義sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/4朋力ae/ ssp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(，A、 a/"息力o/); y(/.7細(xì)./7。愿sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec5); Ca7ot/ /7> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(/ e^和peM)。通過基因工程方法，將力/7a力se/7s sp. PCC7120中的a775JJ^基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-W75^J"在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將脫7aw7josiAS sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec^克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-pecA在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同吋表達(dá)H0和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-PeW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec5在pET30中是在fcoRV和A7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因 a775"9在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)餘7II和/力o1之間；PEB合成酶基因是3 個(gè)(力o厶peM和peZ^),力o/和/^力萬在同一個(gè)載體pCDFDLiet-l中，力o/在第一個(gè)多克隆位 點(diǎn)Abo I和I之間，pe65在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)/We I和/力o I之間，在pACYCDuet-l 中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^71I和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-aL/5M義pET30-pec厭pCDFDuet-力o/-pe65和pACYCDuet-pe6/1轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0DM。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-13-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1陽1/L， 2(TC至37"C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例8
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ atee朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7柳y"o幼s sp. PCC7603和&"t/ rj> sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。如a6ae"a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pecZ 、 a"5紙
7a/MVjost^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec5): Ca7ot力h;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將^7a6ae"a
14sp. PCC7120中的s775JJ9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a^MW，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將脫7a肌'/70s"s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pe乙v (C84A)克隆 于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-pec^(C84A)，在大腸桿菌中能表達(dá) 脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o/-/ eZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW,在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec爪C84A)在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合 酶基因s77MW在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^71I和/力oI之間；PEB合成酶基 因是3個(gè)(/ o/、 peZvf和；;e6Z )，力W和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力W在第一個(gè)多 克隆位點(diǎn)〃coI和尸"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/el和A7 oI之間，peM在 pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)處7II和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5) 將pETDuet-a7753J義pET30-peCi9(C84A) 、 口00「0^1:-/70/-/ "/ 和pACYCDuet—/ eZ /J 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 2(TC至37'C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞， 加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
15實(shí)施例9
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種Z/7atee朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， Ja瓜/; a9w sp. PCC7603和Ca7"力r"sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/I朋6ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(第S、 a"5纖力o7);
7層'雄""p. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(;jec5); CaA^力ri;f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工程方法，將^a6se朋 sp. PCC7120中的3"5.".9基因和必h/wVms〃s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因pecS克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-/ ec/9-aWMW，在大腸 桿菌中能表達(dá)藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o/-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因/;ec5和裂合酶基因s775JJ9在pETDuet-l中，/ ec^處于第一個(gè)多克 隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoR I和P" I ， a"M朋處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)S^HI和/力o I之間； PEB合成酶基因是3個(gè)PeM和pe亂Z oJ和pe^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中,力" 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)tVco I禾n I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vc/e I和/力o I之間，peM 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)處7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec^"aW5M9、 pCDFDuet-/ W-peM 和pACYCDuet-peM轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基 中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí), 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B:離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例10
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋&e朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7a啦'〃^〃s sp. PCC7603和CsJot/ /v>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力朋tee/ a sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(pec5、 a775J脫力o/); 必7層V 。，sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254，可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec^); Ca7otAri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和wM)。通過基因工程方法，將/1/7a6ae朋 sp. PCC7120中的a77MJ9基因和M 7柳/z7os"s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基 因pec5 (C84A)克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pecS (C84A) -37/^^9，在大腸桿菌中能表達(dá)藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和/ eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^ (C84A)和裂合酶基因a^5J^在pETDuet-l中，pec^處于第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是I和At I ， W75J，效處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)/5^/1I和/力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o人peM和peM)， Zw7和/ eZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1 中，力o/在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Abo I和Z5" I之間，/ eM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J/w I 之間，pe6/1在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和A7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-pec" (C84A) -aWMJA pCDFDuet-力o/-/ e/^和pACYCDuet-/ e/M轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-{5-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破 碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni'2'親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 7s/77//7as">9 sp. PCC7603禾卩Ca7"力W,sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/J朋tee朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec5、 s775息Z o7); # h則'/;asi^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec)9); Ca"t/ r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過基因工程方法，將/J朋6ae朋 sp. PCC7120中的a77MJ9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a775^^義在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將#. 7a/w'/7os"ssp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因/7ec^克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-pecA在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基 蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/ A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所捐 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pe"在pC0LADuet-1第一個(gè)多克隆位點(diǎn)￡coR I和Pst I兩個(gè)酶切位g 之間；裂合酶基因aL/5J^在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^71I和A77oI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(y oA peM和pe6S)，力oJ和pe65在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vco I和戶W I之間，pe6yS在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J力o I之間，pe^ 在pACYCDuet-l中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)處7II和//w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DN八作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-a775JJ久pC0LADuet-/ e^、 pCDFDuet-Zw卜/ e/^和pACYCDuet-peM轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8,加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B:離心收集菌體細(xì)胞， 加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例12
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， y(/. 7柳j'/ osiAS sp. PCC7603和Ca7"/ r"sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。/J/ a6se/7s sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(拜A a〃5息副; 脫7柳j./70馬印.PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為:M34254.可從所査到序 列中找到所需基因(peci ); Ca7ot力Wx sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pW5)。通過基因工程方法，將力朋6ae/7a sp. PCC7120中的sW5"9基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a775JM，在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將抓7a則'/7os"s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^(C8M)克隆 于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-/ ec^(C8AA)，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W禾口 一Z0克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w/-/ eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(;^Zvl)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即脫輔基蛋白基因pec饑C84A)在pCOLADuet-1第一個(gè)多克隆位點(diǎn)AcoR I和Pst I兩個(gè)酶 切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a7J5^59在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《g"/II和J/w I 之間PEB合成酶基因是3個(gè)(AW、 peM和pe65)， / o7和pe6y 在同一個(gè)載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和/^t I之間，peZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和Wo I 之間，pe6/J在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和/力o I之間。
基因插入載體的歩驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-a^5^^^ 、 pC0LADuet-pecS(C84A) 、 pCDFDuet-Zw卜peZ^和 pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20'C至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌 體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng) 的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的betal55裂合酶、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白、藻 紅膽素生物合成酶基因或其同源基因來制備藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種 公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍(lán)藻^ a6ae朋sp. PCC7120和已經(jīng) 部分測序的必^肌'/ o犯ssp. PCC7603和CsA t力ri,sp. PCC7601為例對(duì)本發(fā)明方法加以說明， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
20
權(quán)利要求
1. 一種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta155裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法，將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pebA表達(dá)質(zhì)粒；(5)將beta155裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒和pebA表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. —種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白 基因或其同源基因同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o/和pe/^或其同源基因克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中，得到/ o/和pe^表達(dá)質(zhì)粒；G)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個(gè)表 達(dá)載體中，得到peM表達(dá)質(zhì)粒；(4)將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力W和peM表達(dá)質(zhì)粒和peM 表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng) 用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì) 提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的betal55裂合酶基因是指與 /!朋6ae朋sp. PCC7120中a7J5^J9基因同源的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因 是指與/!/^tee/7a sp. PCC7120或〗柳i/70s"s sp. PCC7603中pec^基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，是通過應(yīng)用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻紅膽素與藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備結(jié)合PEB的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號(hào)C12N15/60GK101481701SQ200810025758
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司