專利名稱：：新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε－己內(nèi)酯)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到一種利用超嗜熱酯酶為催化劑合成聚(ε-己內(nèi)酯)的方法，屬高分子化學(xué)與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：聚(ε-己內(nèi)酯)是一種具有良好生物相容性和生物降解性的合成聚酯，作為生物醫(yī)用材料在藥物控制釋放系統(tǒng)、骨修復(fù)及組織工程等方面有著廣泛的研究和應(yīng)用。此外，聚(ε-己內(nèi)酯)與大多數(shù)傳統(tǒng)熱塑性材料具有良好的相容性而且熔融狀態(tài)下粘度較低，因而廣泛用于塑料加工、熱塑性膠粘劑、制模等。低分子量聚(ε-己內(nèi)酯)被廣泛用作合成聚氨酯的軟段部分及藥物載體。目前，聚(ε-己內(nèi)酯)的合成主要是通過金屬催化劑，如異辛酸亞錫、異丙醇鋁等，在本體或溶液條件下催化開環(huán)聚合反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。但是，苛刻的反應(yīng)條件(高溫、高壓等)、較長的反應(yīng)時(shí)間(多達(dá)幾十小時(shí))及復(fù)雜的后處理過程(耗能、費(fèi)時(shí)及大量的溶劑消耗)給生產(chǎn)帶來了困難。同時(shí)，重金屬催化劑的痕量殘留和潛在毒性限制了其在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。近年來，酶促聚合由于反應(yīng)條件溫和、無毒、立體選擇性和區(qū)位選擇性高、催化效率高的優(yōu)點(diǎn)在聚(ε-己內(nèi)酯)的合成方面發(fā)揮著重要的作用。1993年，Knani和Kobayashi最先報(bào)道了利用酶促開環(huán)聚合反應(yīng)來合成聚(ε-己內(nèi)酯)，產(chǎn)物分子量達(dá)到7700。目前，多種市售脂肪酶，如豬胰脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶、熒光假單孢菌脂肪酶等都被用來催化ε-己內(nèi)酯的聚合反應(yīng)。然而，超嗜熱酯酶催化的ε-己內(nèi)酯聚合反應(yīng)尚未見報(bào)道。酯酶(Esterase，EC3.1.1.1)是一類廣泛分布于組織和器官的絲氨酸水解酶類，能水解許多含有酯鍵、硫酯鍵、酰胺鍵的內(nèi)源性及外源性物質(zhì)。其主要功能是參與脂質(zhì)代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及維持生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，還可以在有機(jī)相中完成轉(zhuǎn)酯、酯化及酯交換等眾多反應(yīng)。近年來，人們從海底熱流的嗜熱性古菌中分離得到了超嗜熱酯酶，為現(xiàn)代酶工程技術(shù)展現(xiàn)了新的應(yīng)用前景。超嗜熱酯酶不僅克服了化學(xué)催化劑催化效率低、專一性差的劣勢，而且與中溫酶相比，具有很高的穩(wěn)定性。這將極大地促進(jìn)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，從而帶動(dòng)技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高。利用超嗜熱酯酶作為生物催化劑有如下優(yōu)點(diǎn)(1)酶制劑制備成本降低。酶的穩(wěn)定性較高，可以進(jìn)行室溫下的分離純化和包裝運(yùn)輸。(2)反應(yīng)速率加快。隨著反應(yīng)溫度的提高，酶催化能力增強(qiáng)。(3)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低，能耗降低。(4)產(chǎn)物純度提高。在催化條件下，很少有雜菌生存，從而減少了細(xì)菌代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染。由于超嗜熱酯酶的高溫反應(yīng)活性，以及對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，它在食品、醫(yī)藥、制革、功能材料、石油開采及廢物處理等方面都有廣泛的應(yīng)用潛力。
發(fā)明內(nèi)容超嗜熱古菌Archaeoglobusfulgidus是生長于火山口、油田沉積物及熱泉中的一類嗜熱微生物，最適生長溫度為83℃。該菌是一種已知菌種，保存于德國微生物菌種保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenZellkulturen，DSMZ，www.dsmz.de)，保存編號(hào)為DSM4304。1997年，Klenk報(bào)道了該超嗜熱古菌的基因組序列(Thecompletegenomesequenceofthehyperthermophilic，sulphate-reducingarchaeonArchaeoglobusfulgidus.Nature1997；390364-370)。文獻(xiàn)(Stress-inducedproductionofbiofilminthehyperthermophileArchaeoglobusfulgidus.AppliedandEnvironmentalMicrobiology1997；633158-3163)詳細(xì)描述了該菌生長狀況等特性。本領(lǐng)域的任何研究人員都可以通過文獻(xiàn)充分了解Archaeoglobusfulgidus菌種，因?yàn)樵摼N已經(jīng)是一種公認(rèn)產(chǎn)品，且任何人都可以以商品的形式從德國微生物菌種保藏中心購得。2000年，Manco利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerizationchainreaction，PCR)技術(shù)從Archaeoglobusfulgidus基因組中釣取了超嗜熱酯酶AFEST的基因AF1716，利用pT7-SCII為表達(dá)載體，將重組質(zhì)?？寺〉酱竽c桿菌BL21中，得到一株工程菌(Cloning，overexpression，andpropertiesofanewthermophilicandthermostableesterasewithsequencesimilaritytohormone-sensitivelipasesubfamilyfromthearchaeonArchaeoglobusfulgidus.ArchivesofBiochemistryandBiophysics2000；373182-192)。該工程菌不僅培養(yǎng)條件簡單，而且能夠快速繁殖并高效表達(dá)超嗜熱酯酶AFEST。該文獻(xiàn)詳細(xì)地介紹了超嗜熱酯酶AFEST基因的釣取、所用的載體及工程菌構(gòu)建的方法。本領(lǐng)域的任何人員都可以通過該文獻(xiàn)充分了解該工程菌的構(gòu)建與特性，并利用相同或相應(yīng)的技術(shù)從Archaeoglobusfulgidus基因組中釣取超嗜酯酶AFEST的基因并進(jìn)行工程菌的構(gòu)建。本發(fā)明的目的在于利用超嗜熱酯酶工程菌發(fā)酵、純化制備的酶制劑為催化劑，在非水介質(zhì)中催化聚合ε-己內(nèi)酯，建立一種不用金屬催化劑、條件溫和的聚(ε-己內(nèi)酯)的合成及后處理工藝。本發(fā)明的主要內(nèi)容包括超嗜熱酯酶制劑的制備及聚(ε-己內(nèi)酯)的合成與后處理。新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其是在常壓條件下，將單體ε-己內(nèi)酯與有機(jī)溶劑混合，加入酶制劑催化反應(yīng)，反應(yīng)物經(jīng)分離純化可得到產(chǎn)物聚(ε-己內(nèi)酯)。所選用的酶制劑為來源于超嗜熱古菌Archaeoglobusfulgidus的超嗜熱酯酶AFEST。超嗜熱酯酶AFEST由超嗜熱酯酶工程菌經(jīng)發(fā)酵、純化制備，超嗜熱酯酶工程菌的培養(yǎng)基為1～2％酵母粉，1.5～2.0％蛋白胨，0.5～1.0％氯化鈉，pH為7.0～7.5，115～121℃下滅菌15～20min；種子液逐級(jí)放大，接種量為1～2％，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)物的生長濁度在OD600達(dá)到1.5～2.0；然后，加入異丙基-β-D-硫代吡喃葡糖苷誘導(dǎo)，終濃度為1mM，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～4h；將發(fā)酵液5000～8000r/min離心20～30min收集菌體；菌體于零下20℃～零下40℃與室溫下反復(fù)凍融2～3次，按照1∶6～8(w/v)加入50mmol/L磷酸緩沖液，pH值8.0，混合均勻后超聲破碎20～30min；細(xì)胞破碎液于80～90℃中保溫20～30min，以變性沉淀大腸桿菌雜蛋白；冷卻后，7000～8000r/min離心15～20min后收集上清，得到粗酶液；粗酶液經(jīng)過20kD膜包進(jìn)行超濾，超濾后液體進(jìn)行凍干，得到超嗜熱酯酶AFEST制劑。有機(jī)溶劑為甲苯、正己烷或環(huán)己烷。有機(jī)溶劑與ε-己內(nèi)酯的體積比為2.0～5.0∶1。超嗜熱酯酶制劑AFEST與ε-己內(nèi)酯的質(zhì)量比為1∶4～20。催化反應(yīng)是在封閉反應(yīng)體系內(nèi)，在60～100℃溫度下反應(yīng)24～120h。分離純化是在反應(yīng)體系中加入二氯甲烷，過濾除去酶，將濾液進(jìn)行真空濃縮去除有機(jī)溶劑，殘余物中加入冰冷甲醇，低溫下進(jìn)行沉淀，離心收集沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥得聚合產(chǎn)物。二氯甲烷與ε-己內(nèi)酯的體積比為25～50∶1。低溫沉淀溫度為零下20℃～零下40℃，真空干燥時(shí)間為16～24h。經(jīng)核磁共振(1HNMR)表征，產(chǎn)物具有聚(ε-己內(nèi)酯)的結(jié)構(gòu)(附圖1)。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)分析，數(shù)均分子量為1200～2300g/mol，多分散性1.1～1.5，可被廣泛用作聚氨酯的軟段部分及藥物載體。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明使用超嗜熱酯酶作為催化劑，由于建立了比較成熟的工程菌發(fā)酵和酶制劑的制備工藝，因而較大幅度地降低了生產(chǎn)成本；2.本發(fā)明采用具有高度熱穩(wěn)定性的超嗜熱酯酶為催化劑，在高溫條件進(jìn)行聚合反應(yīng)，極大地提高了反應(yīng)速率，縮短了生產(chǎn)周期，在降低成本的同時(shí)為生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大提供了有利條件；3.本發(fā)明采用的產(chǎn)物提取及后處理工藝，操作簡單，同時(shí)使用的有機(jī)溶劑容易回收和重復(fù)利用，在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，符合現(xiàn)在綠色化工的要求。圖1通過實(shí)施例2方法合成產(chǎn)物的1HNMR圖譜；如圖1所示，圖中，0ppm為內(nèi)標(biāo)物四甲基硅烷(TMS)甲基氫的分裂；7.28ppm為溶劑氘代氯仿(CDCl3)中殘留的氯仿(CHCl3)中氫的分裂峰。1.38ppm處的三重峰為c處兩個(gè)氫分裂產(chǎn)生的，1.65ppm處的多重峰是b和d處氫原子分裂的結(jié)果，2.31ppm處的三重峰為a處兩個(gè)氫分裂產(chǎn)生的，4.06ppm則是e處氫原子分裂的結(jié)果。此外，3.65處的一個(gè)小的三重峰為端基f上兩個(gè)氫原子的特征分裂峰。具體實(shí)施例方式下面給出的實(shí)施例子是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以便于本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明。但所給出的實(shí)施例不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，因而該專業(yè)的技術(shù)人員根據(jù)上述
發(fā)明內(nèi)容所做出的非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。實(shí)施例1超嗜熱酯酶制劑AFEST的制備超嗜熱酯酶工程菌的培養(yǎng)基如下1％酵母粉，1.6％蛋白胨，0.5％氯化鈉，pH為7.0，115℃下滅菌20min。種子液逐級(jí)放大，接種量為1％，培養(yǎng)體積為10升。37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)物的生長濁度在OD600達(dá)到1.8。然后，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度為1mM)，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3h。將發(fā)酵液5000r/min離心20min收集菌體。菌體于-20℃與室溫下反復(fù)凍融2次，按照1∶6(w/v)加入50mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)，混合均勻后超聲破碎20min。細(xì)胞破碎液于80℃中保溫30min，以變性沉淀大腸桿菌雜蛋白。冷卻后，8000r/min離心15min后收集上清，得到粗酶液。粗酶液經(jīng)過20kD膜包進(jìn)行超濾，超濾后液體進(jìn)行凍干，得到酶制劑AFEST。實(shí)施例2將200μL(215mg)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與600μL甲苯混合，加入20mg超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)72h后，用10mL二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為99.97％。濾液進(jìn)行真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃下沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為1768g/mol，多分散性為1.21。實(shí)施例3將200μL(215mg)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與600μL環(huán)己烷混合，加入20mg超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)72h后，用10mL二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為95.29％。濾液進(jìn)行真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為2238g/mol，多分散性為1.46。實(shí)施例4將200μL(215mg)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與600μL正己烷混合，加入20mg超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)72h后，用10mL二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為100％。濾液進(jìn)行真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為2073g/mol，多分散性為1.31。實(shí)施例5將200μL(215mg)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與600μL甲苯混合，加入20mg超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)60h后，用10mL二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為99.38％。濾液進(jìn)行真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為1268g/mol，多分散性為1.26。實(shí)施例6將200μL(215mg)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與600μL甲苯混合，加入30mg超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)72h后，用10mL二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為99.65％。濾液進(jìn)行真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為1262g/mol，多分散性為1.29。實(shí)施例7將5mL(5.38g)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與15mL甲苯混合，加入500mg超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)72h后，用250mL二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為100％。濾液進(jìn)行真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為1215g/mol，多分散性為1.19。實(shí)施例8將50mL(53.8g)ε-己內(nèi)酯(純度≥99％)與150mL甲苯混合，加入5g超嗜熱酯酶AFEST作催化劑，在80℃下振蕩反應(yīng)72h后，用2L二氯甲烷溶解產(chǎn)物，過濾除去酶，濾液經(jīng)氣相色譜(GC)測定單體轉(zhuǎn)化率為100％。濾液經(jīng)真空濃縮，殘余物中加入冰冷甲醇于零下20℃沉淀，8000r/min離心15min收集沉淀，減壓干燥16h得聚合產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)凝膠滲透色譜(GPC)測定，數(shù)均分子量為1355g/mol，多分散性為1.24。權(quán)利要求1.新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于在常壓條件下，將單體ε-己內(nèi)酯與有機(jī)溶劑混合，加入酶制劑催化反應(yīng)，反應(yīng)物經(jīng)分離純化可得到產(chǎn)物聚(ε-己內(nèi)酯)。2.如權(quán)利要求1所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于所選用的酶制劑為來源于超嗜熱古菌Archaeoglobusfulgidus的超嗜熱酯酶AFEST。3.如權(quán)利要求2所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于超嗜熱酯酶AFEST由超嗜熱酯酶工程菌經(jīng)發(fā)酵、純化制備，超嗜熱酯酶工程菌的培養(yǎng)基為1～2％酵母粉，1.5～2.0％蛋白胨，0.5～1.0％氯化鈉，pH為7.0～7.5，115～121℃下滅菌15～20min；種子液逐級(jí)放大，接種量為1～2％，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)物的生長濁度在OD600達(dá)到1.5～2.0；然后，加入異丙基-β-D-硫代吡喃葡糖苷誘導(dǎo)，終濃度為1mM，37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3～4h；將發(fā)酵液5000～8000r/min離心20～30min收集菌體；菌體于零下20℃～零下40℃與室溫下反復(fù)凍融2～3次，按照1∶6～8(w/v)加入50mmol/L磷酸緩沖液，pH值8.0，混合均勻后超聲破碎20～30min；細(xì)胞破碎液于80～90℃中保溫20～30min，以變性沉淀大腸桿菌雜蛋白；冷卻后，7000～8000r/min離心15～20min后收集上清，得到粗酶液；粗酶液經(jīng)過20kD膜包進(jìn)行超濾，超濾后液體進(jìn)行凍干，得到超嗜熱酯酶AFEST制劑。4.如權(quán)利要求1所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于有機(jī)溶劑為甲苯、正己烷或環(huán)己烷。5.如權(quán)利要求4所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于有機(jī)溶劑與ε-己內(nèi)酯的體積比為2.0～5.0∶1。6.如權(quán)利要求1所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于超嗜熱酯酶制劑AFEST與ε-己內(nèi)酯的質(zhì)量比為1∶4～20。7.如權(quán)利要求1所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于催化反應(yīng)是在封閉反應(yīng)體系內(nèi)，在60～100℃溫度下反應(yīng)24～120h。8.如權(quán)利要求1所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于分離純化是在反應(yīng)體系中加入二氯甲烷，過濾除去酶，將濾液進(jìn)行真空濃縮去除有機(jī)溶劑，殘余物中加入冰冷甲醇，低溫下進(jìn)行沉淀，離心收集沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥得聚合產(chǎn)物。9.如權(quán)利要求8所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于二氯甲烷與ε-己內(nèi)酯的體積比為25～50∶1。10.如權(quán)利要求8所述的新型超嗜熱酯酶催化制備聚(ε-己內(nèi)酯)，其特征在于低溫沉淀溫度為零下20℃～零下40℃，真空干燥時(shí)間為16～24h。全文摘要本發(fā)明涉及到一種利用超嗜熱酯酶為催化劑合成聚(ε－己內(nèi)酯)的方法，屬高分子化學(xué)與生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。是在常壓條件下，將單體ε－己內(nèi)酯與有機(jī)溶劑混合，加入酶制劑催化反應(yīng)，在60～100℃溫度下反應(yīng)24～120h，反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入二氯甲烷，過濾除去酶，將濾液進(jìn)行真空濃縮去除有機(jī)溶劑，殘余物中加入冰冷甲醇，低溫下進(jìn)行沉淀，離心收集沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥得聚合產(chǎn)物。所選用的酶制劑為來源于超嗜熱古菌Archaeoglobusfulgidus的超嗜熱酯酶AFEST。本發(fā)明克服了減壓、惰性氣體保護(hù)等苛刻的反應(yīng)條件，并以成熟的合成與后處理工藝實(shí)施，因而具有生產(chǎn)工藝簡單、安全、能耗低、產(chǎn)量高的特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N9/18GK101020740SQ20071005545公開日2007年8月22日申請(qǐng)日期2007年3月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日發(fā)明者馮雁,馬玖彤,李全順,宋搏申請(qǐng)人:吉林大學(xué)