專利名稱：植物葉際高溫菌的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物葉際高溫菌的篩選方法，屬于微生物技術領域。
背景技術：
高溫菌是一類能在45t:以上生長和繁殖的極端環(huán)境微生物，包括部分細菌、古菌
和真菌。其中，最適生長溫度在45°C 8(TC之間的高溫菌為中度嗜熱菌，最適生長溫度大
于8(TC的微生物為超溫菌(hyperthennophiles)，包括處于系統(tǒng)進化樹底部的部分細菌和
古菌。高溫菌的理論價值和應用價值越來越受到人們的重視，利用嗜熱菌產生的嗜熱酶作
為生物催化劑的研究較多。研究結果表明，從這些微生物中分離的酶具有一些優(yōu)良的生物
學性質，如熱穩(wěn)定性、以及對化學和物理變性劑、有機溶劑、極端PH等不利因素的抗性等。
這些性質不僅可作為設計和改造酶類的依據(jù)，而且在工業(yè)生產中極具應用價值。 植物的葉際是指植物的地上部分，包括葉、莖、花、果等的表面或內部的小環(huán)境，在
強烈的日照下，其表面溫度可以達到4(TC 55t:。在植物的葉際范圍內生活著多種微生
物，主要有細菌、真菌、放線菌等，這些在葉際生存的微生物稱為葉際微生物；它們對固定大
氣中的氮、保護葉片減輕凍害、剌激植物生長、防治植物病蟲害、降解農藥殘留等方面都有
重要的作用。 對葉際微生物的研究已有多年歷史，主要集中于植物病原微生物的研究，近年來 也有文獻報道了葉際微生物群落組成和各種環(huán)境因子對葉際微生物群落的影響。關于葉際 高溫微生物的研究還沒有文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種有效的篩選葉際高溫微生物的方法。
本發(fā)明所述的篩選葉際高溫微生物的方法如下
1、富集培養(yǎng)基配制 (1)淀粉降解菌培養(yǎng)基(w/v):可溶性淀粉O. 5% -3. 5%、蛋白胨0. 5% -2. 0%、酵 母粉O. 5% -2. 0%、氯化鈉0. 3% -1. 5%、自然pH。 (2)油脂降解菌培養(yǎng)基(w/v):蛋白胨O. 5% -2. 0%、酵母粉0. 3% -2. 0%、氯化鈉 0. 3% -1. 5%、豆油0. 5% -1. 5%、自然pH。 (3)蛋白質降解菌培養(yǎng)基(w/v):酪蛋白0. 5% _3.0%、硝酸鈉0. 1% -0. 5%、 磷酸氫二鈉O. 05% -0. 2%、氯化鉀0. 03% -0. 06%、硫酸鎂0. 03 % -0. 06%、硫酸亞鐵 0. 001% -0. 003%、自然pH。 2、高溫富集培養(yǎng)將選用的植物莖、葉剪碎，按2% -10% (w/v)放入富集培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)溫度為45°C 80°C ，水浴搖床培養(yǎng)12h 120h后，轉入新鮮的富集培養(yǎng)基中，這樣 反復2 5次。 3、稀釋分離在富集培養(yǎng)基中按1. 5% 2. 0% (w/v)的比例添加瓊脂，配制成相 應的固體富集培養(yǎng)基，高壓滅菌后，倒平板；將液體富集培養(yǎng)物稀釋、涂板，放入45°C -70°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h 120h，至平板生長出明顯的單菌落。
4、菌種的篩選 (1)淀粉降解菌向培養(yǎng)好的淀粉降解菌固體富集培養(yǎng)基平板中滴加碘液放置 5 20min，平板中菌落周圍出現(xiàn)透明圈為淀粉降解菌。 (2)油脂降解菌向培養(yǎng)好的油脂降解菌固體富集培養(yǎng)基平板中添加中性紅指示 劑，如果培養(yǎng)基中的脂肪被降解，產生脂肪酸，遇到中性紅指示劑會變成紅色，所以出現(xiàn)紅 色斑點的菌落為油脂降解菌。 (3)蛋白質降解菌由于蛋白質降解菌富集培養(yǎng)基中酪蛋白為唯一碳源，所以涂
平板后能夠生長的菌就是蛋白質降解菌。 5、菌種的分離純化 挑取具有以上特征的單菌落，在固體富集培養(yǎng)基上劃線分離、純化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 與富集培養(yǎng)溫度相同，直至出現(xiàn)單菌落，再挑取劃線，這樣反復2 3次后，即篩選出不同功 能的葉際高溫微生物。 本發(fā)明技術方案可以從不同植物的葉際篩選出不同功能的高溫微生物。以下通過 具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實質，但 不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。
實施例1 : 第一步，富集培養(yǎng)基配制，如下 (1)淀粉降解菌培養(yǎng)基可溶性淀粉2g、蛋白胨lg、酵母粉0. 5g、氯化鈉1. Og，用 100mL自來水溶解，12rC滅菌20min。 (2)油脂降解菌培養(yǎng)基蛋白胨lg、酵母粉0. 5g、氯化鈉lg、大豆油lg，用100mL自 來水溶解，121。C滅菌20min。 (3)蛋白質降解菌培養(yǎng)基酪蛋白1.2g、硝酸鈉0. lg、磷酸氫二鈉0. lg、氯化鉀
0. 05g、硫酸鎂0. 05g、硫酸亞鐵0. OOlg，用100mL自來水溶解，121。C滅菌20min。 第二步，富集培養(yǎng)稱取松樹莖、葉10g，剪碎至約lcm長，放入盛有150ml液體富
集培養(yǎng)基中，于55t:下，水浴搖床培養(yǎng)48h，然后，按照5 %的接種量，轉接入新的富集培養(yǎng)
基中，這樣反復3次。 第三步，稀釋分離在富集培養(yǎng)基中按1.5% 2.0% (w/v)的比例添加瓊脂，配制 成相應的固體培養(yǎng)基，滅菌后，倒平板；將液體富集培養(yǎng)物稀釋、涂板，放入55t:恒溫培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)48h，至平板生長出明顯的單菌落。
第四步，菌種的篩選 (1)淀粉降解菌向培養(yǎng)好的淀粉降解菌固體培養(yǎng)基平板中滴加碘液放置15分鐘 后，平板中菌落周圍出現(xiàn)透明圈為淀粉降解菌。 (2)油脂降解菌向培養(yǎng)好的油脂降解菌固體培養(yǎng)基平板中添加中性紅指示劑， 培養(yǎng)基后，出現(xiàn)紅色斑點的菌落為油脂降解菌。 (3)蛋白質降解菌在蛋白質降解菌培養(yǎng)基平板上生長良好的菌落就是蛋白質降 解菌。 第五步，菌種的分離純化挑取以上固體培養(yǎng)基平板上的單菌落，轉接在相同固體
培養(yǎng)基上劃線分離、55t:培養(yǎng)，直至出現(xiàn)單菌落，再挑取單菌落劃線分離、55t:培養(yǎng)，純化出篩選的葉際高溫微生物。 第六步，菌種的鑒定經(jīng)PCR擴增篩選出來的高溫微生物的核糖體小亞基基因 (16S rDNA或18S rDNA)，測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對，找出親緣性最接近的菌 種，再結合形態(tài)學特征觀察和生理生化實驗鑒定出上述篩選的高溫菌的歸屬。
通過上述步驟，分離篩選得到3株高溫細菌，包括一株高溫蛋白降解菌 (A麗ybacillus sp. Bl)、一株高溫淀粉降解菌(Bacillus subtilis Dl)禾口一株高溫油 脂降解菌(Sphingobacterium sp. Z2)，它們的16S rDNA序列遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫， 登陸號分別為FJ268956(Anoxybacillus sp. Bl) 、 FJ268958 (Bacillussubtilis Dl)和 FJ268960(Sphingobacterium sp.Z2)。
實施例2 : 第一步，富集培養(yǎng)基配制，如下 (1)淀粉降解菌培養(yǎng)基可溶性淀粉2g、蛋白胨0. 5g、酵母粉1. 0g、氯化鈉0. 5g， 用100mL自來水溶解，12TC滅菌15min。 (2)油脂降解菌培養(yǎng)基蛋白胨0.5g、酵母粉1.0g、氯化鈉0.5g、大豆油1.5g，用 100mL自來水溶解，12rC滅菌15min。 (3)蛋白質降解菌培養(yǎng)基酪蛋白2. 0g、磷酸氫二鈉0. lg、氯化鈉0. 5g、氯化鉀
0. 03g、硫酸鎂0. 03g、硫酸亞鐵0. 002g，用100mL自來水溶解，121。C滅菌15min。 第二步，富集培養(yǎng)稱取槐樹莖、葉15g，剪碎至約lcm長，放入盛有200ml液體富
集培養(yǎng)基中，于55t:下，水浴搖床培養(yǎng)48h，然后，按照5 %的接種量，轉接入新的富集培養(yǎng)
基中，這樣反復3次。 其他步驟與實施例1相同。 通過上述步驟，分離篩選得到2株高溫細菌，包括一株高溫淀粉降解菌 (Aneurinibacillus sp. D2)和一株高 益油脂降解菌(Aneurinibacillus sp.Z3)，它們 的16S rDNA序列遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫，登陸號分別為FJ268959 (Aneurinibacillus sp.D2)禾口 FJ268961(Aneurinibacillus sp.Z3)。
權利要求
一種從植物葉際篩選高溫菌的方法，其特征在于，該方法包括富集培養(yǎng)基配制、高溫富集培養(yǎng)、稀釋分離、菌種篩選、菌種純化五個步驟，得到不同功能的高溫菌。
2. 權利要求l所述的從植物葉際篩選高溫菌的方法，其特征在于，富集培養(yǎng)基配制包括三種培養(yǎng)基的配方，(1)淀粉降解菌培養(yǎng)基(w/v):可溶性淀粉0.5%-3.5%、蛋白 胨0.5% -2.0%、酵母粉0.5% -2.0%、氯化鈉0.3% -1.5%、自然pH ; (2)油脂降解菌 培養(yǎng)基(w/v):蛋白胨O. 5% -2. 0%、酵母粉0. 3% -2. 0%、氯化鈉0. 3% _1.5%、豆油 0.5% -1.5%、自然pH;(3)蛋白質降解菌培養(yǎng)基(w/v):酪蛋白0.5% -3.0%、硝酸鈉 0. 1 % -0. 5 % 、磷酸氫二鈉0. 05 % -0. 2 % 、氯化鉀0. 03 % -0. 06 % 、硫酸鎂0. 03 % -0. 06 % 、 硫酸亞鐵O. 001% -0. 003X、自然pH。
3. 權利要求1所述的從植物葉際篩選高溫菌的方法，其特征在于，高溫富集培養(yǎng)是將 選用的植物莖、葉剪碎，按2%-10% (w/v)放入富集培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為45t: 8(rC，水 浴搖床培養(yǎng)12h 120h后，轉入新鮮的富集培養(yǎng)基中，這樣反復2 5次。
4. 權利要求1所述的從植物葉際篩選高溫菌的方法，其特征在于，菌種的篩選包括 (1)淀粉降解菌的篩選，是向培養(yǎng)好的淀粉降解菌固體富集培養(yǎng)基平板中滴加碘液放置 5 20min，平板中菌落周圍出現(xiàn)透明圈為淀粉降解菌；(2)油脂降解菌的篩選，是向培養(yǎng)好 的油脂降解菌固體富集培養(yǎng)基平板中添加中性紅指示劑，如果培養(yǎng)基中的脂肪被降解，產 生脂肪酸，遇到中性紅指示劑會變成紅色，所以出現(xiàn)紅色斑點的菌落為油脂降解菌；(3)蛋 白質降解菌的篩選，是由于蛋白質降解菌富集培養(yǎng)基中酪蛋白為唯一碳源，所以涂平板后 能夠生長的菌就是蛋白質降解菌。
全文摘要
高溫菌是一類能在45℃以上生長和繁殖的極端環(huán)境微生物，其在工業(yè)生產中極具應用價值。植物的葉際在強烈的日照下，其表面溫度可以達到40℃～55℃。本發(fā)明涉及一種從植物葉際篩選不同功能高溫菌的方法，屬于微生物技術領域。該方法主要是在高溫條件下，采用不同的選擇性培養(yǎng)基，從植物莖、葉富集、篩選不同功能的高溫菌。篩選步驟包括(1)富集培養(yǎng)基的配制；(2)高溫富集培養(yǎng)；(3)稀釋分離；(4)菌種篩選；(5)分離純化。然后將篩選得到的純菌株進行鑒定并保存。
文檔編號C12N1/14GK101724581SQ20081022488
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權日2008年10月24日
發(fā)明者莊國強, 張倩, 李林, 楊建州, 白志輝, 齊鴻雁 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心