專利名稱：嗜熱甘露聚糖水解酶和含所述嗜熱甘露聚糖水解酶的壓裂液的制作方法
嗜熱甘露聚糖水解酶和含所述嗜熱甘露聚糖水解酶的壓裂液
技術(shù)領(lǐng)域：
在超過160 T的溫度下水解半乳甘露聚糖底物的分離的甘露聚糖水解酶在含有瓜爾膠及衍生的瓜爾膠的壓裂液中作為酶破膠劑具有特定可應(yīng)用性。
背景技術(shù)：
液壓壓裂用于產(chǎn)生從鉆孔延伸進(jìn)巖層的地下裂縫，以便增加壓裂液可由地層產(chǎn)生的速度。一般而言，將高粘度壓裂液以足夠的壓力泵入井，以斷裂地層。為了維持增加的暴露于地層，將固體支撐劑加入被通過施加到壓裂液的高壓攜帶到裂縫的壓裂液。大于65%的常規(guī)壓裂液是由瓜爾膠(半乳甘露聚糖)或瓜爾膠衍生物諸如羥丙基瓜爾膠(HPG)，羧甲基瓜爾膠(CMG)和羧甲基羥丙基瓜爾膠(CMHPG)制成。這些聚合物 可被交聯(lián)，以便增加它們的粘度和增加它們的支撐劑運(yùn)輸?shù)哪芰?。一旦高粘度壓裂液將支撐劑攜帶到了地層，使用破膠劑減小壓裂液的粘度，其允許支撐劑沉降到裂縫和由此增加地層暴露于井。破膠劑通過減少聚合物分子量，由此‘?dāng)嗔选酆衔飦砉ぷ?。然后裂縫成為待產(chǎn)生返回到井的流體和氣體的高通透性導(dǎo)管?；瘜W(xué)氧化劑和酶最通常被用作破膠劑。氧化劑產(chǎn)生自由基，其然后降解聚合物。此反應(yīng)限制受限于氧化劑是化學(xué)計(jì)量的，且它們不僅會攻擊聚合物，而且會攻擊可被氧化的任何分子。另一方面，酶是催化性和底物特異性的，并會催化聚合物上特定鍵的水解。酶會在其有壽命期間降解許多聚合物鍵。不幸的是，酶在窄溫度范圍內(nèi)操作，且它們的功能狀態(tài)常常被高溫滅活。用以降解半乳甘露聚糖的常規(guī)酶在環(huán)境 中等溫度(75 T 150 T )工作良好。在升高的溫度，(> 150 T )這些酶快速變性及失去活性。常規(guī)酶制劑中使用的β -甘露聚糖酶具有約150 T的溫度上限。活性特征指示，過了此點(diǎn)，則酶保留少到無活性。因?yàn)樵S多井下壓裂操作在超過150 °F的溫度進(jìn)行，具有可在這些升高的溫度下降解基于瓜爾膠的壓裂液的酶會有益。發(fā)明概述甘露聚糖水解酶有效水解半乳甘露聚糖，且在升高的溫度范圍的瓜爾膠聚合物水解中具有特定有效性。高溫甘露聚糖水解酶可關(guān)聯(lián)于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或可未關(guān)聯(lián)于GST。編碼甘露聚糖水解酶的核苷酸序列源于解糖熱纖維菌(Caldocellumsaccharolyticum)的β_甘露聚糖酶基因，并經(jīng)密碼子優(yōu)化而用于在大腸埃希氏菌(Ε. coli)中表達(dá)。編碼甘露聚糖水解酶的基因(下文“hti3 ”)具有圖IA所示的核苷酸序列，其被密碼子優(yōu)化而增加甘露聚糖水解酶在大腸埃希氏菌(E. coli)中表達(dá)。然后可將基因ht@克隆進(jìn)適合的質(zhì)粒載體，諸如pUC57，pUC 19，及pGS-21a或克隆進(jìn)任何其他可商購的載體或自定義表達(dá)的載體或克隆載體。可將甘露聚糖水解酶轉(zhuǎn)化進(jìn)可商購的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)株,并在其中表達(dá)。甘露聚糖水解酶的翻譯的氨基酸序列顯示于圖IB。然后可制備水性壓裂液，其含有酶，瓜爾膠聚合物及交聯(lián)劑。當(dāng)在液壓壓裂中使用時，甘露聚糖水解酶對于在超過160 °F的溫度降解基于瓜爾膠的聚合物中有效。

為了更完全地明白，本發(fā)明的詳述中參照圖，提供各圖的簡述，其中圖IA顯示本發(fā)明中使用的編碼甘露聚糖水解酶的核苷酸序列。圖IB顯示甘露聚糖水解酶的氨基酸序列。圖2顯示帶有甘露聚糖水解酶基因的質(zhì)粒pUC57_ht0，pGS-21a-gst-ht@和pGS-21-htP 的構(gòu)建。 圖3對比了于180 0F的25ppt的含有甘露聚糖水解酶的硼酸鹽交聯(lián)的瓜爾膠懸浮液對比不含有甘露聚糖水解酶的懸浮液18小時之后的粘度減小。圖4對比了于160 0F的25ppt的含有甘露聚糖水解酶的硼酸鹽交聯(lián)的瓜爾膠懸浮液對比不含有甘露聚糖水解酶的懸浮液18小時之后的粘度減小。圖5對比了于180 T的含有甘露聚糖水解酶的硼酸鹽交聯(lián)的瓜爾膠懸浮液對比不含有甘露聚糖水解酶的懸浮液經(jīng)10小時的粘度減小。圖6對比了于140 0F的含有甘露聚糖水解酶的硼酸鹽交聯(lián)的瓜爾膠懸浮液對比不含有甘露聚糖水解酶的懸浮液經(jīng)3. 5小時的粘度減小。圖7對比了不同溫度的含有甘露聚糖水解酶的瓜爾膠懸浮液的粘度減小。圖8顯示含有甘露聚糖水解酶的懸浮液對比不含有甘露聚糖水解酶的懸浮液之間的支撐劑填充層及對比傳導(dǎo)性的顯微照片。發(fā)明詳述本發(fā)明的壓裂方法中使用的高溫酶，當(dāng)其未與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)關(guān)聯(lián)時稱之為“甘露聚糖水解酶”，而當(dāng)其是β -甘露聚糖酶和GST的融合體時稱之為“GST-甘露聚糖水解酶”。本文所述的甘露聚糖水解酶來源于嗜熱和厭氧解糖熱纖維菌(Caldocellumsaccharolyticum)。編碼β _甘露聚糖酶的基因的分離描述于E。E. Luthi et al,“Cloning,Sequence Analysis,and Expression in Escherichia coli of a Gene Codingfor a β -Mannanase From the Extremely Thermophilic Bacterium ‘Caldocellumsaccharolyticum’，Applied and Environmental Microbiology, Mar.1991, pp. 694-700,其通過引用并入本文。甘露聚糖水解酶的基因然后經(jīng)密碼子優(yōu)化而增加其在大腸埃希氏菌(E. coli)中的表達(dá)效率。hti3基因的核苷酸序列如圖IA所示。此核苷酸序列與Luthi等人對甘露聚糖酶基因的圖2中描繪的序列具有74%同源性。核苷酸序列包括甘露聚糖水解酶的編碼序列和N-端的前導(dǎo)序列。如圖2(a)所示，可將ht@基因克隆進(jìn)克隆載體pUC57而產(chǎn)生質(zhì)粒pUC57-ht3。在(b)及(c)中，可將基因克隆進(jìn)含有GST蛋白的編碼區(qū)的表達(dá)載體pGS-21a。在(b)中，得到的基因編碼GST-甘露聚糖水解酶融合產(chǎn)物。在(c)中，得到的基因編碼無GST融合標(biāo)簽的酶。分別使用(b)和(C)的pGS-21a-gst_ht β和pGS-21a_ht@質(zhì)粒的表達(dá)分別產(chǎn)生與N-端GST蛋白融合的甘露聚糖水解酶和無關(guān)聯(lián)的GST蛋白的甘露聚糖水解酶。在各圖2(a), (b)及(C)中,Ampr調(diào)控β -內(nèi)酰胺酶的表達(dá),rep (pMBl)和fl ori分別代表PUC57和pGS-21a中的復(fù)制原點(diǎn)，負(fù)責(zé)質(zhì)粒的復(fù)制，IacI編碼乳糖阻遏物，T7代表T7RNA聚合酶啟動子，MCS代表多克隆位點(diǎn)。優(yōu)化的序列的5’端含有BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端含有HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，其用于克隆進(jìn)pGS-21a表達(dá)載體而產(chǎn)生GST-甘露聚糖水解酶融合蛋白?；蛘?，5’BamHl位點(diǎn)用NdeI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)取代而產(chǎn)生無關(guān)聯(lián)的GST融合的甘露聚糖水解酶蛋白。質(zhì)粒pGS_21a_ht β , pGS-21a_gst_ht β和pUC57_ht β可轉(zhuǎn)化進(jìn)可商購的大腸埃希氏菌(E.coli)株及培養(yǎng)。然后可收獲細(xì)胞，裂解，及將得到的溶液用作細(xì)胞裂解物。可通過自裂解產(chǎn)物移出細(xì)胞碎片來產(chǎn)生無細(xì)胞的提取物，及然后可從提取物分離酶。術(shù)語"分離的"表示酶已從完整細(xì)胞或細(xì)胞碎片移出，及，在非其天然環(huán)境的條件下，無其他外來 的或不需要的核酸，蛋白酶和脂質(zhì)，取適合用作壓裂液的破膠劑的形式。編碼甘露聚糖水解酶的基因可還具有與圖IA的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列。術(shù)語"基本上同源"在本文用來表示與圖I中顯示的序列具有至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,及甚至更優(yōu)選至少90%,序列同一'丨生的核苷酸。甘露聚糖水解酶的翻譯的氨基酸序列顯示于圖1B。一般而言，本文所述的液壓壓裂方法中使用的甘露聚糖水解酶的翻譯的氨基酸序列至少60%類似于圖IB所示的翻譯的氨基酸序列。在優(yōu)選的形式中，分離的蛋白基本上無其他蛋白。提供大于40%純形式，更優(yōu)選大于60%純形式的蛋白是優(yōu)選的。甚至更優(yōu)選，提供高度純化的形式，即，如通過SDS-PAGE測定的大于80%純，更優(yōu)選大于95%純，及甚至更優(yōu)選大于99%純的蛋白是優(yōu)選的。甘露聚糖水解酶在升高的溫度范圍，諸如超過72 °F，一般在約5. O 約11. O之間的pH范圍有效水解瓜爾膠聚合物。實(shí)際上，甘露聚糖水解酶在超過160 T以及超過180 T的溫度水解瓜爾膠聚合物。此外，甘露聚糖水解酶可用于與其他酶和/或氧化破膠劑組合而在更廣溫度和PH范圍降解瓜爾膠凝膠。本發(fā)明中使用的水性壓裂液可通過將可水合的聚合物與水性流體混合來制備。水性流體可為，例如，水，鹽水或水-醇混合物。任何適合的混合設(shè)備可用于此過程。在分批混合的情況中，將可水合的聚合物和水性流體混合足以形成水合的溶膠的時間。將可水合的聚合物以水性流體的重量計(jì)約O. 10% 5. 0%的濃度加入水性流體。對于本發(fā)明最優(yōu)選的范圍是以重量計(jì)約O. 20% O. 80%。在本發(fā)明中有用的可水合的聚合物是未衍生的瓜爾膠以及衍生的瓜爾膠。優(yōu)選未衍生的瓜爾膠。衍生的瓜爾膠的例包括羥丙基瓜爾膠，羧甲基羥丙基瓜爾膠，及羧甲基羥乙基纖維素。除了酶破膠劑和可水合的聚合物之外，壓裂液包括交聯(lián)劑。交聯(lián)劑可為含金屬離子的聚合物，其包括鋁，銻，鋯，和含有鈦化合物，其包括，所謂的有機(jī)鈦酸鹽，以及硼酸鹽和釋放硼的化合物。在硼酸鹽交聯(lián)劑的情況中，交聯(lián)劑是供給硼酸根離子的任何物質(zhì)。適合的硼酸鹽交聯(lián)劑包括有機(jī)硼酸鹽，單硼酸鹽，多硼酸鹽，礦物質(zhì)硼酸鹽，硼酸，硼酸鈉，包括無水或任何水合物，硼酸鹽礦石，諸如硬硼酸鈣石或鈉硼解石，以及與有機(jī)化合物復(fù)合而延遲硼酸根離子釋放的任何其他硼酸鹽。優(yōu)選硼酸鹽交聯(lián)劑。交聯(lián)劑優(yōu)選以水性流體的重量計(jì)從約O. 001%至超過O. 5%的范圍存在。優(yōu)選地，交聯(lián)劑濃度在以水性流體的重量計(jì)約O. 005% 約O. 25%的范圍內(nèi)。—般而言,酶作為酶水溶液。處理液中的酶溶液的重量百分率依賴于酶水溶液中的酶活性單位數(shù)。例如，處理液中具有30，000U的酶活性的酶水溶液的量通常在約O. 05 約I. 3重量百分率之間，優(yōu)選約O. 103 約O. 206重量百分率之間。含有不同酶活性單位的酶溶液的重量百分率可使用含有30，000U的酶活性的酶溶液的指定的重量百分率測定。含有可交聯(lián)的聚合物的水性流體的最佳pH是堿性的，且一般在約9. 5 約11. O之間。本發(fā)明的壓裂液也可具有作為伴侶物質(zhì)摻入酶破膠劑的pH調(diào)節(jié)物質(zhì)。pH調(diào)節(jié)物質(zhì)是起初惰性，但在膠凝的壓裂液中緩慢水解而產(chǎn)生Bronsted酸，由此逐漸降低膠凝的流體的pH及活化酶破膠劑的任何物質(zhì)。優(yōu)選的pH調(diào)節(jié)物質(zhì)包括緩慢水解而產(chǎn)生Bronsted 酸的有機(jī)酐，酰基鹵，磺酰鹵，芐型鹵化物和低分子量酯。"低分子量"酯是指應(yīng)在壓裂液中可溶性，以便實(shí)現(xiàn)旨在的經(jīng)時水解而產(chǎn)生酸的目的的酯。一般而言，分子量越高，酯越不可溶。結(jié)果，更低分子量酯優(yōu)選容易使用。優(yōu)選地，PH調(diào)節(jié)物質(zhì)是低分子量酯選自乙基乙酸酯，2-乙氧基乙基乙酸酯，乙基乙酰乙酸酯，三乙基檸檬酸酯，甲基苯甲酸酯和二甲基酞酸酯。以下實(shí)施例中使用的2-乙氧基乙基乙酸酯，乙基乙酰乙酸酯和三乙基檸檬酸酯的典型分子量分別是132，130和276。優(yōu)選地，pH調(diào)節(jié)物質(zhì)以水性流體的重量計(jì)約O. 01% 約
O.85%的范圍內(nèi)存在。井處理液可使用高剪切泡沫發(fā)生器原位制備或可航運(yùn)到期望的位置。壓裂液可還含有在添加交聯(lián)劑之前正常添加到壓裂液的支撐劑。適合的支撐劑包括本領(lǐng)域常規(guī)知道的那些，包括石英砂粒，玻璃珠，鋁沉淀，陶瓷，塑料珠，包括聚酰胺和超輕型(ULW)粒子，諸如堅(jiān)果如胡桃，椰子，美國山核桃，杏仁，象牙果，巴西栗，等的研磨或壓碎的殼；果實(shí)諸如李子，橄欖，桃，櫻桃，杏，等的種子的研磨和壓碎的種殼(包括果核)；其他植物諸如玉米(例如，玉米軸或玉米仁)，等的研磨和壓碎的種殼；處理的木材，諸如源于木材諸如櫟，山核桃，胡桃，楊，桃花心木，等的那些，包括已通過研磨，削或其他形式的粒子化,處理,等處理的木材。其他支撐劑可包括多孔陶瓷或有機(jī)聚合物粒子。多孔顆粒物可用非-多孔穿透物質(zhì)，涂覆層或上釉層處理。例如，多孔顆粒物可為處理的顆粒物，如美國專利公開No. 20050028979中定義的，其中(a)處理的多孔材料的ASG小于多孔顆粒物的ASG ； (b)處理的材料的通透性小于多孔顆粒物的通透性；或(C)處理的材料的空隙度小于多孔顆粒物的空隙度。支撐劑正常以約I 8鎊之間/加侖的壓裂液組合物的濃度使用，但可根據(jù)需要使用更高或更低濃度。壓裂液也可含有修井工業(yè)常見的其他常規(guī)添加劑，諸如表面活性劑，腐蝕抑制劑，交聯(lián)延遲劑等。在典型壓裂操作中，本發(fā)明的壓裂液以足夠高壓泵出，以導(dǎo)致裂縫的形成或放大，并將支撐劑放到裂縫中。下列實(shí)施例是本發(fā)明的一些實(shí)施方式的例證。除非另外指示，實(shí)施例中出現(xiàn)的全部百分率以重量單位給出。
實(shí)施例實(shí)施例I將htβ基因克隆進(jìn)克隆載體PUC57而產(chǎn)生質(zhì)粒pUC57_ht β及克隆進(jìn)表達(dá)載體pGS-21a而產(chǎn)生pGS-21a-ht@質(zhì)粒。然后將質(zhì)粒pGS_21a_ht β和pUC57_ht β轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)BL21(DE3)或DH5a大腸埃希氏菌(E.coli)株，并在5mL LB-Miller營養(yǎng)培養(yǎng)基中，于98. 6 °F，以200rpm培養(yǎng)16小時。向培養(yǎng)肉湯補(bǔ)充100 μ g/mL氨芐西林，將其用作帶有質(zhì)粒pGS-21a-ht β或pUC57_ht β的大腸埃希氏菌(E.coli)的IOOmL培養(yǎng)的接種物。這些培養(yǎng)物于98. 6 ° 和200rpm生長。4小時之后，將異丙基β _D_1_硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入培養(yǎng)至終濃度O. ImM。IPTG存在下3小時的溫育之后，將細(xì)胞冷卻到39 °F，并通過以3，OOOrpm離心20分鐘來收獲。然后去除培養(yǎng)基，并將細(xì)胞于_4 儲直到使用。然后將細(xì)胞解凍及重懸浮于5mL冷卻的50mM磷酸鈉緩沖劑。以lmg/mL的終濃度加入溶菌酶，并將培養(yǎng)物于室溫溫育30分鐘。將核酸通過超聲處理的短暫脈沖破壞，并通過離心獲得產(chǎn)生的無細(xì)胞的提取物(CFX)。實(shí)施例2將約Igpt的作為GBW-12CD從BJServices公司可商購的常規(guī)β -甘露聚糖酶，以I : 33體積測定比在水中稀釋，并將約2mL的含有pGS_21a_ht β和pUC57_ht β的實(shí)施例I的CFX添加到含有25ppt GW3，2gpt BF-7L和Igpt XLff-32的IOOmL水性流體，并于180 °F溫育18小時。(GW-3是瓜爾膠懸浮液劑，XLff-32是硼酸鹽交聯(lián)劑，及BF-7L是緩沖劑，全部可從BJServices公司商購)。然后允許樣品冷卻到室溫,并使用Fann 35粘度計(jì)測量它們的粘度。結(jié)果顯示于圖3，其中顯示，于180 T在18小時之后甘露聚糖水解酶提供幾乎完全瓜爾膠粘度減小，而常規(guī)酶產(chǎn)物不呈現(xiàn)在此溫度和PH減少交聯(lián)的流體的粘度中有效。圖3中的箭標(biāo)代表未斷裂的樣品。全部樣品的初始pH是10. 5。實(shí)施例3將約Igpt的實(shí)施例3的常規(guī)酶及2mL自來自實(shí)施例I的含有pGS-21a-ht^ 和 pUC57_ht β 的樣品的 CFX 添加到 IOOmL 含有 25ppt GW_3，2gpt BF-7L 和Igpt XLff-32的水性樣品，并于160 T溫育18小時。在ρΗ6· 5和10. 5使用Gff-3的樣品。常規(guī)酶，GBW-12，顯示在pH6. 5但不在10. 5降解GW-3樣品。含有甘露聚糖水解酶的樣品于160 T 18小時之后提供交聯(lián)的GW-3的部分至完全降解。在Fann 35上測量粘度，并顯示于圖4，其中圖4代表硼酸鹽交聯(lián)的25ppt GW-3被甘露聚糖水解酶的粘度減小。箭標(biāo)代表未破膠的樣品。實(shí)施例4制備IOOmL水性流體而含有25pptGff3,1. 5gpt BF-7L和I. 5gpt的從BJ Services公司作為XLW-30可商購的在烴油中制衆(zhòng)的硼酸鹽礦石交聯(lián)劑。溶液的pH是10. 8。然后制備2個樣品。一個樣品，指定為(_)，無酶添加到流體。其他樣品，指定為(+)，具有O. 75gpt的由pGS21a-ht β表達(dá)載體產(chǎn)生的甘露聚糖水解酶CFX溶液的1/25稀釋。圖5代表于180 ° 經(jīng)10小時的2個樣品的粘度減小。圖6代表于140 ° 經(jīng)10小時的2個樣品的粘度減小。實(shí)施例5制備IOOmL水性流體而含有25pptGff3,1. 3gpt BF-7L和I. OgptXLff-32交聯(lián)劑用于于72 T和140 °F測試。制備第2IOOmL水性流體而含有25ppt Gff3,
2.Ogpt BF-7L和1.5gpt XLW-30交聯(lián)劑用于于200 °F測試。在全部樣品中，甘露聚糖水解酶濃度是O. 5gpt。在Chandler HTHP 5550粘度計(jì)上以100s—1測量各樣品的流變學(xué)。圖7代表在可變的溫度的測試的流變學(xué)特征，并展示，甘露聚糖水解酶在從72 °F到至少200 T的一系列溫度下，減少交聯(lián)的半乳甘露聚糖聚合物的粘度中有效。實(shí)施例2，3，4和5展示，含有甘露聚糖水解酶的壓裂液在常規(guī)酶不那么有效的升高的溫度和PH范圍有效水解瓜爾膠聚合物。實(shí)施例6此實(shí)施例例證用含有甘露聚糖水解酶破膠劑的水性流體處理的支撐劑填充層的重獲的傳導(dǎo)性。制備IOOmL水性流體的2個樣品而含有25pptGW-3，I. 5gpt BF-7L和I. 3gpt XLW-30。一個樣品還含有I. 25gpt(l/5稀釋)的甘露聚糖水解酶(參考實(shí)施例6);其他樣品未含有任何酶。60mL注射器裝備有切成注射器內(nèi)徑的30目網(wǎng)篩。所述網(wǎng)篩支持一片過濾紙(2. 5μπι孔徑)，其也切成注射器內(nèi)徑。然后將IOg的20/40CarboProp，Carbo Ceramics的支撐劑應(yīng)用于過濾紙。然后將IOOmL交聯(lián)的流體應(yīng)用于支撐劑床,及通過支撐劑填充層施力，直到柱塞靜止在支撐劑填充層頂部。在注射器端封頭，并將注射器浸
沒到180 T水浴24小時。然后自水浴移出注射器，并允許冷卻到室溫。然后將注射器倒置，并將柱塞輕輕移出，以最小化對支撐劑填充層的干擾。將支撐劑填充層放入藍(lán)稱量盤，并立即在復(fù)合光學(xué)顯微鏡下用IOX放大率可視化。圖8是支撐劑填充層的顯微照片，例證不含有甘露聚糖水解酶的懸浮液(顯微照片A)對比含有甘露聚糖水解酶的懸浮液(顯微照片B)之間的傳導(dǎo)性。如顯示于顯微照片A，支撐劑填充層具有高度定義的結(jié)構(gòu)，表示壓裂液保持交聯(lián)。(自注射器的其余流體也交聯(lián))。顯微照片B顯示無結(jié)構(gòu)的支撐劑填充層，其中填充層自注射器移出后立即“崩潰”。自注射器的其余流體像水樣，具有非常低的粘度。自含有甘露聚糖水解酶的壓裂液的支撐劑填充層顯示殘留少至無交聯(lián)的凝膠。此提示，支撐劑填充層通透性的優(yōu)良的凈化和高恢復(fù)。實(shí)施例7此實(shí)施例例證在101發(fā)酵過程中甘露聚糖水解酶的產(chǎn)生。將htβ基因用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII克隆進(jìn)表達(dá)載體pGS21_a而產(chǎn)生無關(guān)聯(lián)的GST融合的甘露聚糖水解酶。將得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)大腸埃希氏菌(E.coli)，并平鋪于含有100 μ g/mL氨芐西林的LB-瓊脂板。將板于98. 6 °F溫育過夜。自板挑選單集落及用以接種IOOmL的含有100 μ g/mL氨芐西林的LB-Miller肉湯。將培養(yǎng)物于98. 6 °F以200RPM溫育過夜。將IOOmL過夜培養(yǎng)物作為接種物放入在來自New Brunswick Scientific的Bioflow 3000發(fā)酵罐中的IOL的Terrific肉湯中。以100 μ g/mL的終濃度加入氨節(jié)西林。將發(fā)酵培養(yǎng)物于98. 6 °F伴隨最大攪拌和補(bǔ)給壓縮的空氣以維持可能的最大通氣地生長24小時。將甘油以4mL/小時的速度添加整24小時。根據(jù)需要添加消泡劑溶液。一旦0D_達(dá)到O. 5的值，將無菌乳糖溶液加入混合物，從而系統(tǒng)中的乳糖終濃度是15mM。24小時之后，將細(xì)胞培養(yǎng)物于39 °F存儲，直到進(jìn)一步處理。然后將細(xì)胞培養(yǎng)物均質(zhì)化，并將細(xì)胞碎片通過離心或經(jīng)O. 2 μ m孔徑聚醚砜膜過濾來移出。然后可將得到的溶液用作甘露聚糖水解酶溶液或根據(jù)期望進(jìn)一步濃縮。在此實(shí)施例中，將濾出液經(jīng)切向流過濾(TFF)，使用30，000 MWCO聚醚砜濾器濃縮。然后使用滲余物作為甘露聚糖水解酶溶液。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本說明書會明晰本權(quán)利要求的范圍之內(nèi)的其他實(shí)施方式。希望說明書，以及實(shí)施例，僅被認(rèn)為是例示，本發(fā)明的范圍和精神由隨附權(quán)利要求給出。
權(quán)利要求
1.甘露聚糖水解酶，其 (a)由圖IA中顯示的核苷酸序列或與圖IA的序列至少60%同源的核苷酸序列編碼；或者 (b)當(dāng)翻譯時具有與圖IB的氨基酸序列至少60%同源的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I的甘露聚糖水解酶，其具有與圖IA的核苷酸序列至少90%同源的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求I的甘露聚糖水解酶，其具有圖IA的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求I的甘露聚糖水解酶，其中酶的核苷酸序列源于解糖熱纖維菌(Caldocellum saccharolyticum)的β _甘露聚糖酶基因，且經(jīng)密碼子優(yōu)化而用于在大腸埃希氏菌(Ε. coli)中表達(dá)。
5.權(quán)利要求I的甘露聚糖水解酶，其為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和甘露聚糖水解酶的融合產(chǎn)物，且克隆自pGS-21a_gst_ht β質(zhì)粒。
6.水性壓裂液，其包含 (a)可水合的聚合物，其選自未衍生的瓜爾膠及衍生的瓜爾膠； (b)交聯(lián)劑，其用于交聯(lián)可水合的聚合物而形成聚合物凝膠；以及 (C)酶破膠劑，其包含權(quán)利要求I的甘露聚糖水解酶。
7.權(quán)利要求6的水性壓裂液,其中酶破膠劑由圖IA的核苷酸序列或與圖IA的序列至少60%同源的核苷酸序列編碼。
8.權(quán)利要求6的水性壓裂液，其中酶破膠劑具有與圖IB的氨基酸序列至少60%同源的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6的水性壓裂液，其中酶破膠劑由與圖IA的核苷酸序列至少90%同源的核苷酸序列編碼。
10.權(quán)利要求6的水性壓裂液，其中可水合的聚合物是未衍生的瓜爾膠。
11.權(quán)利要求10的水性壓裂液，其中交聯(lián)劑含有硼或能給壓裂液提供硼酸根離子。
12.水性壓裂液，其包含 (a)可水合的聚合物，其選自未衍生的瓜爾膠及衍生的瓜爾膠； (b)交聯(lián)劑，其用于交聯(lián)可水合的聚合物而形成聚合物凝膠；以及 (c)酶破膠劑，其具有與圖IA的核苷酸序列至少75%同源的核苷酸序列。
13.權(quán)利要求12的水性壓裂液，其中酶破膠劑由圖IA的核苷酸序列或與圖IA的序列至少60%同源的核苷酸序列編碼。
14.權(quán)利要求12的水性壓裂液，其中酶破膠劑具有與圖IB的氨基酸序列至少60%同源的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求13的水性壓裂液，其中酶破膠劑由與圖IA的核苷酸序列至少90%同源的核苷酸序列編碼。
16.權(quán)利要求12的水性壓裂液，其中可水合的聚合物是未衍生的瓜爾膠。
17.權(quán)利要求12的水性壓裂液，其中交聯(lián)劑含有硼或能給壓裂液提供硼離子。
18.權(quán)利要求12的水性壓裂液，其中酶破膠劑是由gst-hti3基因編碼的GST-甘露聚糖水解酶融合產(chǎn)物。
19.壓裂地層的方法，包括向地層導(dǎo)入水性可膠凝的壓裂液，所述壓裂液包含(a)可水合的聚合物，其選自瓜爾膠及衍生的瓜爾膠； (b)交聯(lián)劑，其用于交聯(lián)可水合的聚合物而形成聚合物凝膠；以及 (C)酶破膠劑，其包含權(quán)利要求I的甘露聚糖水解酶。
20.權(quán)利要求19的方法，其中酶破膠劑是由hti3基因編碼的甘露聚糖水解酶。
21.權(quán)利要求19的方法，其中酶破膠劑是由gst-hti3基因編碼的GST-甘露聚糖水解酶融合產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求19的方法，其中可水合的聚合物是未衍生的瓜爾膠。
23.液壓壓裂具有超過160°F的井下溫度的地層的方法，其包括在足以在地層中產(chǎn)生或放大裂縫的壓力下向地層導(dǎo)入權(quán)利要求6的壓裂液。
24.權(quán)利要求23的方法，其中地層的井下溫度超過180°F。
25.權(quán)利要求23的方法，其中酶破膠劑是由gst-hti3基因編碼的GST-融合體。
全文摘要
嗜熱甘露聚糖水解酶可用作用于壓裂液的酶破膠劑，其含有瓜爾膠及未衍生的瓜爾膠的可水合的聚合物。酶在超過160℉的井下溫度有效。
文檔編號C07K14/195GK102822195SQ201080046577
公開日2012年12月12日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者C·D·阿姆斯特朗 申請人:貝克休斯公司