具有超薄封閉二氧化硅層的磁性粒子及其制造和使用方法
【專利說(shuō)明】具有超薄封閉二氧化枯層的磁性粒子及其制造和使用方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年06月13日、申請(qǐng)?zhí)枮?00680020971. 6且名稱為"具有 超薄封閉二氧化娃層的磁性粒子及其制造和使用方法"的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及一種涂有二氧化娃（Si02)的磁性粒子，其中，娃酸鹽層封閉、致密， 且具有厚度極薄的特點(diǎn)，其厚度僅在幾納米范圍內(nèi)（由此，下文也稱其為"二氧化娃納米 層"）。此外，本發(fā)明還設(shè)及一種制備該種含娃酸鹽磁性粒子的改良方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比， 該種方法可W獲得具有封閉娃酸鹽層的產(chǎn)品，從而使純度大幅提高。通過(guò)該種新方法還能 避免磁鐵礦表面不受控制地形成娃酸鹽聚集體，從而有利于下文將要說(shuō)明的特性和生物用 途。此外，該種新方法還可在分級(jí)離屯、基礎(chǔ)上減少納米固體顆粒。本發(fā)明的磁性粒子具有 最佳磁化性能和懸浮性能，并且能非常有利地脫離塑料表面。該種涂有二氧化娃的高純度 磁性粒子優(yōu)選用于從細(xì)胞樣品或組織樣品中分離核酸，其中，該種樣品基質(zhì)分離借助于磁 場(chǎng)而實(shí)現(xiàn)。該種粒子特別適用于對(duì)核酸（大多源于生物體樣品）自動(dòng)提純，W便通過(guò)各種 擴(kuò)增方法對(duì)其進(jìn)行分析。
【背景技術(shù)】
[0003] 最近一段時(shí)間W來(lái)，分子診斷學(xué)變得越來(lái)越重要。分子診斷學(xué)已進(jìn)入了對(duì)疾病的 臨床診斷階段。該包括分子標(biāo)記測(cè)量，該種測(cè)量可改善疾病診斷、早期查明、治療過(guò)程中的 病癥監(jiān)控、疾病預(yù)后和藥物療效或副作用的預(yù)測(cè)（包括檢測(cè)傳染病病原體，檢測(cè)基因組突 變，依據(jù)給定的或在病情發(fā)展過(guò)程中取得的遺傳樣品預(yù)測(cè)藥物的療效和副作用，發(fā)現(xiàn)正在 擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞W及疾病易感體質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)因數(shù)的鑒定等）。目前，獸醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析學(xué)和食品 檢測(cè)領(lǐng)域也應(yīng)用到了分子診斷學(xué)的方法。更進(jìn)一步的應(yīng)用為病理/細(xì)胞學(xué)研究院或法律 問(wèn)題調(diào)查中展開(kāi)的研究?；蛟\斷學(xué)目前也應(yīng)用于保健領(lǐng)域（例如對(duì)庫(kù)存血進(jìn)行是否含 有傳染病病原體的檢驗(yàn)），立法者計(jì)劃通過(guò)法律手段對(duì)該種檢驗(yàn)加W規(guī)范。臨床分子診斷 學(xué)所用的方法（例如雜交技術(shù)或擴(kuò)增技術(shù)，如PCR(polymerase化ainReaction,聚合酶 鏈反應(yīng)）、TMA(TranscriptionMediatedAmplification，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增）、LCR(Ligase QiainReaction,連接酶鏈反應(yīng)）、bDNA〇3ranchedDM,分支DM)或NASBA-(NucleicAcid SequenceBasedAmplification,基于核酸序列的擴(kuò)增））在基礎(chǔ)性科學(xué)研究領(lǐng)域中也屬于 常規(guī)方法。
[0004] 實(shí)施分子診斷學(xué)分析的前提通常是從待分析樣品中分離出DNA或RNA。雖然存在 允許核酸分離和檢測(cè)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的分析方法（例如基于bDNA的試驗(yàn)），但作為分子診斷 學(xué)中應(yīng)用最廣泛的生物分子方法，PCR由于會(huì)受外因影響而幾乎總是要求預(yù)先對(duì)核酸進(jìn)行 提純。
[0005] 傳統(tǒng)的核酸制備方法W液-液萃取為基礎(chǔ)。例如從組織樣品中苯酪-氯仿萃取 DNA。但巨大的工作量和部分情況下需要使用劇毒物質(zhì)的條件，使該類方法在近年來(lái)遠(yuǎn)不如 基于固相的方法受歡迎。
[0006] 使用基于固相的核酸萃取方法時(shí)，無(wú)論具體問(wèn)題是什么，樣品制備屬于分析過(guò)程， 其大致可分為四個(gè)基本步驟；1.調(diào)整固相；2.使分析物與固相進(jìn)行選擇性結(jié)合或特異結(jié) 合，去除多余的樣品基質(zhì)；3.從固相中洗去有可能存在的雜質(zhì)；4.對(duì)提純后濃縮的分析物 進(jìn)行洗脫。
[0007] 在核酸的選擇性和可逆性結(jié)合方面利用了核酸早已為人所知的特 性，在高離液鹽或其他高鹽（即高濃度離液鹽或其他高濃度鹽）條件下，將 核酸特異性地與含二氧化娃的吸附材料（例如玻璃粉[Proc.化tl.Acad.USA 76 (1979) 615-619,Anal.Biochem. 121 (1982) 382-387]、娃藻 ±diamatomeenerde[Methods Enzymol. 65 (1979) 176-182]或天然娃石[J.Clin.Microbiol. 28 (1990) 495-503,EP0 389 063Bl])結(jié)合。隨后借助一種含有水溶性有機(jī)溶劑的緩沖劑（通常為低級(jí)脂肪醇）從吸附 劑中洗去雜質(zhì)，對(duì)基質(zhì)進(jìn)行干燥，并用蒸饋水或所謂的低鹽緩沖劑（即低離子強(qiáng)度的緩沖 劑）對(duì)所吸附的核酸進(jìn)行洗脫。
[0008] 在價(jià)格低廉的全自動(dòng)核酸分離方面，使用超順磁吸附材料的方法的作用越來(lái)越 大。
[0009] 最簡(jiǎn)單的實(shí)施例（W0 01/46404)是在對(duì)為技術(shù)用途（例如電子照相調(diào)色劑）而商 業(yè)化制備的磁性粒子不采取進(jìn)一步改性措施的情況下就將其直接用于核酸制備。
[0010] 該種大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)品雖然滿足了幾個(gè)最重要的先決條件，例如一定的核酸吸附 率和磁化率，但在另一方面，該些通過(guò)商業(yè)途徑可購(gòu)得的產(chǎn)品并未滿足某些對(duì)于取得高靈 敏及可再現(xiàn)結(jié)果而言不可或缺的重要邊界條件。舉例而言，在病毒診斷（例如HCV或HIV) 領(lǐng)域非常重要的一點(diǎn)是，從血清或血漿中萃取定量的病毒核酸（即接近100%的產(chǎn)率），W 便從中推導(dǎo)出正確的血清/血漿病毒濃度，并據(jù)此決定所需采用的治療方法。磁性粒子的 純度在光學(xué)分析中也起著決定性作用。正是由于磁性粒子大多仍呈微孔狀，因而從粒子內(nèi) 部擴(kuò)散出來(lái)的鐵原子會(huì)使溶液變色，從而對(duì)透射測(cè)量和反射測(cè)量造成嚴(yán)重影響。
[0011] 因此，目前有大量描述生物用途磁性粒子研發(fā)情況的文獻(xiàn)，尤其是手動(dòng)核酸分離 和自動(dòng)核酸分離方面的研發(fā)情況。
[0012] 其中，表面具有大密度SiOH基團(tuán)的磁性粒子具有很重要的作用。因?yàn)镾iOH基團(tuán) 可與核酸進(jìn)行可逆結(jié)合。二氧化娃改性磁性粒子也是本發(fā)明的主題。
[0013] 為能取得高靈敏、定量及可再現(xiàn)結(jié)果，該種磁性粒子除磁化性和核酸結(jié)合能力外 還須符合一系列其他邊界條件，下文將對(duì)該些邊界條件進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0014] 粒度和粒度分布：
[0015] 事實(shí)表明，由化3〇4(磁鐵礦）構(gòu)成、主粒度范圍約為0. 1ym至1ym的電子照相調(diào) 色劑用磁性粒子（例如可從化.Lanxess公司購(gòu)得的名為BayoxideE的產(chǎn)品）具有近乎理 想的粒度條件。因?yàn)橥ㄟ^(guò)該種粒度可實(shí)現(xiàn)對(duì)于生物用途而言重要的"懸浮穩(wěn)定性"的重要邊 界條件。該種懸浮穩(wěn)定性必須滿足的條件是；搖勻后幾分鐘（例如10至15分鐘）內(nèi)（核 酸的吸附階段）不出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，而施加磁場(chǎng)后，為盡可能縮短分析時(shí)間，帶有核酸 的磁性粒子必須在短短的幾分鐘（例如1至5分鐘）內(nèi)完全分離。
[0016] 就該一方面而言，可使用的化3〇4(磁鐵礦）磁性粒子上仍然存在的缺陷是；還含有 少量納米范圍內(nèi)的極細(xì)的磁性粒子。
[0017] 該種會(huì)因其較大表面而結(jié)合大量核酸的非期望副產(chǎn)品在磁場(chǎng)中無(wú)法在短短的幾 分鐘內(nèi)分離，因而（正是在核酸的定量測(cè)定方面）可能會(huì)導(dǎo)致該部分核酸所含信息的丟失。
[0018] 除產(chǎn)量損失外，該還會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)渾濁的黃褐色上清液，該種黃褐色上清液不僅會(huì) 給產(chǎn)品銷售帶來(lái)不利影響，也會(huì)對(duì)洗脫液的光度分析造成一定影響。
[001引因此，如果能針對(duì)此處所述的生物用途對(duì)該部分"納米磁性粒子"進(jìn)行分離，是非 常有利的。
[0020] 娃酸鹽含量：
[0021] 如上文所述，幾種大規(guī)模生產(chǎn)的磁性粒子（例如化.Lanxess公司的Bayoxide E 系列）在未經(jīng)過(guò)?？诘亩趸藓筇幚淼那闆r下仍具有一定的核酸結(jié)合能力，該是因?yàn)樵?類磁性粒子在大批量生產(chǎn)下，在表面也具有少量SiOH基團(tuán)。該類產(chǎn)品由于核酸吸附量較低 而相應(yīng)需要相對(duì)較高的磁性粒子量，該會(huì)加大小體積樣品的處理難度。
[0022] 此外，該類產(chǎn)品具有相對(duì)于此處所述用途而言不利的容器壁（例如進(jìn)行核酸提純 時(shí)通常所需用到的微量滴定板上的玻璃或塑料壁）潤(rùn)濕特性。因此，懸浮液中殘留有大量 未改性的相對(duì)疏水的磁性粒子，該些磁性粒子吸附在微量滴定板壁上，從而影響移液精度， 并造成產(chǎn)量損失。
[0023] 在此情況下，具有大密度SiOH表面基團(tuán)的粒子的特性非常有利，該種粒子由于其 所具有的親水性可W非常有利地從塑料壁（例如上述微量滴定板）上滾落。
[0024] 因此，在很多用于核酸分離的磁性粒子研發(fā)產(chǎn)品中，二氧化娃含量相對(duì)于磁鐵礦 含量更為重要。如W0 01/71732中所述，在存在磁性粒子的情況下對(duì)活性娃±化合物（例 如四己氧基硅烷（TE0巧）進(jìn)行水解可得到二氧化娃粒子，該些二氧化娃粒子可被所夾雜的 磁鐵礦磁化。由于表面的SiOH基團(tuán)密度很大，因此，該種粒子雖然具有良好的核酸結(jié)合能 力和有利的微量滴定板壁潤(rùn)濕特性，但在另一方面，由于磁鐵礦含量減少，粒子的磁性也相 應(yīng)地被大幅削弱。此外，通過(guò)該種方式制成的磁性二氧化娃粒子具有較為不利的形態(tài)特性， 例如其粒度和粒度分布非常不均勻，其中需要指出的是，大體積的非球形粒子在自動(dòng)移液 過(guò)程中可能會(huì)引起堵塞。
[00巧]可萃取成分：
[0026] 用磁性粒子法分離出來(lái)的核酸通常還需接受進(jìn)一步的處理，例如PCR任olymerase ChainReaction，聚合酶鏈反應(yīng)）、TMA(TranscriptionMediatedAmplification，車專錄 介導(dǎo)的擴(kuò)增）、L