用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，包括如下步驟：1)制備Fe3O4磁性納米顆粒；2)配制殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液并混合，得到復(fù)合載體溶液，加入Fe3O4磁性納米顆粒，攪拌，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒；3)配制堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入復(fù)合載體磁性納米顆粒，攪拌，滴加戊二醛水溶液，交聯(lián)?吸附，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶；4)配制植源性蛋白溶液，加入固定化雙酶，制得活性肽；本發(fā)明環(huán)保、價廉，還充分發(fā)揮了兩種蛋白酶復(fù)合的優(yōu)勢，提高了活性肽制備的得率以及抗氧化活性。本發(fā)明制得的復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化酶粒徑小，具有超順磁性。
【專利說明】
用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬制備固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化酶技術(shù)是從均相到多相催化作用的一個范圍轉(zhuǎn)變，原理是通過化學(xué)或物理方法，用載體束縛住酶，或?qū)⒚赶拗圃谝欢▍^(qū)域內(nèi)，使酶在特定區(qū)域內(nèi)實現(xiàn)催化酶解。固定化后的酶可以回收和重復(fù)使用，并使酶在流動系統(tǒng)中的應(yīng)用成為可能。固定化酶通常都會顯示出對pH和溫度較高的穩(wěn)定性，并且在酶解反應(yīng)后，可以將酶和反應(yīng)液分開，實現(xiàn)酶的回收并使產(chǎn)物得到分離和純化。
[0003]磁性載體材料屬于固定化酶技術(shù)中載體的新型材料，磁性粒子可以通過磁性傾析與反應(yīng)液分離，因此其具有穩(wěn)定性高、易回收、可重復(fù)利用等優(yōu)點。相較于磁性粒子，磁性納米顆粒(I?10nm)因其具有獨特的超順磁性、較大的表面積以及表面體積比，并能更好的進行擴散，而得到更加廣泛的關(guān)注和研究。利用磁性納米顆粒的超順磁性，還可以在酶反應(yīng)過程將磁場穩(wěn)定的流動床作為反應(yīng)器，實現(xiàn)連續(xù)性規(guī)?；a(chǎn)。
[0004]米糠蛋白、紅豆蛋白和玉米醇溶蛋白等蛋白，經(jīng)蛋白酶水解后可降解為小分子量的活性肽，其具有抗氧化、降血壓和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性并較于合成藥物具有毒副作用小或無毒副作用的優(yōu)點，因此制備植源性活性肽為研究的熱點?，F(xiàn)有技術(shù)多采用游離蛋白酶或者單一載體固定化單一酶對上述蛋白進行水解，游離蛋白酶在酶解反應(yīng)后需高溫滅活，高溫條件可能會使蛋白或制備的活性肽失活，且游離蛋白酶難以回收，增加了產(chǎn)物后續(xù)純化的難度，并不適宜工業(yè)化生產(chǎn);單一載體固定化單一酶結(jié)合方式單一，吸附不牢固，不夠穩(wěn)定，酶解過程中也會出現(xiàn)水解不夠充分等問題，因此此項技術(shù)也不夠完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法.
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方法概述如下:
[0007]用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，包括如下步驟:
[0008]I)將三價鐵鹽和二價鐵鹽加入水，使二價鐵的摩爾濃度為0.1?1.5M，升溫至75?95 °C，在1200?1500rpm攪拌條件下，滴加氨水，使pH為9?11，磁分離，水洗滌，干燥，得Fe3O4磁性納米顆粒;Fe2+和Fe3+的摩爾比為1:2;
[0009]2)稱取脫乙酰度3 90%的殼聚糖，溶解于加熱的體積濃度為0.5?2%的冰醋酸水溶液，配制I?3mg/mL殼聚糖溶液;稱取多聚磷酸鈉，溶解于去離子水，配制I?2mg/mL多聚磷酸鈉溶液;按殼聚糖和多聚磷酸鈉的質(zhì)量比I?4:1將殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液混合，得到復(fù)合載體溶液，加入所述Fe3(k磁性納米顆粒，1200?1500rpm攪拌20?40min，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒;所述Fe3O4磁性納米顆粒質(zhì)量與復(fù)合載體溶液中殼聚糖和多聚磷酸鈉的總質(zhì)量的比為10:1?5;
[0010]3)配制2?10mg/mL堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入所述復(fù)合載體磁性納米顆粒，在1200?1500rpm攪拌條件下，滴加0.05?I體積倍的體積濃度為I %?5 %戊二醛水溶液，滴加完畢后，在攪拌下交聯(lián)-吸附2?1h，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶;所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的質(zhì)量比為0.5?4:1;所述復(fù)合載體磁性納米顆粒質(zhì)量與堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液中的堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的總質(zhì)量的比為I?8:1。
[0011 ] 4)配制植源性蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH為8?9，加入所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，在50?55 °C條件下反應(yīng)I?2h，制得活性肽;所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶與植源性蛋白的質(zhì)量比為1:4?25。
[0012]三價鐵鹽優(yōu)選為FeCl3.6H20、Fe2(S04)3.9H20或Fe(NO3)3.9H20。
[0013]二價鐵鹽優(yōu)選為FeS04.7H20、FeCl2.4H20或Fe(NO3)2.6H20。
[0014]植源性蛋白溶液為5mg/mL的米糠蛋白水溶液、5mg/mL的紅豆蛋白水溶液或以體積濃度為95 %乙醇水溶液為溶劑的5mg/mL的玉米醇溶蛋白溶液，也可以用其它濃度的蛋白水溶液。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0016]本發(fā)明采用殼聚糖與多聚磷酸鈉進行復(fù)合，并同時固定化堿性蛋白酶和胰蛋白酶，不僅發(fā)揮了天然產(chǎn)物安全、環(huán)保和易得價廉的優(yōu)勢，還充分發(fā)揮了兩種蛋白酶復(fù)合的優(yōu)勢，提高了活性肽制備的得率以及抗氧化活性。本發(fā)明制得的復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化酶粒徑小，具有超順磁性，重復(fù)利用酶解米糠蛋白1次酶活仍達60 %以上。
【附圖說明】
[0017]圖1為復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶在有、無外加磁場下的照片。(a)沒有外加磁場；(b)有外加磁場
[0018]圖2為復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶的磁滯回線。
[0019]圖3為復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶的場發(fā)射透射電子顯微鏡圖。
[0020]圖4為復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶的重復(fù)利用穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的一種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法進行詳細(xì)說明。
[0022]本發(fā)明所用的植源性蛋白是以米糠蛋白、紅豆蛋白和玉米醇溶蛋白為例，但并不對其進行限定，實驗證明，用其它的植源性蛋白為原料，也可以制備出活性肽。
[0023]實施例1
[0024]—種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，包括如下步驟:
[0025]I M^FeCl3.6H20和FeSO4.7H20加入水，使FeSO4.7H20的摩爾濃度為0.1M，F(xiàn)eCl3.6H20的摩爾濃度為0.2M，升溫至80°C，在1200rpm攪拌條件下，滴加體積濃度為25%的氨水，使pH為10，磁分離，水洗滌，干燥，得Fe3O4磁性納米顆粒；
[0026]2)稱取脫乙酰度90 %的殼聚糖，溶解于加熱至60°C的體積濃度為I %的冰醋酸水溶液，配制2mg/mL殼聚糖溶液;稱取多聚磷酸鈉，溶解于去離子水，配制1.5mg/mL多聚磷酸鈉溶液;按殼聚糖和多聚磷酸鈉的質(zhì)量比4:1將殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液混合，得到復(fù)合載體溶液，加入Fe304磁性納米顆粒，15 O Or pm攪拌3 Om in，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒;Fe3O4磁性納米顆粒質(zhì)量與復(fù)合載體溶液中殼聚糖和多聚磷酸鈉的總質(zhì)量的比為4:1;
[0027]3)配制6mg/mL堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶總質(zhì)量的4質(zhì)量倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒，在1500rpm攪拌條件下，滴加0.1體積倍的體積濃度為3 %戊二醛水溶液，滴加完畢后，在攪拌下交聯(lián)-吸附6h，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，測定酶活回收率為79.17% ;所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的質(zhì)量比為3:1;
[0028]4)分別配制濃度為5mg/mL的米糠蛋白溶液、紅豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液，其中米糠蛋白溶液的溶劑和紅豆蛋白溶液的溶劑為去離子水;玉米醇溶蛋白溶液的溶劑是體積濃度為95%乙醇水溶液；調(diào)節(jié)pH分別為9.0,8.0和8.5，分別加入蛋白質(zhì)量0.25倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，在溫度分別為50°C、5(TC和55°C條件下，分別反應(yīng)2h、Ih和2h，制得米糠肽、紅豆肽和玉米肽，三種活性肽的得率分別為58.78%、73.31 %和49.7%，0卩卩!1自由基清除率(0.1711^/11^)分別為12.26%、31.03%和21.39%。
[0029]經(jīng)本發(fā)明制得的復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化酶成均勾球形，粒徑在10?14nm之間，并具有超順磁性，見圖1、2、3。
[0030]實施例2
[0031]—種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，包括如下步驟:
[0032]I)將Fe2(SO4)3.9H20和FeCl2.4H20加入水，使FeCl2.4H20的摩爾濃度為0.5M，F(xiàn)e2(SO4)3.9H20的摩爾濃度為1M，升溫至95°C，在1500rpm攪拌條件下，滴加體積濃度為20%的氨水，使pH為11，磁分離，水洗滌，干燥，得Fe3O4磁性納米顆粒；
[0033]2)稱取脫乙酰度95 %的殼聚糖，溶解于加熱至62°C的體積濃度為2 %的冰醋酸水溶液，配制3mg/mL殼聚糖溶液;稱取多聚磷酸鈉，溶解于去離子水，配制2mg/mL多聚磷酸鈉溶液;按殼聚糖和多聚磷酸鈉的質(zhì)量比3:1將殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液混合，得到復(fù)合載體溶液，加入Fe3(k磁性納米顆粒，1200rpm攪拌40min，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒;所述Fe3O4磁性納米顆粒質(zhì)量與復(fù)合載體溶液中殼聚糖和多聚磷酸鈉的總質(zhì)量的比為10:1;
[0034]3)配制4mg/mL堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶總質(zhì)量的I質(zhì)量倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒，在1300rpm攪拌條件下，滴加0.05體積倍的體積濃度為5 %戊二醛水溶液，滴加完畢后，在攪拌下交聯(lián)-吸附2h，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，測定酶活回收率為75.70%;所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的質(zhì)量比為4:1;
[0035]4)分別配制濃度為5mg/mL的米糠蛋白溶液、紅豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液，其中米糠蛋白溶液的溶劑和紅豆蛋白溶液的溶劑為去離子水;玉米醇溶蛋白溶液的溶劑是體積濃度為95%乙醇水溶液；調(diào)節(jié)pH分別為9.0,8.0和8.5，分別加入蛋白質(zhì)量0.04倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，在溫度分別為50°C、50°C和55°C，分別反應(yīng)2h、lh和2h，制得米糠肽、紅豆肽和玉米肽，三種活性肽的得率分別為54.23 %、72.31 %和51.42 %，DPPH 自由基清除率(0.17mg/mL)分別為11.29 %、30.59 % 和24.53 %。
[0036]實施例3
[0037]—種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，包括如下步驟:
[0038]I)將Fe(NO3)3.9H20和Fe(NO3)2.6H20加入水，使Fe(NO3)2.6H20的摩爾濃度為 1M，F(xiàn)e(NO3)3.9H20的摩爾濃度為2M，升溫至75°C，在1300rpm攪拌條件下，滴加體積濃度為30%的氨水，使pH為9，磁分離，水洗滌，干燥，得Fe3O4磁性納米顆粒；
[0039]2)稱取脫乙酰度95 %的殼聚糖，溶解于加熱至63°C的體積濃度為0.5 %的冰醋酸水溶液，配制lmg/mL殼聚糖溶液;稱取多聚磷酸鈉，溶解于去離子水，配制lmg/mL多聚磷酸鈉溶液;按殼聚糖和多聚磷酸鈉的質(zhì)量比2:1將殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液混合，得到復(fù)合載體溶液，加入Fe304磁性納米顆粒，1300rpm攪拌40min，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒;所述Fe3O4磁性納米顆粒質(zhì)量與復(fù)合載體溶液中殼聚糖和多聚磷酸鈉的總質(zhì)量的比為2:1;
[0040]3)配制I Omg/mL堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶總質(zhì)量的8質(zhì)量倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒，在1200rpm攪拌條件下，滴加0.5體積倍的體積濃度為2 %戊二醛水溶液，滴加完畢后，在攪拌下交聯(lián)-吸附Sh，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，測定酶活回收率為73.30%;所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的質(zhì)量比為1:2;
[0041 ] 4)分別配制濃度為5mg/mL的米糠蛋白溶液、紅豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液，其中米糠蛋白溶液的溶劑和紅豆蛋白溶液的溶劑為去離子水;玉米醇溶蛋白溶液的溶劑是體積濃度為95%乙醇水溶液;調(diào)節(jié)pH分別為9.0,8.0和8.5，分別加入蛋白質(zhì)量0.1倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，在溫度分別為50 0C、50 0C和55 0C，分別反應(yīng)2h、Ih和2h，制得米糠肽、紅豆肽和玉米肽，三種活性肽的得率分別為57.46%,72.83%和54.45% ,DPPH自由基清除率(0.17mg/mL)分別為 13.74%、29.29% 和 25.09%。
[0042]實施例4
[0043]—種用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，包括如下步驟:
[0044]I ^FeCl3.6Η20和FeSO4.7Η20加入水，使FeSO4.7Η20的摩爾濃度為1.5Μ，F(xiàn)eCl3.6Η20的摩爾濃度為3Μ，升溫至85°C，在1200rpm攪拌條件下，滴加體積濃度為50%的氨水，使pH為11，磁分離，水洗滌，干燥，得Fe3O4磁性納米顆粒；
[0045]2)稱取脫乙酰度95 %的殼聚糖，溶解于加熱至65°C的體積濃度為I %的冰醋酸水溶液，配制2mg/mL殼聚糖溶液;稱取多聚磷酸鈉，溶解于去離子水，配制1.5mg/mL多聚磷酸鈉溶液;按殼聚糖和多聚磷酸鈉的質(zhì)量比1:1將殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液混合，得到復(fù)合載體溶液，加入Fe304磁性納米顆粒，15 O Or pm攪拌2 Om in，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒;所述Fe3O4磁性納米顆粒質(zhì)量與復(fù)合載體溶液中殼聚糖和多聚磷酸鈉的總質(zhì)量的比為5:2;
[0046]3)配制2mg/mL堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶總質(zhì)量的5質(zhì)量倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒，在1500rpm攪拌條件下，滴加I體積倍的體積濃度為I %戊二醛水溶液，滴加完畢后，在攪拌下交聯(lián)-吸附1h，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，測定酶活回收率為76.19%；所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的質(zhì)量比為2:1;
[0047]4)分別配制濃度為5mg/mL的配制米糠蛋白溶液、紅豆蛋白溶液和玉米醇溶蛋白溶液濃度為5mg/mL，其中米糠蛋白溶液的溶劑和紅豆蛋白溶液的溶劑為去離子水;玉米醇溶蛋白溶液的溶劑是體積濃度為95%乙醇水溶液;調(diào)節(jié)pH分別為9.0,8.0和8.5，分別加入蛋白質(zhì)量0.05倍的所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，在溫度分別為50 0C、50 0C和55 °C，分別反應(yīng)2h、Ih和2h，制得米糠肽、紅豆肽和玉米肽，三種活性肽的得率分別為55.66%,76.53%和49.49% ,DPPHg 由基清除率(0.17mg/mL)分別為 12.53%、32.19%、22.57%。
[0048]由各實施例結(jié)果可以看出，本發(fā)明制得的復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶具有良好的應(yīng)用特性，制得的米糠肽、紅豆肽和玉米肽的得率和抗氧化活性較游離酶制得的活性肽高。實施例5
[0049]按照實施例1中步驟4)所述條件用游離蛋白酶分別對米糠蛋白、紅豆蛋白和玉米醇溶蛋白進行酶解:
[0050]配制5g/10mL米糠蛋白水溶液、紅豆蛋白水溶液和玉米醇溶蛋白溶液(溶劑是體積濃度為95 %乙醇水溶液)各20mL，加入45mg堿性蛋白酶和15mg胰蛋白酶，分別在50 °C、50°C和550C，反應(yīng)pH分別為9.0、8.0和8.5的條件下，分別反應(yīng)2h、Ih和2h，制得米糠肽、紅豆肽和玉米肽，三種活性肽的得率分別為50.23%、64.10%和44.30%，DPPH自由基清除率(0.1711^/11^)分別為9.10%、23.00%和20.01%。
[0051]本發(fā)明人對實施例1步驟3)所制得的復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶的重復(fù)利用性進行了研究，采用實施例中酶解條件，對米糠蛋白進行酶解，在相同的酶解條件下，本發(fā)明制得的復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶重復(fù)酶解米糠蛋白10次后，酶活仍達60%以上，見圖4。
[0052]DPPH.自由基清除活性的測定:在10yL 5mg/mL所述三種活性肽溶液(空白用100yL蒸餾水代替，其他試劑依次同下)中，加入2.9mL的20μΜ DPPH.乙醇溶液，充分混勻，在37°〇水浴條件下反應(yīng)30min，(樣品最終體系濃度為0.17mg/mL)，反應(yīng)液于517nm測定吸光度值。DPPH.自由基清除率的計算公式如下:
[0053]I% = [(A空-A樣)/A空]X 100
[0054]A空為空白對照的吸光度，A樣為樣品的吸光度。
【主權(quán)項】
1.用復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶制備活性肽的方法，其特征是包括如下步驟: 1)將三價鐵鹽和二價鐵鹽加入水，使二價鐵的摩爾濃度為0.1?1.5M，升溫至75?950C，在1200?1500rpm攪拌條件下，滴加氨水，使pH為9?11，磁分離，水洗滌，干燥，得Fe304磁性納米顆粒;Fe2+和Fe3+的摩爾比為1:2; 2)稱取脫乙酰度390 %的殼聚糖，溶解于加熱的體積濃度為0.5?2 %的冰醋酸水溶液，配制I?3mg/mL殼聚糖溶液;稱取多聚磷酸鈉，溶解于去離子水，配制I?2mg/mL多聚磷酸鈉溶液;按殼聚糖和多聚磷酸鈉的質(zhì)量比I?4:1將殼聚糖溶液和多聚磷酸鈉溶液混合，得到復(fù)合載體溶液，加入所述Fe3(k磁性納米顆粒，1200?1500rpm攪拌20?40min，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒;所述Fe3O4磁性納米顆粒質(zhì)量與復(fù)合載體溶液中殼聚糖和多聚磷酸鈉的總質(zhì)量的比為10:1?5; 3)配制2?1mg/mL堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液，加入所述復(fù)合載體磁性納米顆粒，在1200?1500rpm攪拌條件下，滴加0.05?I體積倍的體積濃度為I %?5%戊二醛水溶液，滴加完畢后，在攪拌下交聯(lián)-吸附2?1h，磁分離，水洗滌，干燥，得復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶;所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的質(zhì)量比為0.5?4:1;所述復(fù)合載體磁性納米顆粒質(zhì)量與堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶混合溶液中的堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶的總質(zhì)量的比為I?8:1。 4)配制植源性蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH為8?9，加入所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶，在50?55 °C條件下反應(yīng)I?2h，制得活性肽;所述復(fù)合載體磁性納米顆粒固定化雙酶與植源性蛋白的質(zhì)量比為1:4?25。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是所述三價鐵鹽為FeCl3.6H20,Fe2(SO4)3.9H20或Fe(NO3)3.9H20o3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是所述二價鐵鹽為FeSO4.7H20,FeCl2.4H20或Fe(NO3)2.6H20o4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征是步驟4)中所述植源性蛋白溶液為5mg/mL的米糠蛋白水溶液、5mg/mL的紅豆蛋白水溶液或以體積濃度為95%乙醇水溶液為溶劑的5mg/mL的玉米醇溶蛋白溶液。
【文檔編號】C12N11/02GK106011206SQ201610334043
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】陳海霞, 王秀明, 李淑琴
【申請人】天津大學(xué)