一種基于Au-Fe₃O₄@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米功能材料、免疫分析以及生物傳感技術領域，提供了一種基于Au?Fe3O4@Pd?ZIF?8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法及應用。采用Au?Fe3O4@Pd?ZIF?8作為檢測抗體標記物制備的電化學免疫傳感器具有特異性強，靈敏度高和檢出限低等優(yōu)點，對腫瘤標志物CEA、CA125的檢測具有重要的科學意義和應用價值。
【專利說明】一種基于Au-Fe304@Pd-Z IF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法及應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料、免疫分析以及生物傳感技術領域，提供了一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤的發(fā)病率高，生長和轉移速度快，對人類的健康有極大的危害。腫瘤標記物是腫瘤細胞產生和釋放的以抗原、酶、激素等形式的代謝產物存在于腫瘤細胞內或宿主體液中，其在臨床上對于隨原發(fā)腫瘤的發(fā)現(xiàn)，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀察和評價及腫瘤復發(fā)和預后的預測產生極大的影響，引起人們的廣泛關注。
[0003]CA125、CEA等常見的腫瘤標志物，對于肝癌的診斷都能起到一定的作用。對于腫瘤標記物的檢測方法很多，但多數檢測方法繁瑣，操作復雜，費用昂貴，檢出限高，因此，建立一種快速、簡便、靈敏的檢測方法有重要意義。
[0004]夾心型電化學免疫傳感器結合了高特異性的免疫分析技術和高靈敏的電化學分析技術，具有靈敏度高、制備簡單、檢測快速、成本低、等優(yōu)點，在臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制、生物監(jiān)測等領域都有重要的應用價值。而構建電化學免疫傳感器的關鍵有兩點:其一是采用簡單、快速、有效的方法將抗原抗體等生物分子固定在電極表面;其二是開發(fā)傳感器的信號放大技術。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法及應用，實現(xiàn)了對肝癌腫瘤標志物CEA、CA125的高靈敏檢測。
[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之二是將所制備的Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器，用于腫瘤標志物的靈敏檢測。
[0008]本發(fā)明的技術方案，包括以下步驟。
[0009]1.一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF_8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將6燦、1?3mg/mL的AuOGO-Th滴涂到用Al2O3拋光粉打磨成鏡面的直徑為4 mm的玻碳電極的表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；
(2)繼續(xù)將6汕、8?12ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3 uL、質量分數為0.5?2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干； (5)滴加6yL、0.1pg/mL?50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)繼續(xù)將6仙、1?5mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液滴加到電極表面，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Au-Fe3O4OPd-ZIF-S標記的夾心型免疫傳感器。
[0010] 2.所述的AuOGO-Th、Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，制備步驟如下:
(1)AuOGO-Th的制備
1)Au納米粒子的制備
在99 mL超純水中加入I 1^、質量分數為1%的說11(:14，加熱至沸騰，然后加入2.5?3.5mL、質量分數為1%的檸檬酸酸三鈉，加熱至溶液顏色變成深紅色，繼續(xù)加熱15?25 min，冷卻至室溫得到Au納米粒子溶液；
2)G0-Th納米復合物的制備
將0.8 ~ 1.2 mg的氧化石墨稀加入ImL超純水中，充分攪拌，加入lmL、Immol硫堇，室溫下攪拌36?48 h,離心分離，超純水洗滌三次，得到GO-Th納米復合物，35°C真空干燥12h，備用;
3)Au@G0-Th的制備
將10?15 mg GO-Th溶解到上述制備的20mL的Au納米粒子溶液中，室溫下攪拌12 h，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得AuOGO-Th;
(2)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備
DPdNPs的制備
將65?70 g聚乙烯吡咯烷酮，20 mL無水乙醇，50 mL超純水，30 mL、2?3 mmol/L的H2PdCI6在燒瓶中混合，室溫下反應3 h;利用旋轉蒸發(fā)除去乙醇和水，所得Pd納米粒子溶解于40?60mL丙酮溶液中，離心分離，分別用氯仿和己烷洗滌三次除去剩余的聚乙烯吡咯烷酮，60°C真空干燥12 M^UPdNPs;以甲醇為溶劑，制成0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液備用；
2)Pd-ZIF-8的制備
將10 mL、0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液，130?170 mL、25 mmol/L的2-甲基咪唑甲醇溶液，140?160 mL、25 mmol/L的Zn(NO3)2.6H20甲醇溶液混合，室溫反應24 h，離心分離，用甲醇洗滌三次，35° C真空干燥12 h，制得Pd-ZIF-8;
3)磁性Fe304@Pd-ZIF-8的制備及氨基化
稱取2.5 - 2.9 8的？6(:13.6出0加到70!1^乙二醇中，再加入7.0 g NaAc，25 mL三乙胺和2.5 g Pd-ZIF-8，室溫下磁力攪拌30?40 min，后轉移至不銹鋼高壓反應釜中，加熱到200°C保持8?10 h，冷卻至室溫，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得磁性的 Fe304@Pd-ZIF-8;
稱取0.1?0.2 g的Fe304@Pd-ZIF-8溶解到含有ImL氨丙基三乙氧基硅烷的1mL乙醇溶液中，油浴加熱至65?75°(:，磁力攪拌1.5 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得氨基化
Fe304@Pd_ZIF_8 ；
4)Au-Fe304@Pd-ZIF_8.取I?2 mL上述制備的Au納米粒子溶液與2 mL、2 mg/mL的氨基化Fe304@Pd-ZIF_8溶液混合，室溫下振蕩24 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得Au-Fe304@Pd-ZIF-8;
5)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備將6?10 mg的Au-Fe304@Pd-ZIF-8分散到I mL超純水中，加入I mL、20 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12?24 h，離心分離，所得固體分散于I3BS溶液中，制成I?5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，儲存于4 °C冰箱中備用。
[0011]3.腫瘤標志物的檢測，步驟如下:
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0?9.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對腫瘤標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 S，運行時間400 s；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0012]所述腫瘤標志物選自下列之一:CA125、CEA。
[0013]本發(fā)明所用原材料均可在化學試劑公司或生物制藥公司購買。
[0014]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明使用金雜化的硫堇石墨烯作為基底材料，硫堇的存在大大提高了石墨烯的分散性，金納米粒子具有良好的催化性能及生物相容性，以及良好的導電能力，與石墨烯結合能夠很好的固載捕獲抗體，并能加速電子的傳遞，對于實現(xiàn)傳感器的高靈敏度以及低檢測限具有重要意義。
[0015](2)采用Au-Fe304@Pd-ZIF-8作為檢測抗體標記物，Pd、Fe304、Au具有良好的導電能力以及對過氧化氫有催化作用，ZIF-8是典型的沸石咪唑酯骨架結構材料，與Pd結合，形成以Pd為中心的MOFs材料，具有表面積大催化性好等特點，材料表面負載Fe3O4納米粒子，增加了催化性能，從而可以實現(xiàn)電化學信號的多重協(xié)同放大，因此提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測限；
(3)—種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器對CA125的檢測，其線性范圍0.1 pg/mL?50 ng/mL，檢測限最低0.03 pg/mL;對CEA進行檢測，其線性范圍為0.Ipg/mL?45 ng/mL，檢測限為0.03 pg/mL。表明基于Au-Fe304@Pd-ZIF_8標記的夾心型免疫傳感器可以達到準確測定腫瘤標志物的目的。
【具體實施方式】
[0016]現(xiàn)將本發(fā)明通過【具體實施方式】進一步說明，但不限于此。
[0017]實施例1 一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將6uL、l mg/mL的AuOGO-Th滴涂到用Al2O3拋光粉打磨成鏡面的直徑為4 mm的玻碳電極的表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；
(2)繼續(xù)將6tiL、8 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3uL、質量分數為0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干； (5)滴加6yL、0.1pg/mL?50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)繼續(xù)將6yL、I mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液滴加到電極表面，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器。
[0018]實施例2—種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將6uL、2 mg/mL的AuOGO-Th滴涂到用Al2O3拋光粉打磨成鏡面的直徑為4 mm的玻碳電極的表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；
(2)繼續(xù)將6uL、10 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3uL、質量分數為1.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6yL、0.1pg/mL?50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)繼續(xù)將6uL、3 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液滴加到電極表面，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器。
[0019]實施例3—種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將6uL、3 mg/mL的AuOGO-Th滴涂到用Al2O3拋光粉打磨成鏡面的直徑為4 mm的玻碳電極的表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；
(2)繼續(xù)將6uL、12 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)繼續(xù)將3uL、質量分數為2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(5)滴加6yL、0.1pg/mL?50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥；
(6)繼續(xù)將6uL、5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液滴加到電極表面，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器。
[0020]實施例4所述的Au@G0-Th、Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，制備步驟如下:
(I)AuOGO-Th的制備
1)Au納米粒子的制備
在99 mL超純水中加入I 1^、質量分數為1%的說11(:14，加熱至沸騰，然后加入2.5 mL、質量分數為1%的檸檬酸酸三鈉，加熱至溶液顏色變成深紅色，繼續(xù)加熱15 min，冷卻至室溫得到Au納米粒子溶液；
2)G0-Th納米復合物的制備
將0.8 mg的氧化石墨稀加入I mL超純水中，充分攪拌，加入I mL、l mmol硫堇，室溫下攪拌36 h,離心分離，超純水洗滌三次，得到GO-Th納米復合物，35°C真空干燥12 h，備用；
3)Au@G0-Th的制備將10 mg GO-Th溶解到上述制備的20mL的Au納米粒子溶液中，室溫下攪拌12 h，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得AuOGO-Th;
(2)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備
DPdNPs的制備
將65g聚乙烯吡咯烷酮，20 mL無水乙醇，50 mL超純水，30 mL、2 mmol/L的H2PdCI6在燒瓶中混合，室溫下反應3 h;利用旋轉蒸發(fā)除去乙醇和水，所得Pd納米粒子溶解于40 mL丙酮溶液中，離心分離，分別用氯仿和己烷洗滌三次除去剩余的聚乙烯吡咯烷酮，60°C真空干燥12 h得到PdNPs;以甲醇為溶劑，制成0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液備用；
2)Pd-ZIF-8的制備
將10 mL、0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液，130 mL、25 mmol/L的2-甲基咪唑甲醇溶液，140 mL、25 mmol/L的Zn(NO3)2.6H20甲醇溶液混合，室溫反應24 h，離心分離，用甲醇洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得Pd-ZIF-8;
3)磁性Fe304@Pd-ZIF-8的制備及氨基化
稱取2.5 8的？6(:13.6出0加到7011^乙二醇中，再加入7.0 g NaAc,25 mL三乙胺和2.5 gPd-ZIF-8，室溫下磁力攪拌30 min，后轉移至不銹鋼高壓反應釜中，加熱到200°C保持8 h，冷卻至室溫，離心分離，超純水洗滌三次，35° C真空干燥12 h，制得磁性的Fe304@Pd-ZIF-8;
稱取0.1 g的Fe304@Pd-ZIF-8溶解到含有ImL氨丙基三乙氧基硅烷的1mL乙醇溶液中，油浴加熱至65° C，磁力攪拌1.5 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得氨基化Fe304@Pd-ZIF-8;
4)Au-Fe304@Pd-ZIF_8.取I mL上述制備的Au納米粒子溶液與2 mL、2 mg/mL的氨基化Fe304@Pd-ZIF_8溶液混合，室溫下振蕩24 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得Au-Fe304@Pd-ZIF-8;
5)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備
將6 mg的Au-Fe304@Pd-ZIF-8分散到I mL超純水中，加入I mL、20 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h，離心分離，所得固體分散于PBS溶液中，制成I?5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，儲存于4 °C冰箱中備用。
[0021 ] 實施例5所述的Au@G0-Th、Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，制備步驟如下:
(I)AuOGO-Th的制備
1)Au納米粒子的制備
在99 mL超純水中加入I !1^、質量分數為1%的說11(:14，加熱至沸騰，然后加入3.0 mL、質量分數為1%的檸檬酸酸三鈉，加熱至溶液顏色變成深紅色，繼續(xù)加熱20 min，冷卻至室溫得到Au納米粒子溶液；
2)G0-Th納米復合物的制備
將1.0 mg的氧化石墨稀加入ImL超純水中，充分攪拌，加入lmL、lmmol硫堇，室溫下攪拌40 h,離心分離，超純水洗滌三次，得到GO-Th納米復合物，35°C真空干燥12 h，備用；
3)Au@G0-Th的制備
將12.5 mg GO-Th溶解到上述制備的20mL的Au納米粒子溶液中，室溫下攪拌12 h，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得AuOGO-Th; (2)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備
DPdNPs的制備
將67.5 g聚乙烯吡咯烷酮，20 mL無水乙醇，50 mL超純水，30 mL、2.5 mmol/L的H2PdCI6在燒瓶中混合，室溫下反應3 h;利用旋轉蒸發(fā)除去乙醇和水，所得Pd納米粒子溶解于50 mL丙酮溶液中，離心分離，分別用氯仿和己烷洗滌三次除去剩余的聚乙烯吡咯烷酮，60°C真空干燥12 M^UPdNPs;以甲醇為溶劑，制成0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液備用；
2)Pd-ZIF-8的制備
將10 mL、0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液，150 mL、25 mmol/L的2-甲基咪唑甲醇溶液，150 mL、25 mmol/L的Zn(NO3)2.6H20甲醇溶液混合，室溫反應24 h，離心分離，用甲醇洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得Pd-ZIF-8;
3)磁性Fe304@Pd-ZIF-8的制備及氨基化
稱取2.7 8的？6(:13.6出0加到7011^乙二醇中，再加入7.0 g NaAc,25 mL三乙胺和2.5 gPd-ZIF-8，室溫下磁力攪拌35 min，后轉移至不銹鋼高壓反應釜中，加熱到200°C保持9 h，冷卻至室溫，離心分離，超純水洗滌三次，35° C真空干燥12 h，制得磁性的Fe304@Pd-ZIF-8;
稱取0.15 g的Fe304@Pd-ZIF-8溶解到含有ImL氨丙基三乙氧基硅烷的1mL乙醇溶液中，油浴加熱至70°C，磁力攪拌1.5 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得氨基化Fe3O4OPd-ZIF-8；
4)Au-Fe304@Pd-ZIF_8.取1.5 mL上述制備的Au納米粒子溶液與2 mL、2 mg/mL的氨基化Fe304@Pd-ZIF_8溶液混合，室溫下振蕩24 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得Au-Fe304@Pd-ZIF-8;
5)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備
將8 mg的Au-Fe304@Pd-ZIF-8分散到I mL超純水中，加入I mL、20 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化18 h，離心分離，所得固體分散于PBS溶液中，制成I?5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，儲存于4 °C冰箱中備用。
[0022] 實施例6所述的Au@G0-Th、Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，制備步驟如下:
(1)AuOGO-Th的制備
1)Au納米粒子的制備
在99 mL超純水中加入I 1^、質量分數為1%的說11(:14，加熱至沸騰，然后加入3.5 mL、質量分數為1%的檸檬酸酸三鈉，加熱至溶液顏色變成深紅色，繼續(xù)加熱25 min，冷卻至室溫得到Au納米粒子溶液；
2)G0-Th納米復合物的制備
將1.2 mg的氧化石墨稀加入ImL超純水中，充分攪拌，加入lmL、lmmol硫堇，室溫下攪拌48 h,離心分離，超純水洗滌三次，得到GO-Th納米復合物，35°C真空干燥12h，備用；
3)Au@G0-Th的制備
將15 mg GO-Th溶解到上述制備的20mL的Au納米粒子溶液中，室溫下攪拌12 h，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得AuOGO-Th;
(2)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備 DPdNPs的制備
將70 g聚乙烯吡咯烷酮，20 mL無水乙醇，50 mL超純水，30 mL、3 mmol/L的H2PdCI6在燒瓶中混合，室溫下反應3 h;利用旋轉蒸發(fā)除去乙醇和水，所得Pd納米粒子溶解于60 mL丙酮溶液中，離心分離，分別用氯仿和己烷洗滌三次除去剩余的聚乙烯吡咯烷酮，60°C真空干燥12 h得到PdNPs;以甲醇為溶劑，制成0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液備用；
2)Pd-ZIF-8的制備
將10 mL、0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液，170 mL、25 mmol/L的2-甲基咪唑甲醇溶液，160 mL、25 mmol/L的Zn(NO3)2.6H20甲醇溶液混合，室溫反應24 h，離心分離，用甲醇洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得Pd-ZIF-8;
3)磁性Fe304@Pd-ZIF-8的制備及氨基化
稱取2.9 8的？6(:13.6出0加到7011^乙二醇中，再加入7.0 g NaAc,25 mL三乙胺和2.5 gPd-ZIF-8，室溫下磁力攪拌40 min，后轉移至不銹鋼高壓反應釜中，加熱到200° C保持10 h，冷卻至室溫，離心分離，超純水洗滌三次，35° C真空干燥12 h，制得磁性的Fe304@Pd-ZIF-8;
稱取0.2 g的Fe304@Pd-ZIF-8溶解到含有ImL氨丙基三乙氧基硅烷的1mL乙醇溶液中，油浴加熱至75° C，磁力攪拌1.5 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得氨基化Fe304@Pd-ZIF-8;
4)Au-Fe304@Pd-ZIF_8.取2 mL上述制備的Au納米粒子溶液與2 mL、2 mg/mL的氨基化Fe304@Pd-ZIF_8溶液混合，室溫下振蕩24 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得Au-Fe304@Pd-ZIF-8;
5)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備
將10 mg的Au-Fe304@Pd-ZIF-8分散到I mL超純水中，加入I mL、20 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化24 h，離心分離，所得固體分散于PBS溶液中，制成I?5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，儲存于4 °C冰箱中備用。
[0023]實施例7腫瘤標志物CA125的檢測，步驟如下:
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0?9.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對腫瘤標志物CA125進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 S，運行時間400 s；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化；
(4)采用標準曲線法，測定樣品中CA125的線性范圍為0.1pg/mL?50 ng/mL，檢測限為0.03 pg/mLο
[0024]實施例8腫瘤標志物CEA的檢測
按照實施例7的方法對樣品中CEA進行檢測，其線性范圍為0.1 pg/mL?45 ng/mL，檢測限為0.03 pg/mL ο
【主權項】
1.一種基于Au-Fe3O4OPd-ZIF-S標記的夾心型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)將6汕、1?3mg/mL的AuOGO-Th滴涂到用Al2O3拋光粉打磨成鏡面的直徑為4 mm的玻碳電極的表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干； (2)繼續(xù)將6tiL、8?12 ug/mL的腫瘤標志物捕獲抗體Ab1溶液孵化到電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (4)繼續(xù)將3uL、質量分數為0.5?2.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干； (5)滴加6yL、0.1pg/mL?50 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原Ag溶液到電極表面，超純水沖洗，4 V冰箱中干燥； (6)繼續(xù)將6uL、l?5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液滴加到電極表面，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Au-Fe3O4OPd-ZIF-S標記的夾心型免疫傳感器。2.如權利要求1所述的一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法，所述Au@G0-Th、Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，制備步驟如下: (I)AuOGO-Th的制備 1)Au納米粒子的制備 在99 mL超純水中加入I 1!^、質量分數為1%的說11(:14，加熱至沸騰，然后加入2.5?3.5mL、質量分數為1%的檸檬酸酸三鈉，加熱至溶液顏色變成深紅色，繼續(xù)加熱15?25 min，冷卻至室溫得到Au納米粒子溶液； 2)G0-Th納米復合物的制備 將0.8?1.2 mg的氧化石墨稀加入ImL超純水中，充分攪拌，加入lmL、lmmol硫堇，室溫下攪拌36?48 h,離心分離，超純水洗滌三次，得到GO-Th納米復合物，35°C真空干燥12h，備用; 3) AuOGO-Th的制備 將10?15 mg GO-Th溶解到上述制備的20mL的Au納米粒子溶液中，室溫下攪拌12 h，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得AuOGO-Th; (2 )Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備 DPdNPs的制備 將65?70 g聚乙烯吡咯烷酮，20 mL無水乙醇，50 mL超純水，30 mL、2?3 mmol/L的H2PdCI6在燒瓶中混合，室溫下反應3 h;利用旋轉蒸發(fā)除去乙醇和水，所得Pd納米粒子溶解于40?60mL丙酮溶液中，離心分離，分別用氯仿和己烷洗滌三次除去剩余的聚乙烯吡咯烷酮，60°C真空干燥12 M^UPdNPs;以甲醇為溶劑，制成0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液備用； 2)Pd-ZIF-8的制備 將10 mL、0.25 mg/mL的PdNPs甲醇溶液，130?170 mL、25 mmol/L的2-甲基咪唑甲醇溶液，140?160 mL、25 mmol/L的Zn(NO3)2.6H20甲醇溶液混合，室溫反應24 h，離心分離，用甲醇洗滌三次，35° C真空干燥12 h，制得Pd-ZIF-8; 3)磁性Fe304@Pd-ZIF-8的制備及氨基化 稱取2.5 - 2.9 8的？6(:13.6出0加到70!1^乙二醇中，再加入7.0 g NaAc，25 mL三乙胺和2.5 g Pd-ZIF-8，室溫下磁力攪拌30?40 min，后轉移至不銹鋼高壓反應釜中，加熱到200°C保持8?10 h，冷卻至室溫，離心分離，超純水洗滌三次，35°C真空干燥12 h，制得磁性的 Fe304@Pd-ZIF-8; 稱取0.1?0.2 g的Fe304@Pd-ZIF-8溶解到含有ImL氨丙基三乙氧基硅烷的1mL乙醇溶液中，油浴加熱至65?75°(:，磁力攪拌1.5 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得氨基化Fe3O4OPd-ZIF-8； 4)Au-Fe304@Pd-ZIF_8.取I?2 mL上述制備的Au納米粒子溶液與2 mL、2 mg/mL的氨基化Fe304@Pd-ZIF_8溶液混合，室溫下振蕩24 h，磁分離，超純水洗滌三次，制得Au-Fe304@Pd-ZIF-8; 5)Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液的制備 將6?10 mg的Au-Fe304@Pd-ZIF-8分散到I mL超純水中，加入I mL、20 yg/mL的腫瘤標志物檢測抗體Ab2溶液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12?24 h，離心分離，所得固體分散于I3BS溶液中，制成I?5 mg/mL的Au-Fe304@Pd-ZIF-8-Ab2捕獲抗體孵化物溶液，儲存于4 C冰箱中備用。3.如權利要求1所述的一種基于Au-Fe304@Pd-ZIF-8標記的夾心型免疫傳感器的制備方法制備的免疫傳感器，用于腫瘤標志物的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.0?9.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法對腫瘤標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 S，運行時間400 s； (3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。4.如權利要求1、2、3所述的腫瘤標志物，選自CEA或CA125。
【文檔編號】G01N33/532GK106018806SQ201610301770
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】李月云, 王平, 董云會, 馮金慧, 劉會, 劉青, 陳磊
【申請人】山東理工大學