一種免疫層析檢測磁性顆粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種免疫層析檢測磁性顆粒及其制作方法，首先通過氧化還原反應(yīng)制備大顆粒的磁流體，磁流體經(jīng)低濃度的鹽酸和硝酸混和液體處理后，形成顆粒更小的磁性膠體顆粒，膠體顆粒經(jīng)清洗后重懸于雙蒸水中。該顆?？梢酝ㄟ^靜電結(jié)合抗體等功能蛋白，經(jīng)封閉后可用于側(cè)向?qū)游鰴z測，該功能磁性顆粒可在試紙條上顯示紅色的線條。可將適量的該功能磁性顆粒添加到被檢測溶液中，經(jīng)反應(yīng)后，通過磁性富集功能磁性顆粒，最后將富集到的顆粒添加到試紙條上側(cè)向?qū)游觯^察對應(yīng)區(qū)域的顏色判讀。
【專利說明】
一種免疫層析檢測磁性顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子檢測的領(lǐng)域，具體涉及一種食品、藥品和化妝品等復(fù)雜樣品中分子便捷分離檢測的免疫層析檢測磁性顆粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析法是二十世紀(jì)八十年代興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗原或抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷?，F(xiàn)在市場上最常用的是膠體金免疫層析試紙，該類試紙條能在特定區(qū)域固定膠體金物質(zhì)，從而顯示紅色的線條，裸眼快速判讀結(jié)果。近年也興起了一些熒光物質(zhì)微球作為指示物質(zhì)的試紙條，該類試紙條在靈敏度方面較膠體金試紙條有較大提升，但由于試紙條上樣量有限，只能檢測60-100ul樣本體系，難以實(shí)現(xiàn)低豐度物質(zhì)的大體系檢測。采用磁性顆粒可實(shí)現(xiàn)大體積中靶標(biāo)物的快速便捷富集，但常見的磁性顆粒較大，表面電荷少，難以在硝酸纖維素膜上實(shí)現(xiàn)層析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述問題，本發(fā)明提供了一種免疫層析檢測磁性顆粒及其制備方法。
[0004]本發(fā)明通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種免疫層析檢測磁性顆粒，所述免疫層析檢測磁性顆粒采用氧化還原法、水熱法制備磁流體后，經(jīng)低濃度的鹽酸和硝酸混和液體處理后，再加入氯化鈉破壞膠體后磁性回收，最后重懸于雙蒸水中。
[0005]優(yōu)選的，所述酸化溶液為鹽酸、硝酸、硫酸、碳酸、磷酸、草酸、次氯酸或其混合溶液。
[0006]優(yōu)選的，所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面通過靜電包被有抗體、核酸適配體或親和素特異結(jié)合靶標(biāo)物，并通過牛血清蛋白、甘氨酸物質(zhì)封閉表面裸露位點(diǎn)。
[0007]優(yōu)選的，所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面通過靜電包被代用功能基團(tuán)的多聚物，經(jīng)過清洗后再通過固定在表面的功能基團(tuán)與功能物質(zhì)結(jié)合。
[0008]優(yōu)選的，所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面包裹有復(fù)合磁性顆粒。
[0009]優(yōu)選的，所述復(fù)合磁性顆粒包括膠體金、帶有負(fù)電荷的量子點(diǎn)、熒光顆粒或熒光上轉(zhuǎn)換顆粒物。
[0010]一種免疫層析檢測磁性顆粒制作方法，包括如下的步驟:
(1)在500ml燒杯中加入30ml的0.8M的氯化亞鐵溶液，20ml的0.8M的氯化鐵溶液，加入雙蒸水至250ml，300RPM/min攪拌；
(2)緩慢在溶液中加入IM氫氧化鈉溶液10ml，5_8分鐘加完，持續(xù)攪拌30分鐘；
(3)將所得的溶液70度處理30分鐘； (4)將(3)所得的磁流體磁性富集，去除溶液，加入300ml雙蒸水清洗2次，用雙蒸水定容與400ml；
(5)在(4)所得的溶液中加入0.1M鹽酸和0.05M硝酸配制的10m酸化溶液攪拌I小時(shí)；
(6 )在(5 )所得的溶液中加入20克的氯化鈉，充分溶解；
(7)除掉液體成分，將產(chǎn)物定容于500ml雙蒸水中；
(8)取10ul上步驟總所得溶液，用雙蒸水稀釋100倍待用；
(9 )取Iml步驟(8 )所得溶液，加入5ug抗體，混勻后，搖床混勻1分鐘；
(1 )在步驟(9 )所得溶液中加入I OOu I 10%的牛血清蛋白，混勻后，搖床混勻1分鐘；
(11)磁性富集顆粒，充分去除液體，制得磁性顆粒。
[0011]本發(fā)明揭示一種免疫層析檢測磁性顆粒的制作方法，首先通過氧化還原反應(yīng)制備大顆粒的磁流體，磁流體經(jīng)低濃度的鹽酸和硝酸混和液體處理后，形成顆粒更小的磁性膠體顆粒，膠體顆粒經(jīng)清洗后重懸于雙蒸水中。該顆?？梢酝ㄟ^靜電結(jié)合抗體等功能蛋白，經(jīng)封閉后可用于側(cè)向?qū)游鰴z測，該功能磁性顆粒可在試紙條上顯示紅色的線條。可將適量的該功能磁性顆粒添加到被檢測溶液中，經(jīng)反應(yīng)后，通過磁性富集功能磁性顆粒，最后將富集到的顆粒添加到試紙條上側(cè)向?qū)游?，觀察對應(yīng)區(qū)域的顏色判讀，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜體系中分子的便捷純化和高敏檢測，可應(yīng)用于食品安全、分子診斷等領(lǐng)域，有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明中免疫層析檢測磁性顆粒的制備和原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例的限制。
[0014]實(shí)施例1
一種免疫層析檢測磁性顆粒，所述免疫層析檢測磁性顆粒采用氧化還原法、水熱法制備磁流體后，經(jīng)低濃度的鹽酸和硝酸混和液體處理后，再加入氯化鈉破壞膠體后磁性回收，最后重懸于雙蒸水中；所述酸化溶液為鹽酸、硝酸、硫酸、碳酸、磷酸、草酸、次氯酸或其混合溶液;所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面通過靜電包被有抗體、核酸適配體或親和素特異結(jié)合靶標(biāo)物，并通過牛血清蛋白、甘氨酸物質(zhì)封閉表面裸露位點(diǎn);所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面通過靜電包被代用功能基團(tuán)的多聚物，經(jīng)過清洗后再通過固定在表面的功能基團(tuán)與功能物質(zhì)結(jié)合;所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面包裹有復(fù)合磁性顆粒;所述復(fù)合磁性顆粒包括膠體金、帶有負(fù)電荷的量子點(diǎn)、熒光顆?；驘晒馍限D(zhuǎn)換顆粒物。
[0015]實(shí)施例2
一種免疫層析檢測磁性顆粒制作方法，包括如下的步驟:
(1)在500ml燒杯中加入30ml的0.8M的氯化亞鐵溶液，20ml的0.8M的氯化鐵溶液，加入雙蒸水至250ml，300RPM/min攪拌；
(2)緩慢在溶液中加入IM氫氧化鈉溶液10ml，5_8分鐘加完，持續(xù)攪拌30分鐘；
(3)將所得的溶液70度處理30分鐘；
(4)將(3)所得的磁流體磁性富集，去除溶液，加入300ml雙蒸水清洗2次，用雙蒸水定容與400ml；
(5)在(4)所得的溶液中加入0.1M鹽酸和0.05M硝酸配制的10m酸化溶液攪拌I小時(shí)；
(6 )在(5 )所得的溶液中加入20克的氯化鈉，充分溶解；
(7)除掉液體成分，將產(chǎn)物定容于500ml雙蒸水中；
(8)取10ul上步驟總所得溶液，用雙蒸水稀釋100倍待用；
(9 )取Iml步驟(8 )所得溶液，加入5ug抗體，混勻后，搖床混勻1分鐘；
(1 )在步驟(9 )所得溶液中加入I OOu I 10%的牛血清蛋白(BSA)，混勻后，搖床混勻1分鐘；
(11)磁性富集顆粒，充分去除液體，制得磁性顆粒;將收集的顆粒物重懸與10ul1%的BSA溶液中；
(12)取3ul步驟(11)所得萊克多巴胺抗體標(biāo)記的磁性顆粒產(chǎn)物，放入l-2ml待檢測樣品中，混勻，反應(yīng)5分鐘后，磁性富集磁性顆粒；
檢測試紙條的制備:用萊克多巴胺-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物(的抗體在硝酸纖維素膜上劃線，該區(qū)域作為檢測線(T線)，用磁性納米顆粒標(biāo)記抗體的二抗在硝酸纖維素膜上劃線，該區(qū)域作為質(zhì)控線(C線)，T線在硝酸纖維素膜離上樣區(qū)的近端，C線在硝酸纖維素膜離上樣區(qū)的遠(yuǎn)端；將步驟(12)所得的產(chǎn)物添加到試紙條的上樣區(qū)，將試紙條平放于桌面，加入60ul含有0.5%triton x-100的IX PBS溶液;5分鐘后觀察結(jié)果判讀:有明顯的C線則為有效結(jié)果，若C，T現(xiàn)均顯示，則樣品中靶標(biāo)物的含量不超過該試紙條的檢測限，若只有C線，無T線，則樣品中靶標(biāo)物的含量超過該試紙條的檢測限，所有無C線結(jié)果判讀為無效。
[0016]需要指出的是，以上的兩個(gè)實(shí)施例只是對本發(fā)明的解釋，并非是對發(fā)明的限定，在不違背本發(fā)明的精神的情況下，本發(fā)明可以作任何形式的修改，例如簡單的加熱系統(tǒng)的更換或者反應(yīng)釜的變化都應(yīng)在本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種免疫層析檢測磁性顆粒，其特征在于:所述免疫層析檢測磁性顆粒采用氧化還原法、水熱法制備磁流體后，經(jīng)酸化溶液處理后，再加入氯化鈉破壞膠體后磁性回收，最后重懸于雙蒸水中。2.如權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測磁性顆粒，其特征在于:所述酸化溶液為鹽酸、硝酸、硫酸、碳酸、磷酸、草酸、次氯酸或其混合溶液。3.如權(quán)利要求2所述的免疫層析檢測磁性顆粒，其特征在于:所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面通過靜電包被有抗體、核酸適配體或親和素特異結(jié)合靶標(biāo)物，并通過牛血清蛋白、甘氨酸物質(zhì)封閉表面裸露位點(diǎn)。4.如權(quán)利要求3所述的免疫層析檢測磁性顆粒，其特征在于:所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面通過靜電包被代用功能基團(tuán)的多聚物，經(jīng)過清洗后再通過固定在表面的功能基團(tuán)與功能物質(zhì)結(jié)合。5.如權(quán)利要求4所述的免疫層析檢測磁性顆粒，其特征在于:所述免疫層析檢測磁性顆粒的表面包裹有復(fù)合磁性顆粒。6.如權(quán)利要求5所述的免疫層析檢測磁性顆粒，其特征在于:所述復(fù)合磁性顆粒包括膠體金、帶有負(fù)電荷的量子點(diǎn)、熒光顆?；驘晒馍限D(zhuǎn)換顆粒物。7.—種制備權(quán)利要求1-6任一所述免疫層析檢測磁性顆粒方法，包括如下的步驟: (1)在500ml燒杯中加入30ml的0.8M的氯化亞鐵溶液，20ml的0.8M的氯化鐵溶液，加入雙蒸水至250ml，300RPM攪拌； (2)緩慢在溶液中加入IM氫氧化鈉溶液10ml，5_8分鐘加完，持續(xù)攪拌30分鐘； (3)將所得的溶液在70度條件下處理30分鐘； (4)將(3)所得的磁流體磁性富集，去除溶液，加入300ml雙蒸水清洗2次，用雙蒸水定容與400ml； (5)在(4)所得的溶液中加入0.1M鹽酸和0.05M硝酸配制的10m酸化溶液攪拌I小時(shí)； (6 )在(5 )所得的溶液中加入20克的氯化鈉，充分溶解； (7)除掉液體成分，將產(chǎn)物定容于500ml雙蒸水中； (8)取10ul上步驟總所得溶液，用雙蒸水稀釋100倍待用； (9)取Iml步驟(8)所得溶液，加入5ug抗體，混勻后，搖床混勻10分鐘； (1 )在步驟(9 )所得溶液中加入I OOu I 10%的牛血清蛋白，混勻后，搖床混勻1分鐘； (11)磁性富集顆粒，充分去除液體，制得磁性顆粒。
【文檔編號】G01N33/558GK106018798SQ201610623624
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月3日
【發(fā)明人】魯學(xué)文, 曾令文, 韓艷云
【申請人】武漢中科志康生物科技有限公司