、c為摻雜不同摩爾比例Eu和Tb的二氧化硅熒光納米探針的發(fā)射光譜，其中a為(Eu: Tb = 1:3)，b(Eu: Tb = 1:1)，c (Eu: Tb = 3:1)，但這種混合包裹的焚光納米探針，隨著在外層的“l(fā)ayer-by-layer”包裹，其特征光譜峰也沒有發(fā)生變化，并且由于硅殼層有一定的厚度，使得層與層之間有一定的距離，從而保證TEOS納米內(nèi)的Eu3+和/或Tb3+離子不會(huì)產(chǎn)生熒光自猝滅效應(yīng)，保證了熒光強(qiáng)度會(huì)隨著層數(shù)的增多而增強(qiáng)。這樣帶來最直接的好處就在于危害因子檢出限相比于傳統(tǒng)技術(shù)得到了顯著的提高，檢測(cè)靈敏度增加，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和具有針對(duì)性，這對(duì)于后續(xù)的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是重要的，這樣可以保證不同類型的熒光納米探針混合進(jìn)行多種危害因子的同步檢測(cè)，并有望實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。
[0105]在實(shí)際應(yīng)用過程中，牛奶中還可能存在其他的危害因子，這類危害因子分子量較小，如三聚氰胺、黃曲霉毒素、Beta-內(nèi)酰胺類抗生素等，其僅具有一個(gè)位點(diǎn)，也稱為半抗原，由于這類危害因子的結(jié)構(gòu)和特性的限制，不能采用“夾心法”法進(jìn)行檢測(cè)，而必須采用“競爭法”進(jìn)行檢測(cè)。
[0106]當(dāng)待檢物不僅有細(xì)菌、病毒類大分子危害因子，還有細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、抗生素等其他小分子危害因子時(shí)，檢測(cè)方法大致分為兩種。
[0107]方法一，本方法是預(yù)先將待檢測(cè)的溶液加入到檢測(cè)通道內(nèi)，然后再將含有多種熒光納米探針的容易加入到檢測(cè)通道內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
[0108]在這種情況下，對(duì)于細(xì)菌、病毒類大分子危害因子，采用“夾心法”進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)通道內(nèi)和用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體；具體舉例來說明:若待檢物中需要檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0157: H7，則微流控芯片中某一條或兩條檢測(cè)通道內(nèi)固定腸出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，并且熒光納米探針溶液中有表面偶聯(lián)腸出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體的熒光納米探針，形成抗體-抗原-抗體的三明治結(jié)構(gòu)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)即可得到待檢物中的腸出血性大腸桿菌0157:H7的含量。
[0109]對(duì)于如細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、抗生素等小分子危害因子，采用“競爭法”進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)通道內(nèi)固定有該危害因子的捕獲抗體，且用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面固定有該危害因子的模擬物;具體舉例來說明:若待檢物中需要檢測(cè)三聚氰胺，則微流控芯片中某一條或兩條檢測(cè)通道內(nèi)固定三聚氰胺的單克隆抗體，并且熒光納米探針溶液中有表面偶聯(lián)BSA-三聚氰胺的熒光納米探針，在測(cè)試過程中，三聚氰胺先被檢測(cè)通道內(nèi)的三聚氰胺的單克隆抗體捕獲，此時(shí)，檢測(cè)通道內(nèi)的三聚氰胺的單克隆抗體還有部分處于未捕獲三聚氰胺的狀態(tài)，此時(shí)加入熒光納米探針溶液，未捕獲三聚氰胺的單克隆抗體繼續(xù)與表面偶聯(lián)BSA-三聚氰胺的熒光納米探針結(jié)合，通過檢測(cè)熒光信號(hào)即可得到待檢物中的三聚氰胺的含量。
[0110]方法二、本方法是預(yù)先將多種熒光納米探針加入到待檢測(cè)的溶液中混合，然后在微流控芯片的檢測(cè)通道內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
[0111]在這種情況下，對(duì)應(yīng)檢測(cè)的細(xì)菌、病毒類大分子危害因子，采用“夾心法”進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)通道內(nèi)和用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體，具體如方法一中大分子危害因子的檢測(cè)方法。在此不再重復(fù)論述。
[0112]對(duì)于如細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、抗生素等小分子危害因子，采用“競爭法”進(jìn)行檢測(cè)，該檢測(cè)通道內(nèi)固定有該危害因子的模擬物，且用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面固定有該危害因子的捕獲抗體;具體舉例來說明:若待檢物中需要檢測(cè)三聚氰胺，則微流控芯片中某一條或兩條檢測(cè)通道內(nèi)固定BSA-三聚氰胺，并且熒光納米探針溶液中有表面偶聯(lián)三聚氰胺單克隆抗體的熒光納米探針，在測(cè)試過程中，三聚氰胺先被熒光納米探針溶液的具有三聚氰胺單克隆抗體的熒光納米探針捕獲，此時(shí)，還有部分三聚氰胺單克隆抗體的熒光納米探針處于未捕獲三聚氰胺的狀態(tài)，此時(shí)將混合溶液加入到檢測(cè)通道中，未捕獲三聚氰胺的熒光納米探針繼續(xù)與檢測(cè)通道內(nèi)的BSA-三聚氰胺結(jié)合，通過檢測(cè)熒光信號(hào)即可得到待檢物中的三聚氰胺的含量。
[0113]在熒光檢測(cè)過程中，采用“競爭法”進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)通道會(huì)顯示熒光。如果熒光越強(qiáng)烈，代表樣品中如細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物、抗生素或其他小分子物質(zhì)類危害因子越少，甚至于無該類危害因子。
[0114]采用“夾心法”法進(jìn)行檢測(cè)的檢測(cè)通道會(huì)顯示熒光。如果熒光越強(qiáng)烈，代表樣品中細(xì)菌、病毒類危害因子越多。
[0115]“夾心法”檢測(cè)法和“競爭法”檢測(cè)法在熒光數(shù)據(jù)上是截然相反的體現(xiàn)，“夾心法”檢測(cè)法所檢出的熒光強(qiáng)度越大，則代表對(duì)應(yīng)的危害因子的濃度越高，“競爭法”檢測(cè)法所檢出的熒光強(qiáng)度越小，則代表對(duì)應(yīng)的危害因子的濃度越高。
[0116]通過上述的操作，可以實(shí)現(xiàn)同一樣品中多種危害因子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢出限低，檢測(cè)精度高，操作簡單。
[0117]以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種熒光納米探針，包括內(nèi)部載有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核，其特征在于:所述的TEOS納米內(nèi)核表面修飾有多層表面鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米探針，其特征在于，所述的TEOS納米內(nèi)核的表面也鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光納米探針，其特征在于，所述的稀土螯合物所用的螯合劑為BBCAP或BHHCT或PTTA，所述的表面鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層為3?5層。4.一種如權(quán)利要求1至3任一所述的熒光納米探針的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1:在反相微乳液中合成內(nèi)部載有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核； 步驟2:在TEOS納米內(nèi)核的表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物； 步驟3:在鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核表面修飾一層TEOS殼層； 步驟4:在步驟3得到的具有TEOS殼層的粒子表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物； 步驟5:重復(fù)步驟3和步驟4，2?4次； 步驟6:在步驟5得到的粒子表面修飾一層TEOS殼層。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熒光納米探針的制備方法，其特征在于:所述的步驟2具體為:將步驟I所得到的TEOS納米內(nèi)核置于無水乙醇中并加入APTMS反應(yīng)，得到表面鍵合有氨基的TEOS納米內(nèi)核，并將其置于無水乙醇中； 然后加入螯合劑，使螯合劑和氨基反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過Tris.HCl溶液處理后置于無水乙醇中； 最后加入EuCl3和/或TbCl3,反應(yīng)一段時(shí)間后得到表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的熒光納米探針的制備方法，其特征在于:所述的步驟3具體為:將步驟2得到的TEOS納米內(nèi)核置于無水乙醇溶液中并加入TEOS反應(yīng)，使TEOS聚合反應(yīng)得到修飾有一層TEOS殼層的粒子； 所述的步驟4具體為:將步驟3得到的具有TEOS殼層的粒子置于無水乙醇溶液中并加入APTMS反應(yīng)，使TEOS殼層的表面鍵合氨基；然后加入螯合劑，使螯合劑和氨基反應(yīng)，經(jīng)過Tris.HCl溶液處理后置于無水乙醇中，最后加入EuCl3和/或TbCl3,反應(yīng)一段時(shí)間后使TEOS殼層的表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。7.—種用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，其特征在于:所述的方法通過具有多條檢測(cè)通道的微流控芯片和多種如權(quán)利要求1至3任一所述的熒光納米探針實(shí)施； 所述的方法具體為:將待檢物溶液加入到多條檢測(cè)通道后，用緩沖液沖洗后加入含多種熒光納米探針的溶液，最后用緩沖液沖洗后檢測(cè)檢測(cè)通道內(nèi)的熒光信號(hào)； 其中，對(duì)于采用夾心法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)和用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體； 對(duì)于采用競爭法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)固定有該危害因子的捕獲抗體，且用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面偶聯(lián)有該危害因子的模擬物。8.—種用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，其特征在于:所述的方法通過具有多條檢測(cè)通道的微流控芯片和多種如權(quán)利要求1至3任一所述的熒光納米探針實(shí)施； 所述的方法具體為:首先將含多種熒光納米探針的溶液與待檢物溶液混合后，將混合溶液加入到多條檢測(cè)通道中，然后用緩沖液沖洗后檢測(cè)檢測(cè)通道內(nèi)的熒光信號(hào)； 其中，對(duì)于采用夾心法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)和用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體； 對(duì)于采用競爭法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)固定有該危害因子的模擬物，且用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面偶聯(lián)有該危害因子的捕獲抗體。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，其特征在于:所述的模擬物為危害因子與BSA的復(fù)合物，或危害因子與卵清蛋白的復(fù)合物。10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，其特征在于:所述的微流控芯片上還設(shè)有控制通道，所述的微流控芯片包括PDMS本體，所述的TOMS本體的中央設(shè)有進(jìn)樣口，所述的檢測(cè)通道和控制通道分別與進(jìn)樣口相連，所述的進(jìn)樣通道的末端和控制通道的末端均設(shè)有出口，所述的進(jìn)樣通道和控制通道內(nèi)均設(shè)有多個(gè)柱狀的凸起；所述的微流控芯片設(shè)置在一可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤使待測(cè)樣品、緩沖溶液、熒光納米探針進(jìn)入檢測(cè)通道中。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光納米探針，包括內(nèi)部載有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核，所述的TEOS納米內(nèi)核表面修飾有多層表面鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層。本發(fā)明的目的在于提供一種光信號(hào)強(qiáng)、有助于高通量檢測(cè)食品中危險(xiǎn)因子的熒光納米探針，同時(shí)，本發(fā)明還提供了該熒光納米探針的制備方法，以及采用該熒光納米探針來實(shí)現(xiàn)食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法。
【IPC分類】G01N33/533, G01N33/543
【公開號(hào)】CN105510574
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510833301
【發(fā)明人】張恒, 易長青, 林燕奎, 劉慧玲
【申請(qǐng)人】深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 中山大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月25日