熒光納米探針及其制備方法和用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品檢測(cè)領(lǐng)域，特別是一種熒光納米探針，該熒光納米探針的制備方法，以及用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食品中危害因子檢測(cè)一直是食品安全領(lǐng)域中的重要課題，但目前能夠靈敏、穩(wěn)定可靠、快速簡(jiǎn)便、低成本地監(jiān)控乳品中常見的危害因子的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳品中高頻危害因子實(shí)現(xiàn)一步“全檢測(cè)”的技術(shù)仍然缺乏。
[0003]如乳品中常見的“高頻危害因子”如三聚氰胺，黃曲霉毒素Ml，Beta_內(nèi)酰胺類抗生素等的檢測(cè)技術(shù)主要有基于色譜-質(zhì)譜等理化檢測(cè)、基于抗原抗體反應(yīng)原理的免疫分析檢測(cè)和基于微生物相關(guān)技術(shù)原理的檢測(cè)。對(duì)乳品中抗生素的檢測(cè)最初發(fā)展起來的是基于抗生素與微生物間相互作用而建立的微生物生長(zhǎng)抑制法、微生物受體法和酶促比色法。乳品中理化檢測(cè)方法是利用抗生素分子中的基團(tuán)具有的特殊反應(yīng)或性質(zhì)來測(cè)定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法、聯(lián)用技術(shù)等等，能進(jìn)行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高，但色譜法分析過程繁瑣復(fù)雜，樣品前處理步驟較為復(fù)雜，工作量大，儀器昂貴，要求有熟練地技術(shù)人員及較長(zhǎng)的分析周期，這也一定程度上限制了色譜法的應(yīng)用。目前，用于檢測(cè)抗生素殘留的免疫分析方法主要有兩類:一類是以抗原抗體識(shí)別為核心反應(yīng)，代表方法是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，另一類是以受體配體識(shí)別為核心反應(yīng)。但影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果且靈敏度低。不管哪種方法，其檢測(cè)對(duì)象都是一種(類)物質(zhì)，要實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)高頻危害因子實(shí)現(xiàn)同步高通量的測(cè)定，目前的檢測(cè)方法還不能實(shí)現(xiàn)。
[0004]以稀土熒光化合物作為熒光標(biāo)記物的時(shí)間分辨熒光生化分析技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，在醫(yī)學(xué)臨床診斷、食品安全領(lǐng)域以及生命科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。現(xiàn)有技術(shù)中，基于稀土熒光生物標(biāo)記物超長(zhǎng)熒光壽命的時(shí)間分辨熒光生化分析技術(shù)可有效消除各種各樣來自于樣品及儀器的背景信號(hào)對(duì)熒光測(cè)定的干擾，使得測(cè)定靈敏度顯著增加。
[0005]但是現(xiàn)有的稀土熒光探針具有光信號(hào)較弱、檢測(cè)集成度低的問題，并且現(xiàn)有的稀土熒光探針及其配套的檢測(cè)裝置和平臺(tái)無法實(shí)現(xiàn)多種危害因子同步檢測(cè)的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的是提供一種光信號(hào)強(qiáng)、有助于高通量檢測(cè)食品中危險(xiǎn)因子的熒光納米探針，同時(shí)，本發(fā)明還提供了該熒光納米探針的制備方法，以及采用該熒光納米探針來實(shí)現(xiàn)食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)多種危害因子同步檢測(cè)的目的。
[0007]在闡述本發(fā)明的具體方案之前，對(duì)本發(fā)明中的各化合物簡(jiǎn)稱予以說明:
[0008]TEOS (正硅酸乙酯)、BHHCT (三聯(lián)苯衍生物螯合物)、BPTA(四氮-[2，6_雙(3 ’ -氨基甲基-Γ-吡啶)-4-苯基吡啶])、APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)、BBCAP(2，9-雙[N，N-雙(羧甲基)氨甲基]-1，10-(菲咯啉))、PTTA(聯(lián)三吡啶多羧酸衍生物)、BCPDA(4，7-雙氯磺?；交?1，10-菲啰啉-2，9-二羧酸迮00(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、BSA(牛血清白蛋白)、PDMS(聚一■甲基娃氧燒)。
[0009]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一種熒光納米探針，包括內(nèi)部載有Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核，所述的TEOS納米內(nèi)核表面修飾有多層表面鍵合有Eu3IPz^Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層。
[0010]優(yōu)選地，熒光納米探針的最外層還設(shè)有一層TEOS殼層，該TEOS殼層表面并不鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物，其主要用于鍵合抗體或者抗原模擬物。
[0011]在上述的熒光納米探針中，所述的TEOS納米內(nèi)核的表面也鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物。
[0012]需要說明的是:在本方案中，“和/或”所指代的意思為可以選擇之一或兩種均可選擇。比如，Eu3+和/或Tb3+的稀土螯合物是指該稀土螯合物中所螯合的稀土離子可以為Eu3+也可以為Tb3+，也可以為兩者的混合物。
[0013]在本方案中，若選擇螯合有Eu3+和Tb3+的離子時(shí)，其配比是根據(jù)實(shí)際需要來進(jìn)行選擇的，螯合物中所鍵合的Eu3+和Tb3+的摩爾比例可以為0:5、1:4、2:3、1:1、3:2、4:1、5:0。
[0014I Tb納米、Eu納米還是混合包裹的Eu/Tb納米都具有一致的激發(fā)和發(fā)射光譜。調(diào)整Eu與Tb 二者濃度的混合比例能夠制備多色熒光納米，其所制備出的多色熒光納米探針的激發(fā)波長(zhǎng)是保持一致的，如圖5中A、B所示，BBCAP-Eu，BBCAP-Tb的激發(fā)波長(zhǎng)為280nm。隨著摻入Tb與Eu摩爾比例的不同，形成的多色熒光納米探針在峰型上展示了一些變化，如圖5中C所示。但這種混合包裹的焚光納米探針，隨著在外層的“l(fā)ayer-by-layer”(一層又一層)包裹，其特征光譜峰也沒有發(fā)生變化，這對(duì)于后續(xù)的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是重要的，這樣可以保證不同類型的熒光納米探針混合進(jìn)行多種危害因子的同步檢測(cè)，并有望實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。
[0015]在上述的熒光納米探針中，所述的稀土螯合物所用的螯合劑為BBCAP或BHHCT或PTTA0
[0016]在上述的熒光納米探針中，所述的表面鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS殼層為3_5層。
[0017]本發(fā)明還提供上述的熒光納米探針的制備方法，具體來說，包括以下步驟:
[0018]步驟1:在反相微乳液中合成內(nèi)部載有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核；
[0019]步驟2:在TEOS納米內(nèi)核的表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物；
[0020]步驟3:在鍵合有Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核表面修飾一層TEOS殼層；
[0021 ]步驟4:在步驟3得到的具有TEOS殼層的粒子表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物；
[0022]步驟5:重復(fù)步驟3和步驟4，2?4次；
[0023]步驟6:在步驟5得到的粒子表面修飾一層TEOS殼層。
[0024]在上述的熒光納米探針的制備方法中，所述的步驟2具體為:將步驟I所得到的TEOS納米內(nèi)核置于無水乙醇中并加入APTMS反應(yīng)，得到表面鍵合有氨基的TEOS納米內(nèi)核，并將其置于無水乙醇中；
[0025]然后加入螯合劑，使螯合劑和氨基反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過Tris.HCl溶液處理后置于無水乙醇中；
[0026]最后加入EuCl3和/或TbCl3,反應(yīng)一段時(shí)間后得到表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核；
[0027]其中，TEOS納米內(nèi)核、APTMS、螯合劑、EuCl3和/或TbCl3的重量比為10?100:1?5:0.5?5:0.5 ?5ο
[0028]在上述的熒光納米探針的制備方法中，所述的步驟2具體為:將步驟I所得到的TEOS納米內(nèi)核置于無水乙醇中并加入APTMS反應(yīng)，得到表面鍵合有氨基的TEOS納米內(nèi)核，并將其置于無水乙醇中；
[0029]然后加入螯合劑，使螯合劑和氨基反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過Tris.HCl溶液處理后置于無水乙醇中；
[0030]最后加入EuCl3和/或Tb Cl3，反應(yīng)一段時(shí)間后得到表面鍵合Eu3+和/或Tb3+稀土螯合物的TEOS納米內(nèi)核；
[0031 ] 其中，TEOS納米內(nèi)核、APTMS、螯合劑、EuCl3和/或TbCl3的重量比為10?100:1?5:0.5?5:0.5 ?5ο
[0032]本發(fā)明還提供一種用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，具體來說，所述的方法通過具有多條檢測(cè)通道的微流控芯片和多種如上述的熒光納米探針實(shí)施;每一種危害因子均對(duì)應(yīng)有相應(yīng)的檢測(cè)通道和相應(yīng)的熒光納米探針；
[0033]所述的方法具體為:將待檢物溶液加入到多條檢測(cè)通道后，用緩沖液沖洗后加入含多種熒光納米探針的溶液，最后用緩沖液沖洗后檢測(cè)檢測(cè)通道內(nèi)的熒光信號(hào)；
[0034]其中，對(duì)于采用夾心法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)和用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體；
[0035]對(duì)于采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)固定有該危害因子的捕獲抗體，且用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面偶聯(lián)有該危害因子的模擬物。
[0036]另外，本發(fā)明還提供了另一種用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法，所述的方法通過具有多條檢測(cè)通道的微流控芯片和多種如上述的熒光納米探針實(shí)施;每一種危害因子均對(duì)應(yīng)有相應(yīng)的檢測(cè)通道和相應(yīng)的熒光納米探針；
[0037]所述的方法具體為:首先將含多種熒光納米探針的溶液與待檢物溶液混合后，將混合溶液加入到多條檢測(cè)通道中，然后用緩沖液沖洗后檢測(cè)檢測(cè)通道內(nèi)的熒光信號(hào)；
[0038]其中，對(duì)于采用夾心法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)和用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面均固定有該危害因子的捕獲抗體；
[0039]對(duì)于采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的危害因子，該危害因子對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道內(nèi)固定有該危害因子的模擬物，且用于檢測(cè)該危害因子的熒光納米探針的表面固定有該危害因子的捕獲抗體。
[0040]所述的模擬物為危害因子與BSA或卵清蛋白反應(yīng)得到，如BSA-三聚氰胺、BSA-氯霉素等。
[0041]在此需要說明的是，采用夾心法進(jìn)行測(cè)試的危害因子一般為大分子危害因子如細(xì)菌、病毒等微生物，該大分子危害因子具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，也稱為完全抗原;對(duì)于采用競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行測(cè)試的危害因子一般為小分子危害因子如三聚氰胺、抗生素、激素等，其僅具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，也稱為半抗原。
[0042]在上述的用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法中，所述的微流控芯片上還設(shè)有控制通道，所述的控制通道內(nèi)未修飾任何生物分子。
[0043]在上述的用于食品中多種危害因子同步檢測(cè)的方法中，所述的微流控芯片包括PDMS本體，所述的PDMS本體的中央設(shè)有進(jìn)樣口，所述的檢測(cè)通道和控制通道分別與進(jìn)樣口相連，所述的進(jìn)樣通道的末端和控制通道的末端均設(shè)有出口，所述的進(jìn)樣通道和控制通道內(nèi)均設(shè)有多個(gè)柱狀的凸起;所述的微流控芯片設(shè)置在一可旋