無乳鏈球菌的膠體金快速檢測試紙的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種無乳鏈球菌的膠體金快速檢測試紙。
【背景技術】
[0002] 羅非魚是原產(chǎn)于非洲的熱帶魚類，上世界七八十年代我國多次從國外引種，并選 育出長勢快、產(chǎn)量高、抗病力強的品種，此后迅速成功推廣養(yǎng)殖。目前，我國不僅是世界上最 大的羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)國，也是最大的羅非魚出口國。國內羅非魚養(yǎng)殖集中在廣東、海南、廣 西、福建等南方地區(qū)。2009年開始在羅非魚養(yǎng)殖密集區(qū)先后暴發(fā)羅非魚"突眼癥"，該病來 勢兇猛，發(fā)病率高達35%，發(fā)病魚死亡率接近100%，且病害持續(xù)時間長，藥物防治難以控 制病情，養(yǎng)殖戶損失慘痛。
[0003] 及時準確的發(fā)現(xiàn)和診斷病原，是成功預防和治療羅非魚鏈球菌病的前提。目前，對 于無乳鏈球菌的診斷，主要采用（1)分子生物學的方法，如PCR法進行診斷，該類方法依賴 于貴重的儀器設備和專業(yè)的技術人員，檢測時間長達4-6個小時，非常不利于在基層推廣 運用。（2)常規(guī)的分離培養(yǎng)法，依賴于專業(yè)操作人員的顯微鏡形態(tài)判斷，容易造成誤判，此類 方法的培養(yǎng)時間長達18-24個小時，也不適用于無乳鏈球菌的快速檢測。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明提供了 一種無乳鏈球菌的膠體金快速檢測試紙。
[0005] 膠體金免疫層析檢測試紙：是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金作為示蹤標 記物，與抗體結合，在微孔膜的滲濾作用或毛細管作用下，利用抗原抗體的反應的高度特異 性和膠體金特有的顏色對金標抗體與抗原或二抗的結合進行示蹤，顯示肉眼可見的紅色條 帶或斑點，從而實現(xiàn)對待測物的定性或定量分析。
[0006] 本發(fā)明雙抗體膠體金免疫層析試紙：即是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金 作為示蹤標記物，特異性的抗體1以條帶狀固定在硝酸纖維素膜上，另一特異性的抗體2與 膠體金溶液結合形成的金標抗體。當待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作 用向前移動，溶解結合墊上的金標抗體，相互反應后再移動至固定有抗體1的檢測區(qū)時，待 測物和金標抗體形成的復合物又與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，通過可 目測的膠體金標記物得到肉眼可見的紅色條帶，從而實現(xiàn)對待測物的定性或定量分析。
[0007] 本發(fā)明無乳鏈球菌的膠體金免疫層析檢測試紙，它是基于雙抗體夾心檢測原理 研制的膠體金免疫層析試紙，其中，采用的兩種抗體為中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保 藏號：CCTCC NO :C2015177的細胞株分泌的抗體以及中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏 號：CCTCC NO :C2015178的細胞株分泌的抗體。
[0008] 本發(fā)明保藏號為：CCTCC NO :C2015177的細胞株，于2015年10月21日保藏在中 國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其地址為：中國.武漢.武漢大學。
[0009] 本發(fā)明保藏號為：CCTCC NO :C2015178的細胞株，于2015年10月21日保藏在中 國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其地址為：中國.武漢.武漢大學。
[0010] 其中，所述中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號：CCTCC NO :C2015177的細 胞株分泌的抗體用于制備金標抗體；中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號：CCTCC NO : C2015178的細胞株分泌的抗體用于包被硝酸纖維素膜，形成檢測區(qū)。
[0011] 優(yōu)選地，所述抗體的制備方法如下：
[0012] (1)分別取保藏號：CCTCC NO :C2015177 的細胞株和保藏號：CCTCC NO :C2015178 的雜交瘤細胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
[0013] (2)收集腹水，純化，即可。
[0014] 優(yōu)選地，步驟（2)中，所述純化是是采用Protein G Sepharose親和層析柱純化。
[0015] 優(yōu)選地，所述試紙的結構如下：包括PVC底板和設于其上的硝酸纖維素膜，樣品墊 通過膠體金墊與硝酸纖維素膜一端連接，硝酸纖維素膜另一端搭接有吸水墊，所述硝酸纖 維素膜上靠近膠體金墊的一側設有檢測區(qū)，靠近吸水墊的一側設有質控區(qū)。
[0016] 優(yōu)選地，所述樣品墊搭接在膠體金墊一端上表面，膠體金墊另一端搭接在硝酸纖 維素膜上表面。
[0017] 進一步優(yōu)選地，所述質控區(qū)上包被有一層羊抗鼠的多克隆抗體層。
[0018] 本發(fā)明還提供了制備前述檢測試紙的方法，步驟如下：
[0019] a、取中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號：CCTCC NO :C2015177的細胞株分泌 的抗體，與膠體金混合，制備金標抗體，噴涂于玻璃纖維膜上，制得膠體金墊；
[0020] b、取硝酸纖維素膜，粘貼于PVC底板（1)上，將樣品墊通過膠體金墊與硝酸纖維素 膜的一端連接，再在硝酸纖維素膜的另一端搭接吸水墊；
[0021] c、再在硝酸纖維素膜靠近膠體金墊的一側噴涂取中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏 的保藏號：CCTCC NO :C2015178的細胞株包被的抗體作為檢測區(qū)，在靠近吸水墊的一側包 被羊抗鼠IgG作為質控區(qū)。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測無乳鏈球菌的免疫檢測試劑盒，它包括如下兩種無乳鏈 球菌單克隆抗體：采用的兩種無乳鏈球菌抗體為中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號： CCTCC NO :C2015177的細胞株分泌的抗體以及中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號： CCTCC NO :C2015178的細胞株分泌的抗體。
[0023] 所述抗體的制備方法如下：
[0024] (1)分別取保藏號：CCTCC NO :C2015177 的細胞株和保藏號：CCTCC NO :C2015178 的雜交瘤細胞株，注射入BALB/c小鼠腹水中增殖；
[0025] (2)收集腹水，純化，即可。
[0026] 步驟（2)中，所述純化是采用Protein G Sepharose親和層析柱純化。
[0027] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括免疫熒光檢測用試劑、放射免疫檢測用試劑、酶聯(lián)免疫 吸附檢測用試劑或免疫金膠體檢測用試劑。
[0028] 本發(fā)明兩種單克隆抗體可以與無乳鏈球菌有效結合，帶有的顯色物質顯色明顯， 可以與現(xiàn)有任意的免疫檢測技術常規(guī)用試劑聯(lián)用，檢測無乳鏈球菌。
[0029] 現(xiàn)有的免疫檢測技術包括免疫熒光技術、放射免疫檢測技術、酶聯(lián)免疫吸附技術 和免疫金膠體技術，本發(fā)明兩種單克隆抗體可以分別與常規(guī)的免疫熒光檢測試劑、放射免 疫檢測試劑、酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑或免疫金膠體檢測試劑聯(lián)合使用，使用免疫熒光技術、 放射免疫檢測技術、酶聯(lián)免疫吸附技術或免疫金膠體技術，準確檢測無乳鏈球菌。
[0030] 1.免疫熒光技術：免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、 細胞或血清中的相應抗原（或抗體）的方法。2.放射免疫檢測技術：放射免疫檢測技術是 目前靈敏度最高的檢測技術，利用放射性同素標記抗原（或抗體），與相應抗體（或抗原） 結合后，通過測定抗原抗體結合物的放射檢測結果。3.酶聯(lián)免疫吸附檢測技術（ELISA):酶 聯(lián)免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上酶，抗原抗體反應 的特異性與酶催化底物的作用結合起來，根據(jù)酶作用底物后的顯色顏色變化來判斷試驗結 果，其敏感度可達ng水平。常見用于標記的酶有辣根過氧化物酶（HRP)、堿性磷酸酶（AP) 等。4.免疫金膠體技術：該方法是將二抗標記上膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反 應，最終將膠體金標記的二抗吸附于滲濾膜上，此方法簡單，快速，廣泛應用于臨床篩查。
[0031] 本發(fā)明還提供了前述的檢測試紙和檢測試劑盒在制備檢測無乳鏈球菌中的用途。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種無乳鏈球菌的檢測方法，步驟如下：用本發(fā)明檢測試紙的樣 品墊浸潤待檢樣品，觀察檢測區(qū)和質控區(qū)是否顯色，即可。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種無乳鏈球菌的檢測方法，步驟如下：取待檢樣本，用前所述的 檢測試劑盒檢測，即可。
[0034] 優(yōu)選地，所述待檢樣本為魚體或者養(yǎng)殖水體。
[0035] 本發(fā)明無乳鏈球菌單克隆抗體制備的膠體金快速檢測試紙，其靈敏度高，特異性 好，操作方便、快速，解決了現(xiàn)有無乳鏈球菌檢測的問題，應用前景良好。
[0036] 在本試紙成功研制之前，國際上尚無針對無乳鏈球菌的膠體金快速檢測試紙的報 道。從已有文獻來看，研制該試紙所需要的生物材料非常難以制備和獲取。因此，本試紙的 成功研制在世界上尚屬首次，處于世界領先水平。
[0037] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0038] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容 所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0039] 圖1單抗的純化結果
[0040] 圖2試紙的結構，1 :PVC底板；2 :硝酸纖維素膜；3 :膠體金墊；4 :吸水墊；5 :檢測 區(qū)；6 :質控區(qū)；7 :樣品塾；
[0041] 圖 3 1 :6X1010CFU/ml ;2 :6X109CFU/ml ;3 :6X10sCFU/ml ;4 :6X107CFU/ml ;5 : 6X106CFU/ml ;C Line :質控線；T Line :檢測線；
[0042] 圖4試紙條的特異性測試；
[0043] 圖5發(fā)病魚組織及水體的檢測結果。
【具體實施方式】
[0044] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照試劑盒 說明書選擇。
[0045] 實驗材料：
[0046] 細菌：無乳鏈球菌TW3用于克隆和制備重組抗原，無乳鏈球菌（ATCC 51487)、無乳 鏈球菌C918 (牛源）、無乳鏈球菌TW7 (魚源）、無乳鏈球菌TW10