一種dna標(biāo)記抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種DNA標(biāo)記抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前應(yīng)用的DNA抗體偶聯(lián)系統(tǒng)主要有：（1)鏈親和素化抗體/蛋白A-生物素化 DNA系統(tǒng)：Sano等用鏈親和素/蛋白A基因工程融合蛋白作為連接分子來連接生物素標(biāo)記 的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識(shí)別DNA上的生物素，蛋白部分可識(shí)別抗體 的Fc段。但Ruzicka認(rèn)為蛋白A不但可以結(jié)合特異性抗體的IgG，而且還可以與樣品中吸 附于固相的無關(guān)抗體IgG結(jié)合，從而降低了反應(yīng)的特異性，而且鏈親和素/蛋白A融合蛋白 沒有商品化，不易進(jìn)行推廣。（2)生物素化抗體-親和素-生物素化DNA系統(tǒng)：國內(nèi)外更多 的研究人員使用親和素系統(tǒng)來連接DNA與抗體。這種偶聯(lián)系統(tǒng)是由Ruzicka等率先引入免 疫PCR技術(shù)的。其基本方法是先將親和素和生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后與結(jié)合固 相的生物素化的特異性抗體結(jié)合。但是1個(gè)親和素分子可以結(jié)合4個(gè)生物素分子，因此親 和素和生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物是高度不均一的，從而降低了準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。 大多數(shù)學(xué)者采用分別加入生物素化抗體、游離親和素和生物素化DNA分子的方法克服了以 上缺點(diǎn)，但延長(zhǎng)了檢測(cè)周期，使檢測(cè)步驟繁瑣，增加了系統(tǒng)誤差。（3)抗體-葉綠素-DNA系 統(tǒng)：利用自然界廣泛存在的葉綠素作為連接分子進(jìn)行抗體與DNA的交聯(lián)。這種方法具有較 好的穩(wěn)定性，且成本低，但該法葉綠素的提取和純化及除交聯(lián)外的其他過程均需在黑暗處 進(jìn)行，而交聯(lián)卻需在特定光下進(jìn)行，故實(shí)際操作中很不方便。（4)抗體-DNA系統(tǒng)：還有一些 學(xué)者用化學(xué)交聯(lián)劑直接將DNA與抗體連接起來。使用的交聯(lián)劑有聚乙烯亞胺和碳化二亞胺 等一些雙功能交聯(lián)劑，Joerger等的大致步驟是先將抗體馬來酰亞胺化和DNA分子乙酰硫 代乙酰化，然后將兩者在黑暗條件下進(jìn)行偶聯(lián)，最后對(duì)交聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行純化。該方法完全擺脫 了生物素-親和素系統(tǒng)的本身價(jià)態(tài)而造成的靈敏度和準(zhǔn)確性下降的問題，也免去了幾次洗 滌步驟，減少了指示系統(tǒng)與固相載體的非特異結(jié)合，節(jié)省了時(shí)間。常用的偶聯(lián)方法如戊二醛 法、碳二亞胺法法等不可避免地會(huì)產(chǎn)生酶或抗體的自身交聯(lián)產(chǎn)物或多聚物，致使偶聯(lián)效率 降低、結(jié)合物活性減弱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種DNA標(biāo)記抗體的方 法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] -種DNA標(biāo)記抗體的方法，采用異型雙功能交聯(lián)劑活化的抗體偶聯(lián)疏基化DNA。
[0006] 進(jìn)一步地，所述巰基化DNA的制備方法是利用巰基化引物和普通引物不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增得到。
[0007] 進(jìn)一步地，所述不對(duì)稱PCR擴(kuò)增的巰基化引物和普通引物的比例為50:1。
[0008] 進(jìn)一步地，所述異型雙功能交聯(lián)劑，一端是馬來酰亞胺基團(tuán)，一端是琥珀酰亞胺基 團(tuán)。
[0009] 進(jìn)一步地，所述異型雙功能交聯(lián)劑包括MBS、Sulfo MBS、GMBS、Sulfo GMBS、EMCS、 Sulfo EMCS、SMCC、Sulfo SMCC、SMPB 和 Sulfo SMPB〇
[0010] 進(jìn)一步地，所述采用異型雙功能交聯(lián)劑活化的抗體制備方法為：將透析過的抗體 和異型雙功能交聯(lián)劑按摩爾比以1:5的混合，異型雙功能交聯(lián)劑濃度2mg/L，25°C攪拌反應(yīng) 1小時(shí)。
[0011] 進(jìn)一步地，先將巰基化標(biāo)記DNA的二硫鍵用還原劑打斷，脫鹽后立即和活化的抗 體等摩爾數(shù)混合，25°C反應(yīng)1小時(shí)，加入10yL lm〇l/Li3-巰基乙醇終止反應(yīng)，25°C反應(yīng) 30min后純化。
[0012] 進(jìn)一步地，所述的純化方法為磁珠法，在PCR產(chǎn)物和抗體的偶聯(lián)物混合液中加入 羧化的磁粒，然后用PEG/NaCl沉淀，使目的DNA吸附至磁珠，最后磁場(chǎng)分離被吸附的DNA，經(jīng) 乙醇洗滌和用水洗脫完成純化。
[0013] 本發(fā)明提供的DNA標(biāo)記抗體的方法，采用異型雙功能試劑作為偶聯(lián)劑偶聯(lián)抗體和 DNA，制備的DNA標(biāo)記抗體可以用于免疫PCR試驗(yàn)，有反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，偶聯(lián)效率高等優(yōu)點(diǎn)。雖 然需要針對(duì)每一個(gè)特殊分析的抗體進(jìn)行標(biāo)記純化，而且標(biāo)記純化過程比較繁瑣，但當(dāng)大量 標(biāo)記后進(jìn)行推廣時(shí)，標(biāo)記純化過程比較繁瑣的缺陷也就不突出了；而且檢測(cè)多種成分可以 共用相同的指示系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)一步有利于標(biāo)準(zhǔn)化。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的免疫PCR反應(yīng)后的電泳條帶，可見泳道1位置200bp 左右有明顯擴(kuò)增條帶，證明DNA和抗體的偶聯(lián)是成功的。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種DNA標(biāo)記抗體的方法，采用異型雙功能交聯(lián)劑活化的抗體 偶聯(lián)巰基化DNA，通過合成巰基化引物來擴(kuò)增得到巰基化的DNA片段。
[0016] DNA和抗體屬于兩類不同的生物分子，特別是DNA，由脫氧核糖和堿基對(duì)組成，不 含有通常用于標(biāo)記的氨基，羥基，羰基等基團(tuán)，需要人為的引入可以標(biāo)記的基團(tuán)才可以進(jìn)行 偶聯(lián)反應(yīng)。雖然有一些研究人員使用生物素化抗體-親和素-生物素化DNA系統(tǒng)，但綜合 考慮檢測(cè)步驟繁瑣程度、檢測(cè)周期長(zhǎng)短、檢測(cè)重復(fù)性和準(zhǔn)確性，可以采用本發(fā)明的共價(jià)交聯(lián) 直接標(biāo)記的方法。本發(fā)明采用含有琥珀酰亞胺基團(tuán)和馬來酰亞胺基團(tuán)的異型雙功能偶聯(lián)劑 活化抗體上的氨基，并進(jìn)一步和DNA片段上的巰基反應(yīng)，形成DNA和抗體的復(fù)合物。得到的 DNA抗體復(fù)合物通過共價(jià)鍵偶聯(lián)，抗體和DNA分子比例固定，可以用于免疫PCR等相應(yīng)的實(shí) 驗(yàn)。
[0017] 實(shí)施例1 一種DNA標(biāo)記抗體的方法
[0018] 1.將帶馬來酰亞胺基團(tuán)和羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)的異雙功能交聯(lián)劑，例如： MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)，GMBS(Ν_ γ-Maleimidob utyryloxysuccinimide ester)，EMCS (N- ( ε-Maleimidocaproyloxy)succinimide ester)，SMCC(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), SMPB(Succinimidyl 4-(p_maleimidophenyl)butyrate)配制成溶液等。
[0019] 2.合成巰基修飾的寡核苷酸
[0020] 設(shè)計(jì)兩條引物，
[0021] 一條巰基化修飾 PI :H0-C6-S-S-C6-P03-TTCTCATGTTTGACGCTT
[0022] 一條不用任何修飾 P2 :CGGAATGGACGATATCCCGC
[0023] 以pBR322質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增200bp長(zhǎng)度的片段，巰基化引物和普通引物以50:1的 比例加入到PCR體系中，不對(duì)稱PCR擴(kuò)增使擴(kuò)增片段帶上巰基修飾。
[0024]
[0025] 3.透析抗體和純化寡核苷酸
[0026] 以PBS或者雙蒸水透析抗體，以核酸純化柱純化PCR產(chǎn)物，最后用水溶解PCR產(chǎn) 物。
[0027] 4.偶聯(lián)劑活化抗體