大熊貓乳汁中關鍵因子的分析方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于大熊貓人工養(yǎng)殖領域，具體涉及一種大熊貓乳汁中關鍵因子的分析方 法。
【背景技術】
[0002] 大熊貓育幼成活難曾經(jīng)是圈養(yǎng)大熊貓"三難"問題之一。綜合統(tǒng)計表明，在圈養(yǎng)條 件下，從1963年-1990年的27年里，大熊貓幼仔的成活率（半歲）僅為33. 9%。上世紀 90年代以來，由于大熊貓幼仔出生時非常嚴重的免疫缺陷，科學家認識到對大熊貓幼仔及 時補充母獸初乳的重要性?？茖W家通過開展大熊貓母獸與人工輪換哺育幼仔以及人工補充 初乳的方式，大熊貓幼仔的成活率已經(jīng)得到了顯著提高。近5年來，幼仔成活率保持在90% 以上。盡管已經(jīng)意識到初乳對于大熊貓幼仔建立被動免疫的重要性，但是截止到目前為止， 大熊貓乳汁尤其是初乳中對于幼仔免疫力發(fā)育至關重要的蛋白成分未能進行有效分析。之 前的相關研究主要集中于測定乳汁中的粗蛋白含量，大熊貓乳汁蛋白的氨基酸序列分析及 其功能性研究并未開展。關于大熊貓乳汁中其它營養(yǎng)成分的分析，之前的研究主要集中于 測定乳汁的粗脂肪、粗灰分、乳糖、礦物元素、維生素等營養(yǎng)物質。由于受到儀器設備及大熊 貓乳汁樣本數(shù)量的限制，大熊貓在不同泌乳階段的營養(yǎng)成分分析未能開展研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種大熊貓乳汁中關鍵因子的分析方法，解決大熊貓乳汁尤其 是初乳中對于幼仔免疫力發(fā)育至關重要的蛋白成分未能進行有效分析的問題。
[0004] 本發(fā)明的技術方案為：一種大熊貓乳汁中關鍵因子的分析方法，包括如下步驟：
[0005] (1)采集分娩后的大熊貓在不同階段的乳汁，
[0006] (2)通過代謝組學的分析手段對乳汁中的成分因子進行推測鑒定，
[0007] (3)將成分因子經(jīng)過PCA和HCA分析，將大熊貓的泌乳階段進行分類，
[0008] (4)通過0PLS-DA分析方法篩選出不同泌乳階段信號強且濃度較高的成分因子， 并對這些成分因子進行成分鑒定，
[0009] (5)通過0PLS分析方法將這些被鑒定的成分因子的成分濃度變化情況與大熊貓 幼仔體重增長率進行關聯(lián)分析，最終篩選到大熊貓乳汁中對于大熊貓幼仔生長具有關鍵作 用的因子。
[0010] 進一步地，步驟（2)中通過代謝組學的分析手段對乳汁中的成分進行推測鑒定的 步驟為：
[0011] 1)將采集的乳汁經(jīng)降解離心處理后通過LC-MS處理，得到乳汁成分的液相質譜數(shù) 據(jù)；
[0012] 2)將液相質譜數(shù)據(jù)與代謝組學數(shù)據(jù)庫對比，篩選得到成分因子LC-HRMS因子。
[0013] 進一步地，步驟（2)中通過代謝組學的分析手段對乳汁中的成分進行推測鑒定的 具體方法為：
[0014] 在室溫溶解采集的乳汁樣品，各取50 μ1乳汁樣品加入體積比為1:1的methanol/ acetonitrile溶液，混合溶液，超聲波降解20秒，15000rpm，4°C離心10min，取上清液，將 上清液樣品置入Accela 600HPLC系統(tǒng)后，系統(tǒng)從HiChrom中吸取10ul各樣品溶液注入 ZIC-pHILIC柱中，整個LC-MS分析過程中，樣品上機順序安排為隨機，將所得到的數(shù)據(jù)輸出 到 Excel表中，消除背景噪音，信號的最大強度必須超過空白對照信號的20倍，否則便被從 庫中移除，之后用代謝組學數(shù)據(jù)庫并基于準確分子量推測鑒定到乳汁的成分因子LC-HRMS 因子。
[0015] 進一步地，步驟（3)中將成分因子經(jīng)過PCA和HCA分析，將大熊貓的泌乳階段進行 分類的方法為：將經(jīng)過LC-MS分析后的大熊貓乳汁中的成分因子LC-HRMS因子進行PCA和 HCA分析，將大熊貓的泌乳階段分為初乳階段、后初乳階段和常乳階段；初乳階段為1-6天， 后初乳階段為6-20天，常乳階段為20天以上。
[0016] 進一步地，通過0PLS-DA分析方法篩選出不同泌乳階段信號強且濃度較高的成分 因子，并對這些成分因子進行成分鑒定的方法為：根據(jù)分類結果將乳汁樣品在7天前后的 代謝產(chǎn)物分子濃度分別進行準確測定，并進行0PLS-DA分析，篩選出初乳及常乳中信號強 及濃度較高的成分因子LC-HRMS因子，將這些成分因子通過MZMine 2. 10和標準品或元素 組分分析進行成分鑒定工作。
[0017] 進一步地，通過0PLS分析方法將這些被鑒定的成分因子的成分濃度變化情況與 大熊貓幼仔體重增長率進行關聯(lián)分析，最終篩選到大熊貓乳汁中對于大熊貓幼仔生長具有 關鍵作用的因子的方法為：記錄大熊貓幼仔出生后每天的體重，將當天較前一天體重的增 長百分比作為大熊貓體重增長率；鑒定到的乳汁的成分因子LC-HRMS因子的濃度變化作為 X變量，將大熊貓幼仔體重增長率作為Y變量，經(jīng)過0PLS分析，得到與大熊貓幼仔體重增長 率顯著相關的成分因子，即為大熊貓乳汁中的關鍵因子。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點：
[0019] 本發(fā)明首次提出對大熊貓乳汁開展了代謝組學研究。傳統(tǒng)的大熊貓乳汁營養(yǎng)成分 研究僅對乳汁中的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、碳水化合物進行了研究，而代謝組學分 析方法更精準的對乳汁中的代謝物質進行定性和定量分析，并且可以將這些代謝物質與大 熊貓幼仔生長情況進行關聯(lián)性分析。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :55份大熊貓乳汁樣品HCA㈧樹狀圖及PCA主成份分析點狀圖（B⑶）；圓圈： 麗麗（LL);星狀：圓圓（YY);菱形：小丫頭（XYT)。樣品在PCA點狀圖上按深淺被分成不同 的組，并分別對應HCA圖上用點狀線分隔的幾個部分。質量控制的樣品（麗麗19天1、2、3 號樣品）在圖中圈出；
[0021] 圖2 :55份大熊貓乳汁樣品0PLS-DA回歸分析的S-plot圖，初乳（7天以內(nèi)）與常 乳（7天之后）比較。初乳中最高的50種因子與常乳中最高的20種因子分別用深色及淺 色標出。插入的圖片是兩種寡糖異構體N262與N351的變化趨勢；
[0022] 圖3 :圖中A為21份圓圓樣品0PLS回歸分析圖，LC-HRMS數(shù)據(jù)為X變量，大熊貓幼 仔體重增長率為Y變量；B為大熊貓初生幼仔體重變化趨勢；C，D，E和F為各關鍵因子在大 熊貓哺乳期的變化趨勢。
【具體實施方式】
[0023] 1.材料和方法
[0024] 1. 1實驗材料
[0025] 采用了莉莉，圓圓，小丫頭三只大熊貓共55份乳汁樣品。樣品在采集以后2小時 內(nèi)放入-80 °C保存一直到分析之前。
[0026] 三種人工乳：安嬰兒奶粉（美贊臣公司）、美國貓狗奶粉（No. IL-BLD-004, Illinois USA)和 Panda milk-10 (日本森永公司）。
[0027] 表1試驗動物情況表
[0028]
[0029] 表2采樣信息表
[0030]
[0031]
[0032]
[0033] 1· 2實驗儀器和試劑
[0034]實驗儀器：Accela 600HPLC 系統(tǒng)與 Exactive (Orbitrap)超高分辨質譜儀（Thermo Fisher Scientific, Germany)〇
[0035]試劑：高效液相色譜級乙腈（Fisher Scientific)、Ammonium carbonateand (Sigma-Aldrich)、ammonium hydroxide solution (28-30 %) (Sigma-Aldrich)、metabolite standards 標準物。
[0036] 1· 3實驗方法
[0037] 1. 3. 1樣品處理
[0038] 室溫溶解樣品。各取50 μ1奶樣加入methanol/acetonitrile 1:1 (v/v)溶液，混 合溶液，超聲波降解20秒。15,000rpm，4°C離心10min。取上清，加入HPLC儀器特定的管 中，進行LC-MS分析。
[0039] 1. 3. 2HILIC - HRMS and HRMSn分析
[0040]樣品置入 Accela 600HPLC 系統(tǒng)后，系統(tǒng)從 HiChrom(流動相 A :20mM ammonium carbonate pH9. 2,流動相B:高效液相色譜級乙腈）中吸取10ul各樣品溶液注入 ZIC-pHILIC柱（150X4. 6mm，5ym)中。整個LC-MS分析過程中，樣品上機順序安排為隨機。
[0041] 我們同時設置了質量控制（圓圓第19天的樣品重復3份，分別安排在第一個、中 間與最后檢測）。數(shù)據(jù)輸出到Excel表中，消除背景噪音。信號的最大強度必須超過空白對 照信號的20倍，否則便被從庫中移除。
[0042] 之后數(shù)據(jù)被輸出做多變量分析。在項目組自己的宏數(shù)據(jù)庫里進行比對。
[0043] 1. 3. 3多變量分析
[0044]米用 SIMCA-P version 13. 0(Umetrics, Sweden)軟件進行 了包括