羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用。所述重組GroEL蛋白疫苗由羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白制備得到。所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明以羅非魚源無乳鏈球菌為研究對象，從羅非魚源無乳鏈球菌基因組中克隆到GroEL基因，與pET28a(+)載體連接構(gòu)建表達載體，在E.coli BL21(DE3)中進行原核表達和純化，獲得一種特異性強、具有免疫保護效力為68.61±7.39%的重組GroEL蛋白疫苗，為羅非魚無乳鏈球菌病的免疫防治奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子疫苗學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一種人畜魚共患革蘭氏陽性菌，能引起新生兒腦膜炎、牛乳腺炎和魚類腦膜腦炎。無乳鏈球菌能感染多種海水、淡水魚類并引起死亡，給我國乃至世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。因此，研究無乳鏈球菌相關(guān)的防治技術(shù)具有很重要的現(xiàn)實意義。
[0003]目前，在國內(nèi)已有一些與鏈球菌疫苗相關(guān)的專利。申請?zhí)?200580013779.X，發(fā)明名稱:無乳鏈球菌疫苗公布了一種β溶血性無乳鏈球菌的完整滅活細胞和該菌培養(yǎng)物的濃縮提取物制備的組合疫苗通過注射和浸泡兩種方式對羅非魚抗無乳鏈球菌的免疫保護效果分別為80%和35%。申請?zhí)?200780025577.6，發(fā)明名稱:抗鏈球菌的聯(lián)合疫苗公布了一種聯(lián)合疫苗，當(dāng)難辨鏈球菌和海豚鏈球菌在疫苗制劑中的比例(基于細胞:細胞)為20:1或40:1時，可得到抗難辨鏈球菌的64%的相對保護率和抗海豚鏈球菌的71%的相對保護率。申請?zhí)?201080047156.5，發(fā)明名稱:鏈球菌組合疫苗，公布了一種組合疫苗，包含無乳鏈球菌生物型I血清型Ia細胞和血清型III細胞的組合疫苗提供針對羅非魚抗無乳鏈球菌生物型I血清型Ia的88.9%保護率和抗羅非魚無乳鏈球菌生物型I血清型III的92%的保護率。申請?zhí)?201010207289.6，發(fā)明名稱:羅非魚二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗的制備方法，公布了一種羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌等體積混合二聯(lián)疫苗的制備過程。申請?zhí)?201210337267.0，發(fā)明名稱:一種預(yù)防羅非魚鏈球菌病的疫苗，公布了一種無乳鏈球菌全菌滅活疫苗通過浸泡、注射和口服免疫羅非魚后最高分別能達到60%、90%和75%的免疫保護率。申請?zhí)?201410121138.7，申請名稱:一種無乳鏈球菌的口服疫苗及其制備方法，構(gòu)建一種表達無乳鏈球菌sip蛋白的重組減毒沙門氏菌，將其拌料投喂羅非魚后最高可獲得63%的抗無乳鏈球菌免疫保護率。
[0004]但是，以上公開使用的無乳鏈球菌疫苗均是單一或是二聯(lián)全菌滅活疫苗，制備出的疫苗免疫效力與疫苗菌株的免疫原性直接相關(guān)，并且只對血清型一致的無乳鏈球菌有效，對海豚鏈球菌沒有效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種羅非魚源無乳鏈球菌GroEL基因編碼的重組GroEL蛋白，并作為重組蛋白疫苗來防治羅非魚無乳鏈球菌病，能夠?qū)α_非魚抗無乳鏈球菌不同血清型產(chǎn)生特異性的保護性。該重組蛋白疫苗的制備方法簡單、制備過程安全，疫苗對羅非魚抗無乳鏈球菌的免疫保護率達到68.61 ± 7.39% ο
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種羅非魚源無乳鏈球菌groEL基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]所述的羅非魚源無乳鏈球菌groEL基因是從羅非魚源無乳鏈球菌中克隆得到的。
[0010]一種羅非魚源無乳鏈球菌groEL基因編碼的重組GroEL蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
[0011]所述重組GroEL蛋白是由上述羅非魚源無乳鏈球菌groEL基因編碼得到。
[0012]另外，上述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白的制備方法，包括如下步驟:
51.利用引物對GroEL-F和GroEL-R，將GroEL基因克隆到原核表達系統(tǒng)中，得到含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌；
52.將含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌進行擴大培養(yǎng)，純化回收獲得重組GroEL蛋白；
其中，所述引物GroEL-F的序列如SEQ ID N0.3所示，引物GroEL-R的序列如SEQ IDN0.4所示;所述GroEL基因的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]另外，進一步優(yōu)選地，步驟SI的具體方法是:
SI 1.克隆GroEL基因:以羅非魚源無乳鏈球菌基因組DNA為模板，以引物GroEL-F和GroEL-R進行PCR克隆GroEL基因；
512.構(gòu)建GroEL克隆菌株:將克隆的GroEL基因連接到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞，利用氨芐青霉素篩選得到含有重組質(zhì)粒pMD18T-GroEL的陽性GroEL克隆菌株；
513.構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-GroEL:利用內(nèi)切酶EcoRI和Hind III，將質(zhì)粒pMD18T_GroEL和表達載體pET28a( + )連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那青霉素抗性篩選，挑取單菌落進行PCR鑒定，篩選出陽性克隆細胞，即為含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌。
[0014]其中，更優(yōu)選地，步驟SII所述PCR反應(yīng)體系為:25μ1反應(yīng)體系含50ng模板DNA(基因組DNA)，2.5yl 1XPCR BuffeKMg+)，2μI dNTP Mixture (2.5mM) ,Ιμ? GroEL-F,1μIGroEL-R,0.125μ1 rTaq(5U/yl)，加滅菌蒸饋水至 25μ10
[0015]更優(yōu)選地，步驟SI I所述PCR條件為:94°C預(yù)變性Imin ;然后94°C變性30s，55°C退火30s，70°C延伸Imin下作用30個循環(huán)；最后70°C延伸1min; 16°C保溫。
[0016]更優(yōu)選地，步驟S12所述連接的體系為:10μ1體系內(nèi)含4μ1PCR產(chǎn)物，Ιμ? pMD18_TVector,5μI Solut1n I。
[0017]更優(yōu)選地，步驟S12的具體方法如下:將步驟Sll所述PCR的產(chǎn)物回收純化后與PMD18-T載體連接，16°C下過夜連接;將ΙΟμI連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50μI大腸桿菌Trans1-Tl感受態(tài)細胞，冰浴30min，42°C熱激60s，然后加入500μ1 LB液體培養(yǎng)基，37 °C震蕩培養(yǎng)2h，4000rpm離心5min，留ΙΟΟμΙ吹打沉淀菌液，將混合液加入含有100yg/ml氨節(jié)青霉素(Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后在37°C培養(yǎng)過夜;隨機挑取平板上的10個單菌落鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的單菌落即為GroEL克隆菌株。
[0018]更優(yōu)選地，步驟S13的具體方法如下:將質(zhì)粒pMD18T-GroEL和表達載體pET28a( + )分別用EcoR I和Hind III進行雙酶切;將酶切產(chǎn)物膠回收，連接groEL基因片段和pET28a( + )，16°C連接過夜，連接體系為:10μ1，含4μ1 groEL基因片段、Ιμ? pET28a( + )、5μ1Solut1n I。
[0019]更優(yōu)選地，步驟S13所述雙酶切的體系為:50μ1總體積，含5μ I 1X QuickCutGreen Buffer, Ιμ? EcoR Ι，1μ1 Hind III, Ipg pET28a( + )，加不含核酸酶的水至50μ1。
[0020]更優(yōu)選地，步驟S13所述雙酶切的的條件為:30°C酶切10min，37°C酶切20min。[0021 ]進一步優(yōu)選地，步驟S2的具體方法如下:
521.將含有重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)9?1h;
522.將菌液加入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)I?3h，至0D600為0.5?0.7 ；
523.向菌液中加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用咪唑洗脫液純化回收，得到純化的重組GroEL蛋白，即為所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0022]其中，更具體優(yōu)選地，步驟S2的具體方法如下:
521.將含有重組質(zhì)粒pET28-GroEL的E.coliBL21(DE3)單菌落接種于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C下200r/min震蕩培養(yǎng)9?1h;
522.將5ml菌液加入500ml含有50即/1111卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，1:100擴大培養(yǎng)2h，至0D600約為0.6;
523.向菌液中加入終濃度為0.6mmol/l的IPTG，16°C震蕩培養(yǎng)過夜;離心收集過夜誘導(dǎo)的菌體，Lysis Buffer重懸，冰浴30min后超聲破碎15min，離心收集上清；
524.用N1-NTA純化上清液中的重組GroEL蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脫液洗去雜質(zhì)，再用含200mmol/l咪唑的洗脫液洗脫重組蛋白；洗脫的重組蛋白用1KDa超濾管超濾，除去洗脫液中的咪唑，得到純化的重組GroEL蛋白，即為所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]另外，上述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白在作為或制備羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0024]一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法，是將羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白用滅菌PBS稀釋至lmg/ml，與弗氏完全或不完全佐劑按I: I混合均勾，制備成亞單位疫苗。
[0025]進一步地，取Iml制備好的疫苗，在3000 X g下離心5min，疫苗無分層現(xiàn)象，則可用于后續(xù)免疫。
[0026]上述方法制備得到的羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗，以及所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗在制備防治羅非魚無乳鏈球菌病的藥物或制劑方面的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0027]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法，所得重組GroEL蛋白疫苗可用于防治羅非魚無乳鏈球菌病，能夠?qū)α_非魚抗無乳鏈球菌不同血清型產(chǎn)生特異性的保護性，疫苗對羅非魚抗無乳鏈球菌的免疫保護率達到68.61 ± 7.39% ο
[0028]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的重組GroEL亞單位疫苗具有明顯的優(yōu)勢，現(xiàn)有技術(shù)中對羅非魚無乳鏈球菌的防治仍主要依賴傳統(tǒng)藥物，在養(yǎng)殖羅非魚中新型抗無乳鏈球菌病疫苗的開發(fā)是近些年的研究熱點，但是主要集中于全菌滅活疫苗和減毒活疫苗;這兩種疫苗雖然制備方法簡便，但是滅活疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的使用需要大劑量、多次免疫接種，而減毒活疫苗的儲藏和運輸條件要求極高，有效期較短，且存在返毒危險；因此這兩種疫苗均可能引起較大的毒副反應(yīng)。亞單位疫苗即由具免疫活性的致病菌蛋白所制成的疫苗，本發(fā)明中的重組GroEL亞單位疫苗僅含一種致病菌蛋白質(zhì)，因而能消除許多無關(guān)抗原所誘發(fā)的抗體，減少疫苗帶來的副反應(yīng)以及因疫苗引起的其他疾病，安全性可靠。并且，與全菌滅活疫苗和減毒活疫苗相比，本發(fā)明的重組GroEL疫苗不存在血清型特異性，可對抗不同血清型的無乳鏈球菌，適用范圍更廣。因此，在預(yù)防羅非魚無乳鏈球菌方面具有良好的應(yīng)用前景。
[0029]而且，本發(fā)明的蛋白疫苗制備方法采用原核表達系統(tǒng)，制備方法簡單，流程簡潔快速、制備過程安全、表達成本低、產(chǎn)量高(1L培養(yǎng)液可以純化出20 mg目的蛋白)，適于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
【附圖說明】
[0030]圖1為羅非魚源無乳鏈球菌GroEL基因PCR擴增產(chǎn)物；其中，泳道M:DL2000Marker ;泳道I:PCR擴增產(chǎn)物。
[0031]圖2為蛋白純化結(jié)果；圖中，M為蛋白Marker;泳道I是誘導(dǎo)產(chǎn)生rGroEL的E.coliBL21 (DE3)超聲破碎溶液;泳道2是沒有結(jié)合上柱子的蛋白溶液;泳道3是20 mM咪唑濃度洗滌柱子的溶液;泳道4-7是100 mM咪唑濃度洗脫下來的蛋白溶液;泳道8_10是200 mM咪唑濃度洗脫下來的蛋白溶液。
[0032]圖3為重組GroEL蛋白Elisa檢測血清抗體滴度;橫坐標為初免后第O、2、4周的血清;抗體滴度用產(chǎn)生陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)表示。
[0033]圖4為重組GroEL蛋白疫苗免疫羅非魚后攻毒的存活曲線。
【具體實施方式】
[0034]以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0035]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0036]實施例1制備羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白
1、引物設(shè)計:
以羅非魚源無乳鏈球菌為模板，設(shè)計一對包含限制性內(nèi)切酶的引物GroEL-F和GroEL-R，序列如下:
引物GroEL-F(序列如SEQ ID勵.3所示):
5’- GGAATTCATGGCAAAAGATATTAAATTTTC-3’
引物GroEL-R((序列如SEQ ID勵.4所示)):
5，- GGGTTCGAAGAAGCCACCCATCATAGATGG-3，
上游引物GroEL-F下劃線部分是EcoR I酶切位點，下游引物GroEL-R下劃線部分是Hind ΙΠ酶切位點。
[0037]2、GroEL 基因克隆 (I)PCR擴增GroEL基因提取羅非魚源無乳鏈球菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，以上述引物對GroEL-F和GroEL-R進行PCR反應(yīng)。
[0038]PCR反應(yīng)體系為:25μ1反應(yīng)體系含50ng模板DNA(基因組DNA)，2.5μ1 1XPCRBuffeKMg+)，2μI dNTP Mixture (2.5πιΜ)，1μ1 GroEL-F,1μI GroEL_R，0.125μ1 rTaq(5U/μ?)，加滅菌蒸饋水至25μ1。
[0039]PCR條件為:94°C預(yù)變性Imin ;然后94°C變性30s，55°C退火30s，70°C延伸Imin下作用30個循環(huán)；最后70°C延伸1min; 16°C保溫。
[0040]PCR擴增產(chǎn)物電泳圖如附圖1所示。
[0041 ] GroEL基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0042](2)構(gòu)建GroEL克隆菌株
上述PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD18-T載體連接，16°C下過夜連接。
[0043]連接體系為:10μ1體系內(nèi)含4μ1 PCR 產(chǎn)物，Ιμ? pMD18_T Vector, 5μI Solut1n
1
[0044]將ΙΟμΙ連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50μ1大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài)細胞，冰浴30min，42°C熱激60s，然后加入500μI LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)2h，4000rpm離心5min，留ΙΟΟμI吹打沉淀菌液，將混合液加入含有l(wèi)OOyg/ml氨芐青霉素(Amp+)的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后在37 °C培養(yǎng)過夜。
[0045]隨機挑取平板上的10個單菌落鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的單菌落即為GroEL克隆菌株。
[0046]3、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET28-GroEL
提取GroEL克隆菌株質(zhì)粒，將質(zhì)粒pMD18T-GroEL和表達載體pET28a( + )分別用EcoRI和Hind III進行雙酶切。
[0047]雙酶切體系為:50μ1總體積，含5μ1 10 XQuickCut Green Buffer，1μI EcoR I，1μI Hind III，Iyg pET28a( + )，加不含核酸酶的水至50μ1。
[0048]30 °C 酶切 10min，37°C 酶切20min。
[0049]將酶切產(chǎn)物膠回收，連接groEL基因片段和pET28a(+ )，16°C連接過夜，連接體系為:10μ1，含 4μ1 groEL基因片段、Ιμ? pET28a( + )、5μ1 Solut1n I。
[0050]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那青霉素抗性篩選，挑取單菌落進行PCR鑒定，篩選出陽性克隆細胞即為含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌。
[0051 ] 4、純化重組GroEL蛋白——重組質(zhì)粒pET28-GroEL在E.coli BL21 (DE3)中的表達和純化:
(I)將含有重組質(zhì)粒pET28-GroEL的E.coli BL21(DE3)單菌落接種于5ml含有50此/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C下200r/min震蕩培養(yǎng)9?1h，將5ml菌液加入500ml含有SOyg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，1:100擴大培養(yǎng)2h，至0D600約為0.6。向菌液中加入終濃度為0.6mmol/l的IPTG，16°C震蕩培養(yǎng)過夜。離心收集過夜誘導(dǎo)的菌體，Lysis Buffer重懸，冰浴30min后超聲破碎15min，離心收集上清。用N1-NTA純化上清液中的重組GroEL蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脫液洗去雜質(zhì)，再用含200mmol/l咪唑的洗脫液洗脫重組蛋白。洗脫的重組蛋白用1KDa超濾管超濾，除去洗脫液中的咪唑，得到純化的重組GroEL蛋白，即為所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。。
[0052](2)蛋白純化結(jié)果如附圖2所示，圖中:M為蛋白Marker;泳道I是誘導(dǎo)產(chǎn)生rGroEL的E.coli BL21 (DE3)超聲破碎溶液;泳道2是沒有結(jié)合上柱子的蛋白溶液;泳道3是20 mM咪唑濃度洗滌柱子的溶液;泳道4-7是100 mM咪唑濃度洗脫下來的蛋白溶液;泳道8_10是200 mM咪唑濃度洗脫下來的蛋白溶液。
[0053]5、Elisa 檢測
2、檢測方法
(I)包被:用包被液稀釋重組GroEL蛋白至200^^/1111，加入96孔酶標板內(nèi)，ΙΟΟμΙ/孔，4°C包被過夜。
[0054](2)洗滌:棄去96孔中的包被液，用低鹽Buffer清洗5次，3minX5次，每次250μ1/孔，移液槍輕輕吹打后，用200rpm的速度緩和振蕩，拍干。
[0055](3)封閉:加入1% BSA進行封閉，250μ1/孔，22°C，封閉2h。按上述條件進行洗滌，拍干。
[0056](4)一抗反應(yīng):將采集的羅非魚抗血清用PBS按2倍逐級稀釋(如稀釋倍數(shù):2、22、23、24、25、26、27、28等)，按100μ I/孔加入，22°C，孵育3h。按上述條件進行洗滌，拍干。
[0057](5)二抗反應(yīng):將鼠抗魚IgM用PBS稀釋10倍，按ΙΟΟμΙ/孔加入，22°C，孵育2h;洗滌，拍干。
[0058](6)三抗反應(yīng):將羊抗鼠IgG-HRP標記的抗體用PBS稀釋5000倍，按ΙΟΟμΙ/孔加入，22 °C孵育2h;洗滌，拍干。
[0059](7)顯色:將TMB底物溶液按ΙΟΟμΙ/孔加入，室溫孵育；1min后，加入反應(yīng)終止液50μ1/孔終止反應(yīng)。
[0060](8)讀數(shù):將此96酶標板置于酶標儀上進行讀數(shù)，測定450nm處的吸光值，SP
OD450o
[0061]若試驗組的讀數(shù)大于或等于對照組的兩倍，則記為陽性，否則為陰性?？贵w滴度以陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)表示。
[0062]2、結(jié)果如圖3所示。免疫后血清抗體效價出現(xiàn)不同程度的增長，且在第四周達到峰值，為 l:2048o
[0063]實施例2制備羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗
將實施例1獲得的純化的重組GroEL蛋白用滅菌PBS稀釋至lmg/ml，與弗氏完全及不完全佐劑按I: I混合均勾，制備成亞單位疫苗。
[0064]取Iml制備好的疫苗，在3000Xg下離心5min，疫苗無分層現(xiàn)象，則可用于后續(xù)免疫。
[0065]實施例3羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗免疫試驗
1、免疫保護實驗
(I)尼羅羅非魚購自廣州市誠一水產(chǎn)科技有限公司，規(guī)格為50±5.0g，實驗前暫養(yǎng)兩周。
[0066](2)免疫實驗時，將羅非魚隨機分為3組，S卩PBS組、PBS+佐劑組、GroEL疫苗組。每組14尾，每組設(shè)三個平行。
[0067]GroEL組和佐劑組分別腹腔注射100μ I與弗氏佐劑等體積混合的重組抗原GroEL以及PBS，PBS組注射I ΟΟμ I的滅菌PBS。
[0068]2、免疫程序
對羅非魚進行兩次免疫，初次免疫使用弗氏不完全佐劑，加強免疫使用弗氏完全佐劑亞單位疫苗。
[0069]初次免疫時，每尾魚腹腔注射ΙΟΟμΙ疫苗。兩周后，每尾魚腹腔注射ΙΟΟμΙ疫苗進行加強免疫。
[0070]初免后第2和4周，每組選2尾魚采血，室溫放置2h后，4°C、10000 Xg離心1min，收集上清，分裝后-80°C保存，用于免疫指標的測定。
[0071]3、免疫保護率測定
(I)加強免疫兩周后，用LD50劑量進行細菌攻毒實驗，每尾魚腹腔注射10ul無乳鏈球菌菌液(I X 15CFU/ ml)。攻毒后，每天觀察羅非魚的狀況，及時撈出死魚，并記錄14天內(nèi)的死亡情況。連續(xù)觀察14天，停止觀察，實驗結(jié)束。
[0072]根據(jù)下述公式計算羅非魚的相對保護率(RPS):
RPS= (1-免疫組累積死亡率/對照組累積死亡率)X 100%。
[0073](2)攻毒后羅非魚死亡情況如圖4所示。
[0074]結(jié)果顯示，初次免疫后第四周，用無乳鏈球菌進行攻毒。羅非魚從攻毒后第I天開始就出現(xiàn)死亡，死亡主要集中在攻毒后的前2天。
[0075]此外，攻毒羅非魚表現(xiàn)出一些患鏈球菌病的臨床癥狀，如眼球突出且渾濁，離群獨游和身體蜷曲等。
[0076]重組GroEL蛋白作為抗羅非魚無乳鏈球菌病疫苗用于注射免疫可獲得68.61土7.39%的免疫保護率。
【主權(quán)項】
1.一種羅非魚源無乳鏈球菌groEL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1所不O2.一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白，其特征在于，所述重組GroEL蛋白是由權(quán)利要求1中所述羅非魚源無乳鏈球菌groEL基因編碼得到。4.權(quán)利要求2或3所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.利用引物對GroEL-F和GroEL-R，將GroEL基因克隆到原核表達系統(tǒng)中，得到含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌； 52.將含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌進行擴大培養(yǎng)，純化回收獲得重組GroEL蛋白； 其中，所述引物GroEL-F的序列如SEQ ID N0.3所示，引物GroEL-R的序列如SEQ IDN0.4所示;所述GroEL基因的序列如SEQ ID N0.1所示。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟SI的具體方法是: 511.克隆GroEL基因:以羅非魚源無乳鏈球菌基因組DNA為模板，以引物GroEL-F和GroEL-R進行PCR克隆GroEL基因； 512.構(gòu)建GroEL克隆菌株:將克隆的GroEL基因連接到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞，利用氨芐青霉素篩選得到含有重組質(zhì)粒pMD18T-GroEL的陽性GroEL克隆菌株； 513.構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-GroEL:利用內(nèi)切酶EcoRI和Hind III，將質(zhì)粒pMD18T_GroEL和表達載體pET28a( + )連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那青霉素抗性篩選，挑取單菌落進行PCR鑒定，篩選出陽性克隆細胞，即為含重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟S2的具體方法如下: 521.將含有重組質(zhì)粒pET28-GroEL的工程菌單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)9?1h; 522.將菌液加入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)I?3h，至0D600為0.5?0.7; 523.向菌液中加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用咪唑洗脫液純化回收，得到純化的重組GroEL蛋白，即為所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白。7.權(quán)利要求2或3所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白在作為或制備羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗方面的應(yīng)用。8.一種羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，是將羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白用滅菌PBS稀釋至lmg/ml，與弗氏完全或不完全佐劑按1:1混合均勻，制備成亞單位疫苗。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法制備得到的羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗。10.權(quán)利要求9所述羅非魚源無乳鏈球菌重組GroEL蛋白疫苗在制備防治羅非魚無乳鏈球菌病的藥物或制劑方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/09GK105861521SQ201610314912
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】李安興, 李薇, 李云
【申請人】中山大學(xué)