檢測(cè)乳樣中乳鐵蛋白含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乳品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)乳樣中乳鐵蛋白含量的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳鐵蛋白（lactoferrin，LF)是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，在中性 粒細(xì)胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白。其分子量為80kDa，主要由乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和 分泌。乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強(qiáng)大 生物功能，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開(kāi)發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。
[0003] 目前，測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白含量的方法包括免疫酶聯(lián)吸附法(ELISA法）、高效毛 細(xì)管電泳法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、凝膠色譜法等多種方法。ZL201410482589 公開(kāi)了將乳樣離心處理得到含有乳鐵蛋白粗提物的乳清，再通過(guò)過(guò)濾得到乳鐵蛋白精提 物;最后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定確定樣品中乳鐵蛋白的含量。ZL201310567858公開(kāi)了將待 測(cè)乳制品離心除去上浮的脂肪;然后將除去脂肪的樣品溶液的pH值調(diào)節(jié)到乳鐵蛋白的等電 點(diǎn)使樣品中的乳鐵蛋白沉淀，離心后棄去上清液;將乳鐵蛋白沉淀用三氟乙酸溶液溶解，進(jìn) 行高效液相色譜分析檢測(cè)乳鐵蛋白的含量。ZL201310187213公開(kāi)了一種適于大批量樣本的 快速檢測(cè)，可以滿(mǎn)足各類(lèi)乳制品中牛乳鐵蛋白的準(zhǔn)確定量的試劑盒;US20140308749公開(kāi)了 一種使用電泳和紅外熒光在嬰幼兒配方奶粉中檢測(cè)乳鐵蛋白的方法。以上方法步驟繁瑣， 價(jià)格昂貴，檢測(cè)結(jié)果差異較大，不適合工業(yè)規(guī)模檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速、準(zhǔn)確、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單的檢測(cè)乳樣中乳鐵蛋白含 量的方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的檢測(cè)乳樣中乳鐵蛋白含量的方法，包括對(duì)乳 樣離心脫脂，過(guò)濾，親和層析純化以及用C4或C8色譜柱進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)等步驟。
[0006] 其中，對(duì)乳樣離心脫脂的具體操作為:將乳樣以2000-4000rpm離心5-20min，得到 脫脂乳。然后，將脫脂乳用〇. 22μπι濾器過(guò)濾，收集濾液。
[0007] 親和層析具體操作為:將濾液上樣到經(jīng)2-10ms/cm，pH6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液或 Tris緩沖液平衡的含有親和固相吸附劑的親和層析柱(優(yōu)選HiTrap Heparin HP)上，流速 為1-51111/111；[11，用電導(dǎo)為1701118/0]1以下的氯化鈉或氯化鉀緩沖液4!16.〇-8.0的磷酸鹽緩沖 液或Tris緩沖液洗脫，收集富含乳鐵蛋白的洗脫液。
[0008] 高效液相色譜檢測(cè)具體操作為:將收集的富含乳鐵蛋白的洗脫液用0.22μπι濾器過(guò) 濾，收集濾液，上樣到粒徑為3.5μηι，規(guī)格為4.6mm X 25cm的04柱（優(yōu)選Waters X Bridge BH1300 C4色譜柱），進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。本發(fā)明還可以采用由不同公司提供的各種型 號(hào)和規(guī)格的反相柱進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。
[0009] 流動(dòng)相A為含有0.1 %三氟乙酸的20%乙腈水溶液，流動(dòng)相B為含有0.1 %三氟乙酸 的80%乙腈水溶液，柱溫為20-35°(3，檢測(cè)波長(zhǎng)為214-28011111，流速為0.3-11111/1^11。具體過(guò)程 見(jiàn)表1。
[0010]表1高效液相色譜檢測(cè)條件
[0012] 本發(fā)明所述乳鐵蛋白包括重組人乳鐵蛋白和牛內(nèi)源乳鐵蛋白。所述乳樣優(yōu)選轉(zhuǎn)基 因牛乳。
[0013] 本發(fā)明提供了一種成本低廉、檢測(cè)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高，可從乳樣中同時(shí)測(cè)定重組人乳 鐵蛋白和牛內(nèi)源乳鐵蛋白含量的方法，特別適用于轉(zhuǎn)基因乳樣中重組人乳鐵蛋白及牛內(nèi)源 乳鐵蛋白的檢測(cè)，本方法重復(fù)性好，具有較強(qiáng)的可操作性。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中人乳鐵蛋白的HPLC圖譜。
[0015]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。
[0016]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中親和色譜純化色譜圖，其中，F(xiàn)T為雜蛋白穿透組分;P為含 有乳鐵蛋白（重組人乳鐵蛋白和牛內(nèi)源乳鐵蛋白）組分。
[0017]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中分離重組人乳鐵蛋白與牛內(nèi)源乳鐵蛋白的HPLC圖譜，其 中，P1為重組人乳鐵蛋白分離峰;P2為牛內(nèi)源乳鐵蛋白分離峰。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0019] 實(shí)施例中所用的主要試劑如下：人、牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；乙腈購(gòu)自 賽默飛世爾科技有限公司；三氟乙酸購(gòu)自Sigma公司；95%乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司；二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉購(gòu)自西隴化工股份有限公司。
[0020] 實(shí)施例中所用的主要試驗(yàn)儀器如下：高效液相色譜1260Infinity購(gòu)自安捷倫科技 有限公司；Waters X Bridge BEH300C4色譜柱購(gòu)自沃特世公司；AKTA Purifier快速蛋白液 相層析系統(tǒng)、HiTrap Heparin HP購(gòu)自GE公司；臺(tái)式高速離心機(jī)5810R購(gòu)自Eppendorf公司。 [0021]實(shí)施例1人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
[0022] 準(zhǔn)確稱(chēng)取人和牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成濃度為4mg/ml、3.5mg/ml、3mg/ml、 2 · 5mg/ml、2mg/ml、lmg/ml的人乳鐵蛋白溶液以及濃度為1 · 5mg/ml、lmg/ml、0 · 8mg/ml、 0 · 5mg/ml、0 · 3mg/ml、0mg/ml的牛乳鐵蛋白溶液，使用高效液相色譜Waters X Bridge BEH300C4色譜柱測(cè)定，選擇波長(zhǎng)為280nm，繪制人乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y = 2108.9x-39.216 (R2 = 0.9998)，牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為7=1990.91+16.219(1?2 = 0.9997)。圖1為人乳鐵蛋白 的HPLC圖譜，圖2為牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。
[0023]實(shí)施例2含重組人乳鐵蛋白乳樣的預(yù)處理
[0024]收集含有重組人乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物奶樣，以轉(zhuǎn)基因牛奶為優(yōu)選。將上述 奶樣分裝于50ml離心管中，配平后置于臺(tái)式高速離心機(jī)中，以2000rpm離心10min，離心結(jié)束 后，棄去乳脂，得到脫脂乳。
[0025]實(shí)施例3親和色譜純化重組人乳鐵蛋白與牛內(nèi)源乳鐵蛋白 [0026] 實(shí)施例2得到的脫脂乳用0.22μπι濾器過(guò)濾，上樣到用3mS/cm，pH7.0磷酸鹽緩沖液 平衡的HiTrap Heparin HP層析柱上，流速為5ml/min，上樣結(jié)束后，使用84ms/cm的氯化鈉， PH7.0的磷酸鹽緩沖液洗脫含有乳鐵蛋白的純化液(洗脫液）。圖3為親和色譜純化色譜圖， FT為雜蛋白穿透組分;P為含有乳鐵蛋白（重組人乳鐵蛋白和牛內(nèi)源乳鐵蛋白）組分。
[0027]實(shí)施例4高效液相色譜測(cè)定重組人乳鐵蛋白與牛內(nèi)源乳鐵蛋白的含量 [0028] 實(shí)施例3得到的富含乳鐵蛋白的純化液用0.22μπι濾器過(guò)濾，取100μΙ溶液上機(jī)進(jìn) 樣，在高效液相色譜Waters X Bridge BEH300C4色譜柱中進(jìn)行梯度洗脫，方法如表2所示： [0029]表2梯度洗脫條件
[0031]結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因奶樣中重組人乳鐵蛋白濃度為3.3mg/ml，牛乳鐵蛋白濃度為 0.3mg/ml，圖4為分離重組人乳鐵蛋白與牛內(nèi)源乳鐵蛋白的HPLC圖譜，P1為重組人乳鐵蛋白 分離峰;P2為牛內(nèi)源乳鐵蛋白分離峰。
[0032]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)乳樣中乳鐵蛋白含量的方法，其特征在于，包括對(duì)乳樣離屯、脫脂，過(guò)濾，親和層 析純化W及用C4或C8色譜柱進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對(duì)乳樣離屯、脫脂的具體操作為:將乳樣W 2000-4000巧m離屯、5-20min，得到脫脂乳。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將脫脂乳用0.22μπι濾器過(guò)濾，收集濾液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，親和層析具體操作為:將濾液上樣到經(jīng)2- 10ms/cm，p冊(cè).0-8.0的憐酸鹽緩沖液或Tris緩沖液平衡的含有親和固相吸附劑的親和層析 柱上，流速為l-5ml/min，用電導(dǎo)為170ms/cmW下的氯化鋼或氯化鐘緩沖液，P冊(cè).0-8.0的憐 酸鹽緩沖液或Tris緩沖液洗脫，收集富含乳鐵蛋白的洗脫液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述親和層析柱為化化ap Heparin HP。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，高效液相色譜檢測(cè)具體操作為:將收集的 富含乳鐵蛋白的洗脫液用0.22μπι濾器過(guò)濾，收集濾液，上樣到粒徑為3.5μπι，規(guī)格為4.6mm X 25cm的C4色譜柱，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述C4柱為Waters X化idge B邸300 C4 色譜柱。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，流動(dòng)相A為含有0.1 %Ξ氣乙酸的20 %乙臘 水溶液，流動(dòng)相B為含有0.1 % Ξ氣乙酸的80 %乙臘水溶液，柱溫為20-35°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為 214-28〇11111，流速為0.3-11111/111；[]1;具體過(guò)程如下：9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述乳鐵蛋白包括重組人乳鐵蛋 白和牛內(nèi)源乳鐵蛋白。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述乳樣為轉(zhuǎn)基因牛乳。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)乳樣中乳鐵蛋白含量的方法，包括對(duì)乳樣離心脫脂，過(guò)濾，親和層析純化以及用C4或C8色譜柱進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)等步驟。本方法成本低廉、檢測(cè)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高，可從乳樣中同時(shí)測(cè)定重組人乳鐵蛋白和牛內(nèi)源乳鐵蛋白含量的方法，特別適用于轉(zhuǎn)基因乳樣中重組人乳鐵蛋白及牛內(nèi)源乳鐵蛋白的檢測(cè)，本方法重復(fù)性好，具有較強(qiáng)的可操作性。
【IPC分類(lèi)】G01N30/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105572246
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510917468
【發(fā)明人】趙建敏, 王建武, 王曦
【申請(qǐng)人】無(wú)錫科捷諾生物科技有限責(zé)任公司, 北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日