本發(fā)明屬于食品安全中非法添加物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)樣品中三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)背景

三聚氰胺簡(jiǎn)稱三胺，化學(xué)名1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨，分子式為C₃N₆H₆，相對(duì)分子質(zhì)量為126.12，是一種低毒無(wú)味的純白色單斜棱晶體，廣泛應(yīng)用于涂料、建材、造紙、皮革、紡織等行業(yè)中。由于三聚氰胺的含氮量高達(dá)66％，是蛋白質(zhì)平均含氮量的4倍，而常用的凱氏定氮法測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量時(shí)卻不能區(qū)分這種非蛋白氮，因此被不法商販利用添加在飼料和食品中以提高食品和飼料中粗蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)值。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，三聚氰胺對(duì)于哺乳動(dòng)物屬于微毒、低毒類化學(xué)物質(zhì)，長(zhǎng)期飼喂可能造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部出現(xiàn)結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。聯(lián)合國(guó)負(fù)責(zé)食品安全標(biāo)準(zhǔn)的機(jī)構(gòu)國(guó)際食品法典委員會(huì)2010年7月6日表示，該委員會(huì)已就食品中三聚氰胺的允許含量設(shè)立了新標(biāo)準(zhǔn)。新標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每千克嬰兒配方奶粉中的三聚氰胺含量不能超過(guò)1mg，而每千克其他食品或動(dòng)物飼料中的三聚氰胺含量不能超過(guò)2.5mg。因此，加強(qiáng)對(duì)三聚氰胺檢測(cè)技術(shù)的研究和快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展是非常有必要的。

目前，檢測(cè)三聚氰胺比較經(jīng)典的方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)等，這些都是比較傳統(tǒng)的方法，也是目前的確證方法。另外，目前常用的還有酶聯(lián)免疫法(ELISA)。但由于以上方法均需先進(jìn)檢測(cè)儀器，檢測(cè)費(fèi)用昂貴、步驟繁瑣耗時(shí)，且對(duì)操作人員專業(yè)性要求較高，不適用于基層企事業(yè)單位的大通量快速篩查檢測(cè)。膠體金免疫層析法具有檢測(cè)速度快、價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)三聚氰胺的主要監(jiān)控方法，但仍存在一些缺陷，如穩(wěn)定性較差、靈敏度較低、無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)、基質(zhì)效應(yīng)明顯背景干擾大，且顏色單一，難以實(shí)現(xiàn)多檢和聯(lián)檢。

熒光微球免疫層析技術(shù)是繼膠體金免疫層析技術(shù)后，在熒光染料標(biāo)記技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，作為一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，它是免疫親和技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫層析技術(shù)的結(jié)合，與膠體金免疫層析技術(shù)一樣具有快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但是相比膠體金等傳統(tǒng)標(biāo)記物，熒光微球的發(fā)光強(qiáng)度可以隨激發(fā)光的強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)，所以熒光微球標(biāo)記有望提高免疫層析技術(shù)的檢測(cè)限；而在微球殼結(jié)構(gòu)的作用下，熒光微球具有相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高、重復(fù)性好，有較好的生物相容性；且形成微球后染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定，且基本不受外界環(huán)境介質(zhì)變化的影響。因此相比上述檢測(cè)方法，熒光微球免疫層析技術(shù)同時(shí)具有檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、價(jià)格低廉的檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述試紙條的制備方法；本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述試紙條在檢測(cè)三聚氰胺中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的一個(gè)技術(shù)方案是：

提供一種檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條，它包括底板及在底板上依次搭接粘貼的樣品結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述樣品結(jié)合墊上包埋有熒光微球標(biāo)記的抗三聚氰胺單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測(cè)區(qū)噴涂有三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)噴涂有羊抗鼠抗抗體。

所述三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由三聚氰胺半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白或人血清白蛋白，所述三聚氰胺半抗原是由三聚氰胺與琥珀酰亞胺基丙醛反應(yīng)得到，分子結(jié)構(gòu)式為：

所述熒光微球是直徑為100～300nm的用聚苯乙烯包裹熒光物質(zhì)的微球，其表面連接有—COOH基團(tuán)，所述熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素。

本發(fā)明采取的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種制備上述檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條的方法，它包括如下步驟：

1)樣品結(jié)合墊的制備：用市售的熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體，并將其以特定緩沖體系稀釋后，將樣品結(jié)合墊浸泡于稀釋緩沖液中，經(jīng)真空冷凍干燥后制備；

2)硝酸纖維素膜的制備：將三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物噴涂到硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)范圍，制成檢測(cè)區(qū)；將羊抗鼠抗抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)范圍，制成質(zhì)控區(qū)；

3)組裝和剪切：在底板上依次搭接地粘貼包埋有熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體的樣品結(jié)合墊、固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜及吸水墊，并剪切成所需的寬度即為熒光微球免疫層析試紙條。

具體地說(shuō)，步驟包括：

1)將三聚氰胺與琥珀酰亞胺基丙醛反應(yīng)，制備三聚氰胺半抗原；

2)將三聚氰胺半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；

3)用三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)融合、篩選，得到分泌三聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；

5)分別將三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠抗抗體噴涂到硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)范圍(T)和質(zhì)控區(qū)范圍(C)；

6)將樣品結(jié)合墊用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖體系中的終濃度為0.5％體積百分含量)、pH7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液均勻浸泡2h，37℃下烘干2h；

7)用市售的熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體，并將其以特定緩沖體系稀釋后，將6)處理過(guò)的樣品結(jié)合墊浸泡于稀釋緩沖液中，經(jīng)真空冷凍干燥后備用；

8)在底板上依次搭接地粘貼包埋有熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體的樣品結(jié)合墊、固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜及吸水墊，并剪切成所需的寬度即為熒光微球免疫層析試紙條。

本發(fā)明采取的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種上述檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條在檢測(cè)三聚氰胺中的應(yīng)用，它包括如下步驟：

1)樣品前處理；

2)用所述的檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)；

3)用熒光檢測(cè)儀分析檢測(cè)結(jié)果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)特異性強(qiáng)、靈敏度高：本試紙條采用將熒光微球標(biāo)記的抗三聚氰胺單克隆抗體包埋在樣品結(jié)合墊上，具有親水性佳、可大容量吸附抗體偶聯(lián)物、迅速重濕潤(rùn)、抗體結(jié)合物釋放充分、性能好、釋放快、形態(tài)好等優(yōu)勢(shì)，從而減少誤差，降低成本，增加整個(gè)體系的反應(yīng)靈敏度；

(2)熒光微球表面包裹了聚苯乙烯，實(shí)現(xiàn)了對(duì)熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素的保護(hù)，減少了外界環(huán)境的干擾，增加了熒光微球的穩(wěn)定性及熒光壽命；

(3)熒光微球表面修飾活性基團(tuán)—COOH，采用化學(xué)偶聯(lián)的方法來(lái)標(biāo)記抗體，形成抗體與微球的穩(wěn)定結(jié)合。

附圖說(shuō)明

圖1為熒光微球免疫層析試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為熒光微球免疫層析試紙條俯視圖；

圖3為三聚氰胺半抗原合成路線圖；

圖4為三聚氰胺半抗原核磁共振氫譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條的構(gòu)成

所述試紙條(圖1、圖2)是由底板、樣品結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組成；

所述樣品結(jié)合墊1、硝酸纖維素膜2和吸水墊3依次按順序搭接粘貼在底板6上，樣品結(jié)合墊的末端與硝酸纖維素膜的始端相連，硝酸纖維素膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品結(jié)合墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊；

所述硝酸纖維素膜上固定有檢測(cè)區(qū)4和質(zhì)控區(qū)5，檢測(cè)區(qū)噴涂有三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物(三聚氰胺半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物)，質(zhì)控區(qū)噴涂有羊抗鼠抗抗體；

所述底板為PVC底板；所述樣品結(jié)合墊為玻璃棉；所述吸水墊為吸水紙。

實(shí)施例2檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條的制備

檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條的制備方法主要包括以下步驟：

1)樣品結(jié)合墊的制備：用市售的熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體，并將其以特定緩沖體系稀釋后，將樣品結(jié)合墊浸泡于稀釋緩沖液中，經(jīng)真空冷凍干燥后制備；

2)硝酸纖維素膜的制備：將三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物噴涂到硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)范圍，制成檢測(cè)區(qū)；將羊抗鼠抗抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)范圍，制成質(zhì)控區(qū)；

3)組裝和剪切：在底板上依次搭接地粘貼包埋有熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體的樣品結(jié)合墊、固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜及吸水墊，并剪切成所需的寬度即為熒光微球免疫層析試紙條。

下面分步詳細(xì)敘述：

(一)各部件的制備

1、三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定

三聚氰胺是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。

(1)三聚氰胺半抗原的制備(圖3)

取三聚氰胺0.5g，加乙醇80mL溶解，加琥珀酰亞胺基丙醛0.67g，加三乙胺0.1mL，60℃油浴加熱，攪拌反應(yīng)4h。停止反應(yīng)冷卻到室溫，轉(zhuǎn)入0～5℃低溫下平衡溫度30min，攪拌，加硼氫化鈉0.3g，繼續(xù)攪拌2h。停止反應(yīng)，旋蒸，除去乙醇，加水，乙酸乙酯，萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥蒸干，上硅膠柱進(jìn)行層析純化，洗脫液二氯甲烷/甲醇(v/v，10/1)洗脫分離，得到半抗原產(chǎn)物0.91g，收率87.19％。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ：6.99(4H,s)，6.94(2H,s)，4.40(2H,t)，4.0(1H,s)，3.35(2H,t,J＝7.500)，1.83(1H,m,J＝7.017)。

取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，如圖4所示，圖譜中化學(xué)位移δ＝4.40、3.35、1.83的為半抗原間隔臂上亞甲基氫共振吸收峰，δ＝6.94的為間隔臂上雙鍵氫的共振吸收峰，這些峰的存在，證明半抗原合成成功。。

(2)免疫原的制備

取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加pH值為4.5的醋酸鹽緩沖液5mL，溶解，加50mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)0.2mL，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到7.4，得到蛋白活化液A液；取4mg三聚氰胺半抗原產(chǎn)物，加甲醇0.2mL溶解澄清，得到B液；將B液逐滴加到A液中，繼續(xù)攪拌5h，停止反應(yīng)，0.02mol/L PBS緩沖液透析純化3d，每天換液3次，得到免疫原，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)包被原的制備

取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液5mL，溶解，加50mmol/L DTT 0.2mL，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，得到蛋白活化液A液；取3mg三聚氰胺半抗原產(chǎn)物，加乙醇100μL溶解，得到B液；將B液滴加到A液中，室溫?cái)嚢?h，0.02mol/L PBS緩沖液透析純化3d，每天換液3次，得到包被原，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定

將三聚氰胺半抗原、載體蛋白、三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS緩沖液配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4的PBS緩沖液調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)200～800nm范圍內(nèi)掃描，得到三聚氰胺半抗原、載體蛋白、三聚氰胺半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明三聚氰胺半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2、三聚氰胺單克隆抗體的制備

(1)動(dòng)物免疫

將步驟1得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。

(2)細(xì)胞融合和克隆化

取產(chǎn)生特異性抗體的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，得到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。

(4)單克隆抗體的制備與純化

采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，7～14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7～10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-20℃保存。

3、羊抗鼠抗抗體的制備

以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。

4、熒光微球標(biāo)記抗三聚氰胺單克隆抗體的制備

(1)活化：取市售的內(nèi)部包埋熒光染料、表面修飾有羧基官能團(tuán)的微球懸液100μL混懸于900μL活化緩沖液中，于4℃10000r/min離心10min后棄上清，重懸微球于1mL活化緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入適量活化劑，混勻后室溫震蕩活化10min；

(2)偶聯(lián)：將(1)所述混懸液于4℃10000r/min離心10min后棄上清，重懸于偶聯(lián)緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入10～20μL抗三聚氰胺單克隆抗體溶液(蛋白濃度1mg/mL)，混勻后室溫震蕩偶聯(lián)120min；

(3)封閉：將(2)所述混懸液于4℃10000r/min離心10min后棄上清，重懸于封閉緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后室溫震蕩封閉30min；

(4)貯存：將(3)所述混懸液于4℃10000r/min離心10min后棄上清，重懸于貯存緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后于4℃避光保存。

所述活化緩沖液為pH 5.5～6.5、0.05mol/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液。

所述活化劑為水溶性碳二亞胺，其中摩爾質(zhì)量比EDC∶NHS∶COOH＝(1.5～3)∶(8～20)∶1，臨用前用活化緩沖液稀釋至所需濃度。

所述偶聯(lián)緩沖液為pH 7.5～8.5、0.05mol/L的硼酸鹽緩沖液(避免使用存在游離胺的溶劑)。

所述封閉緩沖液為含0.1～0.4mol/L伯胺(鹽酸羥胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1％～10％BSA的pH 7.4的PB緩沖液。

所述貯存緩沖液為含0.01％NaN₃、0.1％BSA的pH 7.4的PB緩沖液。

5、樣品結(jié)合墊的制備

(1)將樣品結(jié)合墊用含牛血清白蛋白(BSA在緩沖體系中的終濃度為0.5％體積百分含量)、pH7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液均勻浸泡2h，37℃下烘干2h；

(2)將貯存的熒光微球標(biāo)記的抗三聚氰胺單克隆抗體以貯存緩沖液稀釋后，將(1)處理過(guò)的樣品結(jié)合墊浸泡于稀釋緩沖液中，經(jīng)真空冷凍干燥后備用。

6、硝酸纖維素(NC)膜的制備

用0.05mol/L、pH7.2的PBS緩沖液將三聚氰胺半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到100μg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其噴涂于NC膜上的檢測(cè)區(qū)(T)，噴膜量為1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其噴涂于NC膜上的質(zhì)控區(qū)(C)，噴膜量為1.0μL/cm。將制備好的NC膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

(二)試紙條的組裝

將樣品結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊從左至右依次搭接粘貼固定在底板上，樣品結(jié)合墊的末端與硝酸纖維素膜的始端相連，硝酸纖維素膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品結(jié)合墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊，然后用機(jī)器切成3.96mm寬的小條，裝在特制的塑料制卡中，形成試紙卡。三聚氰胺熒光微球免疫層析試紙卡在2～8℃陰涼避光干燥保存，有效期為12個(gè)月。

實(shí)施例3檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條的應(yīng)用

1、樣品前處理

將待檢牛奶樣品置于60～70℃水浴5min，取出，待檢。

2、用試紙條檢測(cè)

吸取100μL待檢樣本溶液垂直滴加于試紙卡加樣孔中，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min；將試紙卡插入KFT-100A型熒光檢測(cè)儀的承載器中，通過(guò)觸摸顯示屏選擇待檢項(xiàng)目，按下“開始檢測(cè)”按鍵，熒光檢測(cè)儀將自動(dòng)對(duì)試紙卡進(jìn)行掃描測(cè)試；通過(guò)儀器的顯示屏幕上讀取或打印檢測(cè)結(jié)果。

3、檢測(cè)結(jié)果分析

測(cè)試完成后，儀器將根據(jù)檢測(cè)得到的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，自動(dòng)計(jì)算出牛奶樣本中三聚氰胺的濃度值，并根據(jù)預(yù)設(shè)的閾值給出陰陽(yáng)性判斷。

陰性(－)：若熒光檢測(cè)儀的顯示屏幕上結(jié)果顯示為陰性，表示樣本中不含有三聚氰胺或其濃度低于檢測(cè)限。

陽(yáng)性(+)：若熒光檢測(cè)儀的顯示屏幕上結(jié)果顯示為陽(yáng)性，表示樣本中三聚氰胺濃度等于或高于檢測(cè)限。

無(wú)效：若質(zhì)控區(qū)未檢出熒光信號(hào)強(qiáng)度，表明不正確的操作過(guò)程或試紙卡已失效。

實(shí)施例4檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條技術(shù)參數(shù)的確定

1、檢測(cè)限試驗(yàn)

向空白牛奶樣品中分別添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為0、5.0、10、20μg/L，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為：當(dāng)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、5.0μg/L時(shí)，熒光檢測(cè)儀結(jié)果顯示為陰性；當(dāng)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10、20μg/L時(shí)，熒光檢測(cè)儀結(jié)果顯示為陽(yáng)性，表明本試紙條對(duì)牛奶樣品中三聚氰胺的檢測(cè)限為10μg/L。

2、假陽(yáng)性率、假陰性率試驗(yàn)

取已知三聚氰胺含量大于10μg/L的陽(yáng)性牛奶樣本和三聚氰胺含量小于10μg/L的陰性牛奶樣本各20份，用3個(gè)批次生產(chǎn)的熒光微球免疫層析試紙條分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算其陰陽(yáng)性率。結(jié)果見表1。

表1檢測(cè)陽(yáng)性、陰性樣本結(jié)果

結(jié)果表明：用3個(gè)批次生產(chǎn)的試紙條檢測(cè)陽(yáng)性樣本時(shí)，結(jié)果全為陽(yáng)性，可知陽(yáng)性符合率為100％，假陰性率為0；檢測(cè)陰性樣本時(shí)，結(jié)果全為陰性，可知陰性符合率為100％，假陽(yáng)性率為0。說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)三聚氰胺殘留的熒光微球免疫層析試紙條可以對(duì)牛奶樣品中三聚氰胺殘留進(jìn)行快速檢測(cè)。