Miltenberger抗體檢測(cè)免疫熒光層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開(kāi)了一種Miltenberger血型抗體檢測(cè)免疫熒光層析試紙條，該試紙條由依次在襯板上相互搭接的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊組成，所述樣品墊兩端分別設(shè)置有第一加樣點(diǎn)和第二加樣點(diǎn)，所述反應(yīng)膜固定有一條內(nèi)部質(zhì)控帶和至少一條抗體檢測(cè)帶。通過(guò)上述方式，本實(shí)用新型能夠解決我國(guó)乃至世界上目前缺乏簡(jiǎn)便實(shí)用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測(cè)技術(shù)和試劑的難題，輔助臨床因Miltenberger血型抗體引起的新生兒溶血病、輸血不良反應(yīng)等疾病的診斷，保障臨床安全、有效、科學(xué)輸血。
【專利說(shuō)明】Mi Itenberger抗體檢測(cè)免疫熒光層析試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域,特別是涉及一種Miltenberger抗體檢測(cè)免疫突光層析試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]麗S血型系統(tǒng)是繼ABO之后發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)血型系統(tǒng)，其抗原的多態(tài)性數(shù)目?jī)H次于Rh血型系統(tǒng)。MNS血型系統(tǒng)中有一類特殊的Miltenberger亞血型系統(tǒng),其血型抗原是以人血清免疫抗體所鑒定的一系列低頻率抗原組合的紅細(xì)胞表型。該亞系統(tǒng)中Mur、Mil等幾個(gè)抗原的發(fā)生頻率在歐洲白人中低于千分之一，而在中國(guó)人和其他亞洲人群中為39TlO%。一項(xiàng)針對(duì)844名廣西侗族人群的調(diào)查顯示，Mur稀有血型抗原陽(yáng)性率為15.4%。而林瑪利等人在1990年針對(duì)臺(tái)灣各種族的調(diào)查顯示，高山原居民的阿美族的Mur血型陽(yáng)性率則高達(dá)88.4%。
[0003]抗-Mur發(fā)生率在東南亞地區(qū)很高，特別是在我國(guó)臺(tái)灣、香港人群中抗-Mur的發(fā)生頻率甚至僅次于抗-A/抗-B。臨床報(bào)告證實(shí)抗-Mur抗體會(huì)導(dǎo)致同種異型免疫性疾病，如輸血不良反應(yīng)、新生兒溶血病等。伴隨全球化進(jìn)程，各種族和各國(guó)人口在全世界的流動(dòng)加快，使得Mur抗原在世界各國(guó)的臨床意義日益重要。血液免疫學(xué)理論和臨床實(shí)際都明確提出，在亞洲各國(guó)應(yīng)用的血型抗體篩查紅細(xì)胞組和血型抗體鑒定的譜細(xì)胞中應(yīng)該有Mur抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞。由于缺少相關(guān)試劑，多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用的抗體篩查細(xì)胞中并沒(méi)有包含Miltenberger血型抗原，常規(guī)檢測(cè)無(wú)法鑒定抗體的特異性，導(dǎo)致對(duì)存在該抗體的患者漏檢。由于新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間很短(最多3個(gè)月)，Miltenberger抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞來(lái)源非常有限，Miltenberger血型篩查及其抗體的檢測(cè)受到極大地限制。目前Miltenberger血型抗體檢測(cè)中面臨的幾個(gè)主要問(wèn)題是:1)由于臨床檢測(cè)譜細(xì)胞中未使用相應(yīng)篩選紅細(xì)胞，不規(guī)則抗體經(jīng)常漏檢；2)含有稀有抗原的篩選紅細(xì)胞的穩(wěn)定供應(yīng)得不到長(zhǎng)期保證；3)新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間極短。
[0004]由于至今也無(wú)商品化供應(yīng)的抗Miltenberger血型抗原的單克隆抗體,人源血型試劑(人紅細(xì)胞試劑和人血清抗體試劑)的固有缺點(diǎn)以及沒(méi)有合適的試驗(yàn)方法，世界各國(guó)目前臨床上不能夠常規(guī)開(kāi)展Miltenbergerr血型相容性試驗(yàn),只在少數(shù)的大型血液中心和血型參比試驗(yàn)室對(duì)一些疑難的血型不相容疾病病人進(jìn)行相關(guān)的檢驗(yàn)工作。至今，臨床上不能常規(guī)開(kāi)展Miltenberger血型相容性實(shí)驗(yàn)的具體障礙和問(wèn)題是:Miltenberger抗原試劑和抗體試劑都短缺，紅細(xì)胞血球試劑和人血清抗體試劑的固有缺點(diǎn)，以及目前應(yīng)用的免疫血清學(xué)試驗(yàn)技術(shù)方法的缺點(diǎn)等。我國(guó)臨床對(duì)于Miltenberger血型抗原抗體的重要性及檢測(cè)方法的相關(guān)研究也很少，目前僅限個(gè)案報(bào)道。
[0005]澳大利亞CSL公司利用Kode?技術(shù)，將合成的多肽抗原連接到紅細(xì)胞上，制備得到篩檢抗-Mur抗體及抗-MUT抗體的紅細(xì)胞。這種技術(shù)是將紅細(xì)胞與含有功能(表位)基團(tuán)-連接鏈-脂肪基團(tuán)(function-epitope-spacer lipid, FSL)的液體混合一段時(shí)間，攜帶有特殊抗原表位的FSL可以模擬糖脂結(jié)構(gòu)結(jié)合于紅細(xì)胞表面，從而改變紅細(xì)胞的血型。但這種技術(shù)只能增加抗原，而不能封閉原有的紅細(xì)胞抗原。這一篩查紅細(xì)胞已經(jīng)被用來(lái)進(jìn)行大規(guī)模的抗體篩檢。但CSL公司利用Kode?技術(shù)所制備的仍然是基于存活紅細(xì)胞的血型抗原試齊U，上述提到的幾個(gè)根本問(wèn)題并沒(méi)有得到解決，存在于存活的紅細(xì)胞膜上的血型抗原，由于紅細(xì)胞容易溶血，抗原性也隨之消亡。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0006]本實(shí)用新型主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種Miltenberger抗體檢測(cè)免疫熒光層析試紙條，免疫熒光層析技術(shù)操作快速簡(jiǎn)便，結(jié)合檢測(cè)儀器能夠?qū)崿F(xiàn)半定量或定量檢測(cè)；該技術(shù)能夠解決我國(guó)乃至世界上目前缺乏簡(jiǎn)便實(shí)用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測(cè)技術(shù)和試劑的難題，輔助臨床因MiItenberger血型抗體弓丨起的新生JL溶血病、輸血不良反應(yīng)等疾病的診斷，以及進(jìn)行輸血前相容性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，保障臨床安全、有效、科學(xué)輸血。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本實(shí)用新型采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種Miltenberger抗體檢測(cè)免疫突光層析試紙條,包括反應(yīng)膜、樣品墊、吸收墊和襯板，所述反應(yīng)膜位于所述底板上，所述反應(yīng)膜上固定有檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，所述樣品墊和所述吸收墊分別與所述反應(yīng)膜的兩側(cè)部分重疊，并位于所述反應(yīng)膜和所述底板上，所述樣品墊上包括第一加樣點(diǎn)和第二加樣點(diǎn)，所述第一加樣點(diǎn)設(shè)置在遠(yuǎn)離所述樣品墊與所述反應(yīng)膜重疊的一偵U，所述第二加樣點(diǎn)設(shè)置在接近所述樣品墊與所述反應(yīng)膜重疊的一側(cè)。
[0008]在本實(shí)用新型一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述樣品墊或所述吸收墊與所述反應(yīng)膜的兩側(cè)重疊部分的長(zhǎng)度為0.5 mm。
[0009]在本實(shí)用新型一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述反應(yīng)膜的材料為硝酸纖維素膜、醋酸纖維膜、尼龍膜和聚四氟乙烯膜中的一種。
[0010]在本實(shí)用新型一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述質(zhì)控帶上固定有人IgG和人IgM，所述檢測(cè)帶為至少一條，所述檢測(cè)帶上固定有鏈霉親和素。
[0011]本實(shí)用新型的有益效果是:免疫熒光層析技術(shù)操作快速簡(jiǎn)便，結(jié)合檢測(cè)儀器能夠?qū)崿F(xiàn)半定量或定量檢測(cè)；該技術(shù)能夠解決我國(guó)乃至世界上目前缺乏簡(jiǎn)便實(shí)用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測(cè)技術(shù)和試劑的難題,輔助臨床因Miltenberger血型抗體引起的新生兒溶血病、輸血不良反應(yīng)等疾病的診斷，以及進(jìn)行輸血前相容性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，保障臨床安全、有效、科學(xué)輸血。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]為了更清楚地說(shuō)明本實(shí)用新型實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本實(shí)用新型的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
[0013]圖1是本實(shí)用新型Miltenberger抗體檢測(cè)免疫突光層析試紙條一較佳實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]附圖中各部件的標(biāo)記如下:1、第一加樣點(diǎn)，2、樣品墊，3、第二加樣點(diǎn)，4、檢測(cè)帶，5、反應(yīng)膜，6、質(zhì)控帶,7、吸收墊,8、襯板?！揪唧w實(shí)施方式】
[0015]下面將對(duì)本實(shí)用新型實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本實(shí)用新型的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒緦?shí)用新型中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本實(shí)用新型保護(hù)的范圍。
[0016]實(shí)施例一:
[0017]請(qǐng)參閱圖1，一種Miltenberger抗體檢測(cè)免疫突光層析試紙條,包括反應(yīng)膜5、樣品墊2、吸收墊7和襯板8，所述反應(yīng)膜5位于所述襯板8上，所述反應(yīng)膜5上固定有檢測(cè)帶4和質(zhì)控帶6，所述樣品墊2和所述吸收墊7分別與所述反應(yīng)膜5的兩側(cè)部分重疊，并位于所述反應(yīng)膜5和所述襯板8上，所述樣品墊2上包括第一加樣點(diǎn)I和第二加樣點(diǎn)3，所述第一加樣點(diǎn)I設(shè)置在遠(yuǎn)離所述樣品墊2與所述反應(yīng)膜5重疊的一側(cè)，所述第二加樣點(diǎn)3設(shè)置在接近所述樣品墊2與所述反應(yīng)膜5重疊的一側(cè)。
[0018]優(yōu)選的，所述反應(yīng)膜5的材料為硝酸纖維素膜、醋酸纖維膜、尼龍膜和聚四氟乙烯膜中的一種。所述質(zhì)控帶6上固定有人IgG和人IgM。所述檢測(cè)帶4為至少一條，所述檢測(cè)帶4上固定有鏈霉親和素。
[0019]實(shí)施例二:
[0020]提供一種實(shí)施例一所述試紙條用于Miltenberger血型抗體篩檢的檢測(cè)方法:
[0021](I)試紙條的制備:
[0022]I)選取Millipore HF 180帶背襯膜作為反應(yīng)膜，將其裁成30X 1.8 cm大小備用，將人IgG和人IgM使用0.01 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)其濃度為0.5 mg/mL，加入體積分?jǐn)?shù)為1%的Tween-20，使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為質(zhì)控帶，劃膜量為0.5 μ L/cm。將鏈霉親和素應(yīng)用0.15 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)至濃度為0.1 mg/mL,使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為檢測(cè)帶，每條線間隔為5 _，劃膜結(jié)束后立即放入37°C烘箱中干燥過(guò)夜，室溫保存?zhèn)溆茫?br> [0023]2)試紙條的組裝
[0024]選取國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)玻璃纖維膜BT100作為樣品墊的材料，將其剪成30X1.8 cm大小備用，選取國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)吸水紙CH37K作為吸收墊的材料，并將其剪裁成30 X 1.8 cm大小備用，在規(guī)格為30 X 6 cm的PVC襯板上首先黏貼反應(yīng)膜，然后將樣品墊與吸收墊采取搭接的方法黏貼于襯板上，搭接的長(zhǎng)度為0.5 mm，以便于反應(yīng)液的擴(kuò)散，組裝好后，將其切成4 mm寬的試紙條，并封裝于塑料外殼中，放于鋁箔袋中，4°C密封保存。
[0025]3)熒光反應(yīng)液的制備
[0026]將抗人IgG或抗人IgM抗體溶液磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至濃度為2 mg/mL, pH為7.5至8.0，取I mL抗體溶液，緩慢加入100 μ L濃度為I mg/mL的Cy5熒光染料，在4°C緩慢攪拌3 h后在室溫反應(yīng)I h，再用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析，去除未反應(yīng)的Cy5染料。透析液完成后回收偶聯(lián)好的熒光抗體，測(cè)定偶聯(lián)效率與抗體濃度后，在4°C下避光保存。
[0027](2)檢測(cè)樣本的制備
[0028]I)待檢病人血清
[0029]抽取待檢患者靜脈血分離血清；[0030]2)待檢血清與多肽抗原孵育
[0031]將對(duì)應(yīng)Miltenberger 亞血型系統(tǒng)中 Mia (MNS7)、Mur (MNS10)、Hil (MNS20)以及MUT (麗S35)血型抗原氨基酸序列的多肽以0.15 M pH 7.2 PBS溶解至10 mg/mL，取50μ L多肽抗原與50 μ L待檢血清混勻后,室溫孵育I h備用。
[0032](3)檢測(cè)步驟
[0033]I)將試紙條和反應(yīng)液平衡至室溫(18-250C )；
[0034]2)加入10 μ L待檢血清與多肽抗原的混合液至樣品墊中；
[0035]3)加入10 μ L含有體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween-20的pH為7.2的0.15M PBS至
樣品塾中；
[0036]4)重復(fù)步驟3)3次；
[0037]5)加入5 μ L Cy5-抗人IgG和/或抗人IgM至樣品墊中；
[0038]6)重復(fù)步驟3)3次；
[0039]7)將試紙條置于熒光信號(hào)讀取儀器中，讀取熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定。
[0040]實(shí)施例三:
[0041]提供一種實(shí)施例一所述試紙條用于Miltenberger血型抗體特異性鑒定的檢測(cè)方法:
[0042](I)試紙條的制備:
[0043]I)選取Millipore HF 180帶背襯膜作為反應(yīng)膜，將其裁成30X 1.8 cm大小備用，將人IgG和人IgM使用0.01 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)其濃度為0.5 mg/mL,加入體積分?jǐn)?shù)為1%的Tween-20，使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為質(zhì)控帶6，劃膜量為0.5 μ L/cm。將鏈霉親和素應(yīng)用0.15 M的pH值為7.2的PBS調(diào)節(jié)至濃度為0.1 mg/mL,使用劃膜儀將其噴于NC膜表面作為檢測(cè)帶，每條線間隔為5 _，劃膜結(jié)束后立即放入37°C烘箱中干燥過(guò)夜，室溫保存?zhèn)溆茫?br> [0044]2)試紙條的組裝
[0045]選取國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)玻璃纖維膜BT100作為樣品墊的材料，將其剪成30X1.8 cm大小備用，選取國(guó)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)吸水紙CH37K作為吸收墊的材料，并將其剪裁成30 X 1.8 cm大小備用，在規(guī)格為30 X 6 cm的PVC襯板上首先黏貼反應(yīng)膜，然后將樣品墊與吸收墊采取搭接的方法黏貼于襯板上，搭接的長(zhǎng)度為0.5 mm，以便于反應(yīng)液的擴(kuò)散，組裝好后，將其切成4 mm寬的試紙條，并封裝于塑料外殼中，放于鋁箔袋中，4°C密封保存。
[0046]3)熒光反應(yīng)液的制備
[0047]將抗人IgG或抗人IgM抗體溶液磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至濃度為2 mg/mL, pH為7.5至8.0，取I mL抗體溶液，緩慢加入100 μ L濃度為I mg/mL的Cy5熒光染料，在4°C緩慢攪拌3 h后在室溫反應(yīng)I h，再用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析，去除未反應(yīng)的Cy5染料。透析液完成后回收偶聯(lián)好的熒光抗體，測(cè)定偶聯(lián)效率與抗體濃度后，在4°C下避光保存。
[0048](2)檢測(cè)樣本的制備
[0049]I)待檢病人血清
[0050]抽取待檢患者靜脈血分離血清；
[0051]2)待檢血清與多肽抗原孵育[0052]將對(duì)應(yīng)Miltenberger 亞血型系統(tǒng)中 Mia (MNS7)、Mur (MNS10)、Hil (MNS20)以及MUT (麗S35)血型抗原氨基酸序列的多肽分別以0.15 M pH 7.2 PBS溶解至10 mg/mL，取50 μ L多肽抗原與50 μ L待檢血清混勻后，室溫孵育I h備用。
[0053](3)檢測(cè)步驟
[0054]I)將試紙條和反應(yīng)液平衡至室溫(18-250C )；
[0055]2)加入10 μ L待檢血清與多肽抗原的混合液至樣品墊中；
[0056]3)加入10 μ L含有體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween-20的pH為7.2的0.15M PBS至
樣品塾中；
[0057]4)重復(fù)步驟3)3次；
[0058]5)加入5 μ L Cy5_抗人IgG和/或抗人IgM至樣品墊中；
[0059]6)重復(fù)步驟3)3次；
[0060]7)將試紙條置于熒光信號(hào)讀取儀器中，讀取熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定。
[0061]本實(shí)用新型Miltenberger血型抗體檢測(cè)免疫突光層析試紙條的有益效果是:免疫熒光層析技術(shù)操作快速簡(jiǎn)便，結(jié)合檢測(cè)儀器能夠?qū)崿F(xiàn)半定量或定量檢測(cè)；該技術(shù)能夠解決我國(guó)乃至世界上目前缺乏簡(jiǎn)便實(shí)用的臨床常規(guī)Miltenberger血型抗體檢測(cè)技術(shù)和試劑的難題，輔助臨床因Miltenberger血型抗體引起的新生兒溶血病、輸血不良反應(yīng)等疾病的診斷，以及進(jìn)行輸血前相容性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，保障臨床安全、有效、科學(xué)輸血。
[0062]以上所述僅為本實(shí)用新型的實(shí)施例，并非因此限制本實(shí)用新型的專利范圍，凡是利用本實(shí)用新型說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本實(shí)用新型的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種Miltenberger抗體檢測(cè)免疫突光層析試紙條,其特征在于,包括反應(yīng)膜、樣品墊、吸收墊和襯板，所述反應(yīng)膜位于所述底板上，所述反應(yīng)膜上固定有檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，所述樣品墊和所述吸收墊分別與所述反應(yīng)膜的兩側(cè)部分重疊，并位于所述反應(yīng)膜和所述底板上，所述樣品墊上包括第一加樣點(diǎn)和第二加樣點(diǎn)，所述第一加樣點(diǎn)設(shè)置在遠(yuǎn)離所述樣品墊與所述反應(yīng)膜重疊的一側(cè)，所述第二加樣點(diǎn)設(shè)置在接近所述樣品墊與所述反應(yīng)膜重疊的一側(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述樣品墊或所述吸收墊與所述反應(yīng)膜的兩側(cè)重疊部分的長(zhǎng)度為0.5 mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述反應(yīng)膜的材料為硝酸纖維素膜、醋酸纖維膜、尼龍膜和聚四氟乙烯膜中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述質(zhì)控帶上固定有人IgG和人IgM，所述檢測(cè)帶為至少一條，所述檢測(cè)帶上固定有鏈霉親和素。
【文檔編號(hào)】G01N33/80GK203490226SQ201320431392
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】丁少華, 李勇, 尹煥才, 段生寶, 王紅梅, 田晶晶, 陳曄洲, 李冬 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所