本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學，蛋白多肽檢測技術領域，特別涉及一種能夠利用SELDI-TOF-MS來檢測金屬蛋白酶ADAMTS13酶活性的方法，應用于對TMA疾病中的TTP疾病篩查，以及TTP疾病治療監(jiān)控。
背景技術：
SELDI-TOF-MS(表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜)是由美國Ciphergen公司研制的新型質(zhì)譜分析儀器，其主要有三部分組成：第一部分是蛋白質(zhì)芯片(Protein Chip)，是其核心技術；第二部分是飛行時間質(zhì)譜儀(TOF MS)，也可以稱做芯片閱讀器(protein chip reader)；第三部分是系統(tǒng)專用分析軟件。
蛋白質(zhì)芯片是SELDI-TOF-MS的核心技術，本檢測方法將采用金屬親和吸附芯片(Immobilized Metal Affinity Capture，IMAC)，IMAC芯片表面可以螯合正二價金屬離子Ni，可以特異性的捕獲帶有組氨酸基團的蛋白質(zhì)多肽。
芯片閱讀器，就是激光解析電離飛行時間質(zhì)譜儀。其通過激光脈沖輻射將樣品轉(zhuǎn)化為運動的氣態(tài)離子并按質(zhì)荷(M/Z)大小進行分離，根據(jù)不同質(zhì)荷比在電場中飛行時間長短不一，從而繪制出一張質(zhì)譜圖。
系統(tǒng)專用分析軟件用來處理實驗所得的數(shù)據(jù)。通過對已知數(shù)據(jù)進行對比分析，從而發(fā)現(xiàn)有鑒別意義的峰值變化。
SELDI-TOF-MS技術操作步驟可以分為以下幾步：
1、被分析的樣品直接點樣到芯片陣列進行反應，樣品中的蛋白多肽特異性結(jié)合到芯片上進行反應；
2、芯片沖洗，把未結(jié)合和非特異性結(jié)合的小分子物質(zhì)洗脫掉，從而除去樣品中的“噪聲”，降低背景；
3、在芯片上加能量吸收物質(zhì)(energy absorbing molecule，EAM)，當激光照射芯片時，它能把激光的能量轉(zhuǎn)化為熱能；
4、樣品中的蛋白多肽吸收能量后，被解吸而發(fā)生離子化，通過真空管飛到離子檢測器，這樣質(zhì)荷比不同其飛行時間不同，所以不同的蛋白多肽即可根據(jù)質(zhì)荷比而被分離。
血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)是一組具有共同病理特征的急性臨床病理綜合征，分為遺傳性和獲得性，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞腫脹脫落、內(nèi)皮下絨毛狀物質(zhì)沉積和血管腔內(nèi)血小板聚集形成微血栓、血管腔內(nèi)栓塞及紅細胞碎裂等微血管系統(tǒng)異常。
TMA臨床上主要表現(xiàn)為血小板減少、溶血性貧血和微循環(huán)中血小板血栓造成的器官受累，其臨床表現(xiàn)與TMA的病變范圍和累及不同器官造成的功能障礙有關。
該病涉及的臨床科室非常廣泛，患者往往可能在不同的科室，如腎臟內(nèi)科、血液科、神經(jīng)內(nèi)科、婦產(chǎn)科、皮膚科、心血管內(nèi)科和呼吸科等就診，如接診醫(yī)生缺乏對該病的認識，往往會造成嚴重的誤漏診，故提高對該類疾病的認知度已成為目前國內(nèi)外相關專業(yè)領域內(nèi)的關注熱點。
TMA主要包括兩類疾?。貉ㄐ匝“鍦p少性紫癜(thrombotic throm-bocytopenic purpura，TTP)，溶血性尿毒癥綜合征(hemolyticuremlc syndrome，HUS)。這兩種疾病的臨床表現(xiàn)非常相似，但是兩者有一個最大的區(qū)別就是金屬蛋白酶(ADAMTS13)的酶活性有顯著性差異。不管是遺傳性還是獲得性TTP病人的ADAMTS13酶活性一般都小于10％，而HUS的發(fā)病跟ADAMTS13酶活性缺失沒有關系，所以HUS病人的ADAMTS13酶活性正常。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供利用SELDI-TOF-MS檢測血清中ADAMTS13酶活性的方法，其及時有效并精確檢測。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
利用SELDI-TOF-MS檢測血清中ADAMTS13酶活性的方法，該技術將應用于TTP疾病的診斷以及治療監(jiān)控，具體如下：(1)ADAMTS13酶切底物GST-vWF73-6XHis重組蛋白的表達純化；(2)酶切反應；(3)ADAMTS13酶切產(chǎn)物被IMAC芯片富集以后被SELDI-TOF-MS識別檢測，并由分析軟件得到血清樣本中ADAMTS13的酶切活性。
如圖1所示：本技術在細菌BL21中大量表達帶有6個組氨酸(6XHis)標記的vWF73蛋白片段，該片段帶有ADAMTS13特異性剪切位點。將純化以后的蛋白片段跟病人血清孵育一段時間以后，帶有6XHis的ADAMTS13酶切產(chǎn)物將被IMAC蛋白芯片捕捉富集，進而被SELDI-TOF-MS儀器檢測識別。跟正常人血清進行對比以后，可以計算出該病人的ADAMTS13的酶切活性。
采用上述技術方案后，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
1、該檢測方法迅速有效，檢測精確；
2、檢測所有血栓性微血管病(TMA)疑似病例，篩選出所有ADAMTS13酶活性小于10％的病例，這些病人將作為血栓性血小板減少性紫癜(TTP)進行治療。對于酶活性大于10％的病例將進行其他進一步的診斷，并開始完全不一樣的治療；
3、對于所有TTP病例在治療過程中以及出院以后的長期監(jiān)控中，都需定期檢測ADAMTS13的酶活性，從而更好的對病人進行正確的治療，降低治療成本，有效地提高病人的生存率以及生活質(zhì)量。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的步驟示意圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明公開了利用SELDI-TOF-MS檢測血清中ADAMTS13酶活性的方法，包括以下步驟：
包括以下步驟：
(1)ADAMTS13酶切底物GST-vWF73-6XHis重組蛋白的表達純化：
1.1.vWF的73個氨基酸片段D1596～R1668以及C末端6個組氨酸(6XHis)被插入到N端帶有GST蛋白的細菌表達載體pGEX6p-1上；
1.2.挑選陽性克隆，并轉(zhuǎn)染BL21表達細菌；
所述BL21菌種可以高效表達目的重組蛋白，并且該蛋白是可溶性蛋白，易于純化，同時GST標簽容易被剪切。
1.3.大量培養(yǎng)細菌，收集菌體，利用超聲進行細菌裂解，高速離心以后收集上清，并加入等體積PBS緩沖液稀釋；
1.4.通過GST親和柱純化蛋白，利用還原性谷胱甘肽進行洗脫，從而得到純化的重組蛋白GST-vWF73-6XHis作為本技術需要用到的酶切底物；
1.5.取一定量的GST-vWF73-6XHis和切割蛋白酶Prescission Protease孵育，得到本技術在檢測階段需要用到的內(nèi)參照(internal control，IC)；
(2)酶切反應：
需要用到以下試劑和儀器：一組血清標準物，混合正常人血漿(pooled normal plasma,PNP)被系列稀釋成100％，50％，20％，10％，5％以及2.5％，用來稀釋的溶液配方如下：150mM NaCl，0.1％BSA，1XPBS；
高低對照，將PNP稀釋成50％以及5％分別作為高低對照；
反應緩沖液：50mM Tris-Cl pH8.0，1mM BaCl2，50mM NaCl；
芯片激活緩沖液：50mM NiSO4；
芯片結(jié)合緩沖液：1XPBS；
芯片洗脫緩沖液：1XPBS，300mM NaCl，0.1％Tween20；所述重生緩沖液可以有效的洗脫掉結(jié)合在IMAC芯片上的蛋白多肽，并且不影響芯片的結(jié)合能力。
能量吸收物質(zhì)(EAM)：SPA(5mg溶于200ul 50％ACN,200ul 0.5％TFA)。
IMAC芯片重生緩沖液：50mM EDTA，50％ACN,0.5％TFA。
純凈水；
震蕩儀器；
各種型號加液槍。
2.1將酶切底物GST-vWF73-6XHis用反應緩沖液稀釋到0.1ug/ul，取10ul血清標準物，高低對照以及病人血清樣本同25ul稀釋后的底物溶液混合；
2.2在37度水浴鍋孵育1小時以后，加熱到95度終止反應。與此同時配置內(nèi)參照，將內(nèi)參照用PBS稀釋到0.01ug/ul；
(3)ADAMTS13酶切產(chǎn)物被IMAC芯片富集以后被SELDI-TOF-MS識別檢測，并由分析軟件得到血清樣本中ADAMTS13的酶切活性：
3.1IMAC芯片激活，取需要的IMAC芯片，加入100ul激活緩沖液，振蕩孵育5分鐘兩次；
3.2純凈水洗芯片兩次以后加入結(jié)合緩沖液，振蕩孵育5分鐘兩次；
3.3吸去芯片上殘留液體；
3.4混合35ul內(nèi)參照到酶切反應體系，振蕩混勻，取60ul加到芯片上，振蕩孵育30分鐘；
3.5洗脫緩沖液洗脫3次，每次5分鐘，最后用水洗兩次；
3.6取出芯片，小心吸干殘留溶液，每個芯片點加1ulSPA，風干以后再點一次；
3.7送入SELDI儀器進行芯片讀??；
3.8軟件分析目的峰以及內(nèi)參照峰面積，以目的峰除以內(nèi)參照峰面積的值作為X軸，以標準血清濃度為Y軸做一次曲線，根據(jù)病人的峰面積計算其酶切活性。
3.9用過的IMAC芯片用重生緩沖液處理30分鐘，然后用純凈水反復沖洗，晾干以后備用。
所述金屬親和吸附芯片IMAC表面可以螯合正二價金屬離子Ni，可以特異性的捕獲帶有組氨酸His基團的蛋白質(zhì)多肽。
以上，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求的保護范圍為準。