本發(fā)明涉及檢測(cè)探針制備技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是涉及一種基于量子點(diǎn)的CA199免疫層析試紙條的制備方法。

背景技術(shù)：

免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來(lái)國(guó)外興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。

免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl₄)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱(chēng)為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。但膠體金免疫層析技術(shù)存在不能?chē)?yán)格定量這一致命缺陷，所有目前大多數(shù)學(xué)者將層析技術(shù)的目光轉(zhuǎn)移到熒光檢測(cè)上。作為一種新穎的半導(dǎo)體納米材料，量子點(diǎn)具有許多獨(dú)特的納米性質(zhì)，因此在免疫層析領(lǐng)域也獨(dú)樹(shù)一幟。

CA199是胰腺癌和結(jié)、直腸癌的標(biāo)志物。血清CA199陽(yáng)性的臨界值為37kU/L。胰腺癌患者85％-95％為陽(yáng)性。腫瘤切除后CA199濃度會(huì)下降，再上升，則可表示復(fù)發(fā)。結(jié)直腸癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌和胃癌的陽(yáng)性率也很高，若同時(shí)檢測(cè)CEA和AFP可進(jìn)一步提高陽(yáng)性檢測(cè)率。良性疾患時(shí)如胰腺炎和黃疸，CA199濃度也可增高，但往往呈“一過(guò)性”，而且其濃度多低于120kU/L，必須加以鑒別。腫瘤標(biāo)志物可以對(duì)高危人群進(jìn)行篩查，通過(guò)檢測(cè)腫瘤患者治療前后腫瘤標(biāo)志物的濃度變化可以判斷對(duì)腫瘤的治療是否有效。對(duì)生物體內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的一項(xiàng)重要課題，發(fā)展一種新的靈敏度高的檢測(cè)方法也成為研究者們努力的目標(biāo)。目前量子點(diǎn)因具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面,而免疫層析試紙條檢測(cè)則因?yàn)樗暮?jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、可以隨時(shí)隨地等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)領(lǐng)域處于特殊重要的地位。所以本文擬研制CA199量子點(diǎn)免疫熒光試紙條，對(duì)CA199腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，建立CA199腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于腫瘤標(biāo)志物在腫瘤檢測(cè)中的重要地位、量子點(diǎn)這種納米粒子獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及層析技術(shù)簡(jiǎn)便和價(jià)格方面的優(yōu)勢(shì)。我們將結(jié)合量子點(diǎn)和免疫層析試紙條兩種技術(shù)，利用量子點(diǎn)羧基和腫瘤標(biāo)志物相應(yīng)抗體的氨基反應(yīng)，制得量子點(diǎn)熒光探針。探針、腫瘤標(biāo)志物和包埋在試紙條的另一種腫瘤標(biāo)志物抗體通過(guò)抗體抗原之間的作用，形成一種類(lèi)似夾心的結(jié)構(gòu)。對(duì)腫瘤標(biāo)志物CA199進(jìn)行定性定量的檢測(cè)，建立腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的新方法，致力于簡(jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、定性定量、操作簡(jiǎn)便的消化系統(tǒng)腫瘤早期診斷方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于量子點(diǎn)的癌胚抗原免疫層析試紙條的制備方法；其步驟如下：

1)將量子點(diǎn)QDs、EDC和PBS緩沖液加入反應(yīng)器，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199抗體和步驟1)得到的免疫量子點(diǎn)混合，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白封閉QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

所述QDs：EDC摩爾質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:4000～10000。

所述QDs和CA199抗體摩爾質(zhì)量份數(shù)比＝1:10～50。

所述PBS緩沖液用以充當(dāng)反應(yīng)溶劑和保持CA199抗體的活性。

所述偶聯(lián)抗體時(shí)間優(yōu)選2～3h。

所述處理液是蔗糖Sugar、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯Tween-20的混合溶液。

通過(guò)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)的活化作用，量子點(diǎn)的羧基和CA199標(biāo)記抗體Ab₁(分子量150000～200000)的氨基生成牢固的化學(xué)鍵，離心純化后分散在含牛血清白蛋白的PBS緩沖液中，得到QDs-Ab₁的熒光探針。如圖4所示，將CA199包被抗體Ab₂均勻噴在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線T，而將羊抗鼠抗體Ab₃硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線C。將試紙條的四個(gè)部分樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊以及硝酸纖維素膜組裝的一起，最后得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。滴加檢測(cè)樣品到樣品墊上，檢測(cè)樣品會(huì)在吸水墊的層析作用下向前移動(dòng)：如果檢測(cè)樣品有Ag(CA199抗原)存在，探針QDs-Ab₁、CA199和包埋在硝酸纖維素膜上的CA199包被抗體Ab₂通過(guò)抗體抗原之間的作用，在T線上形成一種類(lèi)似夾心的結(jié)構(gòu)QDs-Ab₁-Ag-Ab₂，而在C線上形成QDs-Ab₁-Ab₃的結(jié)構(gòu)，此時(shí)T線和C線同時(shí)亮；如果檢測(cè)樣品沒(méi)有Ag存在，則探針QDs-Ab₁僅僅和包埋在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠抗體，形成QDs-Ab₁-Ab₃的結(jié)構(gòu)，此時(shí)C線亮而T線不亮。

如圖1量子點(diǎn)改性前后電鏡照片顯示，量子點(diǎn)分散均一，適合偶聯(lián)抗體完成免疫實(shí)驗(yàn)；如圖2所示通過(guò)自主研發(fā)的量子點(diǎn)免疫熒光檢測(cè)儀，分別檢測(cè)各個(gè)試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線上量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，選擇二者的比值作為參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CA199組T/C可以達(dá)到1.1，而其余幾組T/C均低于0.2，可以看出量子點(diǎn)免疫熒光試紙條的非特異性吸附很低，可以忽略，這也表明這種試紙條可以用于檢測(cè)。以CA199的濃度作為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的每個(gè)濃度下檢測(cè)到的T/C的值作為為縱坐標(biāo)時(shí)，可以擬合出一條呈多項(xiàng)式的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，R²＝0.9914y＝0.04188+0.0168x-1.721*10^-4x²+6.82*10^-7x³。

本發(fā)明制備的新型基于量子點(diǎn)的免疫層析試紙條優(yōu)勢(shì)在于：

1.采用量子點(diǎn)這種具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面的納米材料作為探針熒光來(lái)源，將納米技術(shù)應(yīng)用到腫瘤檢測(cè)領(lǐng)域。

2.采用免疫層析技術(shù)作為檢測(cè)用的基材，免疫層析技術(shù)因?yàn)樗暮?jiǎn)單迅速、價(jià)格低廉、可以隨時(shí)隨地等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)領(lǐng)域處于特殊重要的地位。

3.采用量子點(diǎn)的羧基和抗體的氨基之間的反應(yīng)形成的牢固的化學(xué)鍵，而非傳統(tǒng)的靜電吸附作用，提高了試紙條抵抗非特異性吸附的能力，量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和CA199抗原濃度之間的線性關(guān)系可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的CA199試紙條的量子點(diǎn)透射電鏡照片，(a)為改性前量子點(diǎn)透射電鏡照片；(b)為改性后量子點(diǎn)透射電鏡照片。

圖2本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的CA199試紙條的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(a)為CA199試紙條特異性實(shí)驗(yàn)圖譜；(b)為CA199試紙條特異性實(shí)驗(yàn)紫外燈照片。

圖3本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的CA199試紙條的靈敏度測(cè)試，(a)為CA199試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)為CA199試紙條標(biāo)準(zhǔn)曲線紫外燈照片。

圖4本發(fā)明制備的基于量子點(diǎn)的CA199試紙條的檢測(cè)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施案例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

實(shí)施案例1：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。在10個(gè)試紙條的樣品墊分別滴加濃度為1.56kU/L、3.125kU/L、6.25kU/L、12.5kU/L、20kU/L、25kU/L、50kU/L、75kU/L、100kU/L和150kU/L的CA199抗原。

以CA199的濃度作為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的每個(gè)濃度下檢測(cè)到的T/C的值作為為縱坐標(biāo)時(shí)，可以擬合出一條呈多項(xiàng)式的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，R²＝0.9914y＝0.04188+0.0168x-1.721*10^-4x²+6.82*10^-7x³。

實(shí)施案例2：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：30)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。在8個(gè)試紙條的樣品墊分別滴加濃度為150kU/L的PSA、CEA、BSA、CA125、CA153、HCG、AFP和CA199抗原。

通過(guò)自主研發(fā)的量子點(diǎn)免疫熒光檢測(cè)儀，分別檢測(cè)各個(gè)試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線上量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，選擇二者的比值作為參數(shù)進(jìn)行比較，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)CA199組T/C可以達(dá)到1.1，而其余幾組T/C均低于0.2，可以看出量子點(diǎn)免疫熒光試紙條的非特異性吸附很低，可以忽略，這也表明這種CA199量子點(diǎn)試紙條可以用于檢測(cè)。

實(shí)施案例3：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：50)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例4：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：6000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例5：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：8000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例6：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例7：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2.5h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。

實(shí)施案例8：

1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：4000的量子點(diǎn)QDs和EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基，離心得到免疫量子點(diǎn)；

2)將CA199標(biāo)記抗體和上述免疫量子點(diǎn)混合(量子點(diǎn)和CA199標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1：10)，加入PBS緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體3h，離心得到QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針，然后用牛血清白蛋白(BSA)封閉量QDs-CA199標(biāo)記抗體熒光探針上未反應(yīng)的羧基，同時(shí)用處理液(0.05g/mL Sugar、0.03g/mL BSA、0.01g/mL PEG和20uL/mL Tween-20的PBS緩沖液)處理樣品墊和結(jié)合墊并烘干，然后用上述熒光探針處理結(jié)合墊并烘干；

3)試紙條制備：將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起，得到CA199量子點(diǎn)免疫層析試紙條。