鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚膠體金免疫層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及食品安全監(jiān)測領(lǐng)域，具體公開了一種檢測鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚(AME)的免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、NC膜、吸水墊和PVC底板，膠體金結(jié)合墊上包被有膠體金?AME單抗復(fù)合物，NC膜上設(shè)置了檢測線和質(zhì)控線，檢測線上固定有濃度為1mg/mL的AME?OVA偶聯(lián)抗原，質(zhì)控線上固定有濃度為1mg/mL的羊抗鼠二抗。本發(fā)明為采用一步間接競爭免疫層析試紙條技術(shù)快速定性或半定量檢測果蔬樣本中鏈格孢毒素AME含量的膠體金試紙條，檢測靈敏度達(dá)到10ng/mL，并且檢測專一性強(qiáng)，操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，適合于現(xiàn)場檢測，可廣泛應(yīng)用于果蔬大批量樣本中AME的分析檢測及快速篩查。
【專利說明】
鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚膠體金免疫層析試紙條
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全領(lǐng)域中涉及免疫膠體金試紙條和真菌毒素殘留檢測的領(lǐng)域。 具體而言，本發(fā)明涉及一種適用于檢測果蔬中鏈格孢毒素一一鏈格孢酚單甲醚(ΑΜΕ)殘留 的膠體金免疫層析試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈格孢霉菌屬于絲狀真菌，是一種普遍存在于水果、蔬菜等食品中的病原體和腐 生菌，它可以在低溫潮濕的環(huán)境下生長繁殖，因此是導(dǎo)致冷藏或長途運(yùn)輸過程中水果、蔬菜 等食品腐爛變質(zhì)的主要微生物。鏈格孢酚單甲醚(ΑΜΕ)是鏈格孢霉菌的主要次生代謝產(chǎn)物 之一，由于它具有誘變性、基因毒性、致癌性，能夠誘導(dǎo)單鏈DNA和雙鏈DNA的斷裂，并且還被 鑒定為拓樸異構(gòu)酶I和Π 強(qiáng)有力的抑制劑，攝取鏈格孢毒素侵染的食品會對人體健康造成 嚴(yán)重危害。因此，ΑΜΕ成為目前國內(nèi)外科學(xué)家研究較多的主要的鏈格孢毒素之一。
[0003] 但到目前為止，國內(nèi)外現(xiàn)行的食品中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)尚不包括鏈格孢毒素， 然而近年來，歐盟已經(jīng)就食品與飼料中鏈格孢毒素對人畜的健康風(fēng)險發(fā)布了科學(xué)意見，并 且在國際貿(mào)易中，商家委托第三方檢測鏈格孢毒素的現(xiàn)象已經(jīng)十分普遍，其檢測主要采用 實(shí)驗(yàn)室中的氣相色譜(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜(IX)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等傳統(tǒng)檢測 方法。然而，這些傳統(tǒng)的檢測方法通常需要大型、昂貴的儀器設(shè)備以及專業(yè)的技術(shù)人員，并 且檢測只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，檢測時間長，費(fèi)時費(fèi)力，不能滿足當(dāng)前食品安全領(lǐng)域所追求的 實(shí)時、快速、便攜式檢測的需求。
[0004] 針對鏈格孢毒素 ΑΜΕ傳統(tǒng)檢測方法的不足，我們設(shè)計(jì)了一種可用于檢測水果、蔬菜 等食品中鏈格孢毒素 ΑΜΕ的膠體金免疫層析試紙方法，該方法具有快速、操作簡單、高特異 性、高靈敏性、檢測成本低、不需要檢測儀器，并且特別適用于現(xiàn)場大量樣本的實(shí)時、快速抽 樣檢測，能夠更好地輔助我國食品企業(yè)及政府職能監(jiān)管部門等開展相關(guān)的檢測工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種采用一步法間接競 爭免疫層析試紙條技術(shù)快速檢測果蔬樣本中鏈格孢毒素 ΑΜΕ殘留的膠體金試紙條，鏈格孢 毒素 ΑΜΕ的檢測靈敏度可達(dá)10ng/mL。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種檢測鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚 (ΑΜΕ)的免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jié)合墊、NC膜、吸水墊和PVC底板，所述NC膜粘 附在PVC底板上，膠體金結(jié)合墊和吸水墊分別粘附在NC膜的兩端，樣品墊粘附在膠體金結(jié)合 墊的另一端;膠體金結(jié)合墊上包被有膠體金-ΑΜΕ單抗復(fù)合物。
[0007] 進(jìn)一步地，所述膠體金-ΑΜΕ單抗復(fù)合物的制備方法如下：用還原劑將氯金酸還原 成膠體金納米顆粒;將膠體金與ΑΜΕ單克隆抗體混合孵育30min，加入10 %的BSA溶液使其終 濃度為1 %，反應(yīng)20min后，加入10 %的PEG20000并使其終濃度為0.2 %，繼續(xù)反應(yīng)20min;離 心純化、濃縮產(chǎn)生膠體金-ΑΜΕ單抗復(fù)合物。所述還原劑優(yōu)選檸檬酸三鈉。
[0008]更進(jìn)一步地，所述ΑΜΕ單克隆抗體的制備方法如下：
[0009] (1 )ΑΜΕ羧基化衍生物半抗原制備:將10mg的ΑΜΕ，14 · 5mg溴丁酸甲酯和30 · 2mg的碳 酸鉀溶于lmL的甲酰胺(DMF)溶液，50 °C磁力攪拌反應(yīng)2h;待反應(yīng)混合物冷卻后，加入2mL水 稀釋，隨后用酒精進(jìn)行萃取得到沉淀中間產(chǎn)物（15mg);將沉淀溶于0.5mL甲醇和0.5mL四氫 呋喃（THF)混合液，隨后加入到含有1.8mg氫氧化鋰的水溶液(0 . lmL)中，室溫條件下反應(yīng) 5h，得到羧基化修飾的ΑΜΕ半抗原(40mg);
[0010] (2)AME-BSA抗原制備:將15.8mg ΑΜΕ半抗原溶于1.5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 中；加入13.7mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，攪拌30min;加入7.6mg N-羥基琥泊酰亞胺(NHS)， 室溫避光磁力攪拌3.5h;離心，除去沉淀物N，f -二環(huán)已基脲;將上清液逐滴加到由磷酸緩 沖液(0.謂，？!17.4)配制的854溶液中，室溫避光攪拌211;用0.1111 〇1/1的1^5溶液透析3(1，每 天換液3次，即得AME-BSA抗原;分裝后，保存于-20°C冰箱中備用；
[0011] (3)抗體篩選與純化：
[0012] (a)動物免疫:利用AME-BSA抗原對8-10周齡的Balb/c小鼠進(jìn)行四次間隔免疫，在 第四次免疫之后進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，以激活體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生ΑΜΕ高親和性單克隆抗 體；（b)細(xì)胞融合及克隆:將產(chǎn)生ΑΜΕ高親和性單克隆抗體的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤 細(xì)胞SP2/0按照8:1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合，并利用間接競爭ELI SA方法測定細(xì)胞上清液，篩選 陽性孔;利用有限稀釋法將得到的陽性細(xì)胞在檢測后的2天內(nèi)進(jìn)行亞克隆，得到能夠穩(wěn)定分 泌ΑΜΕ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；（c)單克隆抗體的腹水制備及純化：利用液體石蠟致敏 Balb/c小鼠，并將步驟（2)得到的雜交瘤細(xì)胞株用1640培養(yǎng)基進(jìn)行清洗，并注射于小鼠腹 腔;將采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化。
[0013]作為優(yōu)選，所述膠體金的納米顆粒大小為13~40nm，更優(yōu)選為18nm。
[0014] 作為優(yōu)選，所述ΑΜΕ單克隆抗體與膠體金的最佳結(jié)合量為7.2yg/mL。
[0015] 作為優(yōu)選，所述ΑΜΕ單克隆抗體與膠體金的最佳結(jié)合pH值為8.0。
[0016] 進(jìn)一步地，所述NC膜上設(shè)置了檢測線和質(zhì)控線;檢測線和質(zhì)控線的間距為5mm。其 中所述NC膜優(yōu)選Mi 11 ipore 135膜。
[0017]其中，所述檢測線上固定有AME-0VA偶聯(lián)抗原，濃度為lmg/mL。所述質(zhì)控線上固定 有羊抗鼠二抗，濃度為lmg/mL。
[0018] 所述AME-0VA偶聯(lián)抗原的偶聯(lián)方法可采用本領(lǐng)域常規(guī)偶聯(lián)方法。
[0019] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供一個較佳的包被原合成方法，具體過程如下：
[0020] (a)稱取前述ΑΜΕ半抗原9.2mg，EDC 7.4mg，加入到2mL DMF溶液中，使之充分溶解， 室溫磁力攪拌反應(yīng)20min，稱為A液；
[0021] (b)稱取卵清白蛋白（0VA)60mg溶解于7mL PBS緩沖液中，稱為B液。
[0022] (c)將A液逐滴滴加到B液中，密封避光4°C條件下，磁力攪拌過夜。
[0023] (d)將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至預(yù)處理后的透析袋中，4°C層析柜中，用0.05mol/L PBS緩 沖液透析3d，其中，前24h每8h換液1次。透析完成后即得0VA-AME包被原。將透析后的產(chǎn)物進(jìn) 行分裝，放置于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0024]需要說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在上述合成方法的基礎(chǔ)上，對各物質(zhì)用量進(jìn)行等 比例增大或縮小，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0025]所述膠體金結(jié)合墊為玻璃纖維素膜，所述膠體金的納米顆粒大小為13~40nm，優(yōu) 選18nm〇
[0026]所述樣品墊優(yōu)選為玻璃纖維素膜。
[0027]所述吸水墊優(yōu)選為濾紙纖維。
[0028]進(jìn)一步地，所述試紙條的寬度為4~5mm。
[0029] 作為優(yōu)選，所述吸水墊壓住NC膜的一端2mm，NC膜的另一端被包被有膠體金-ΑΜΕ抗 體復(fù)合物的膠體金結(jié)合墊壓住2mm，樣品墊壓住膠體金結(jié)合墊2_。
[0030] 進(jìn)一步地，所述膠體金免疫層析試紙條的具體制備步驟為：
[0031] (1)樣品墊預(yù)處理:將樣品墊放置于預(yù)處理緩沖液(0.5g BSA，50yL Tween-20溶于 50mL的磷酸鹽緩沖液）中，并于37°C恒溫水浴箱中孵育30min;隨后用大量的磷酸鹽緩沖液 徹底清洗，37 °C烘箱中干燥2h，最后4 °C干燥條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0032] (2)膠體金墊預(yù)處理:將膠體金結(jié)合墊浸泡在預(yù)處理緩沖液（lg BSA，1.5g蔗糖和 O.Olg疊氮鈉溶于50mL 10mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）中，并放置于37°(：恒溫水浴箱中孵育 30min;隨后用大量的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行徹底清洗，37°C烘箱干燥2h，最后4°C干燥條件下保 存?zhèn)溆茫?br>[0033] (3)將前述ΑΜΕ單克隆抗體與18nm的膠體金納米顆粒孵育形成膠體金-抗體復(fù)合 物，并將其噴涂于預(yù)處理后的膠體金結(jié)合墊，其中每lcm膠體金結(jié)合墊噴涂0.0 lmL膠體金-ΑΜΕ抗體偶聯(lián)復(fù)合物溶液；
[0034] (4)檢測線Τ線制備:將AME-0VA包被原（lmg/mL)按照l.OyL/cm的包被量固定于NC 膜T線預(yù)設(shè)區(qū)域，形成T線；
[0035] (5)質(zhì)控線C線制備：同樣將羊抗鼠二抗（lmg/mL)按照1.0yL/cm的包被量固定于NC 膜C線預(yù)設(shè)區(qū)域，形成C線；
[0036] (6)試紙條組裝:首先，將固定有抗體的NC膜粘貼在PVC底板上;其次，用吸水墊壓 住NC膜的一端2mm左右，NC膜的另一端被包被有膠體金-ΑΜΕ抗體復(fù)合物的膠體金結(jié)合墊壓 住約2mm左右;最后，樣品墊壓住膠體金結(jié)合墊2mm左右。
[0037] 本發(fā)明提供了一種利用上述膠體金試紙條檢測鏈格孢毒素 ΑΜΕ的方法，其檢測是 使用一次性吸管吸取70yL左右的待檢樣本溶液滴加于樣品吸收墊上，觀察檢測線和質(zhì)控線 的顯色結(jié)果。
[0038]本發(fā)明的有益效果在于：
[0039] 本發(fā)明從設(shè)計(jì)ΑΜΕ半抗原結(jié)構(gòu)出發(fā)，制備免疫原和包被原，進(jìn)而篩選高專一性、高 親和性的ΑΜΕ單克隆抗體，并進(jìn)一步將其應(yīng)用于膠體金免疫層析試紙條的制備中。
[0040] 本發(fā)明的檢測果蔬中鏈格孢毒素 ΑΜΕ的膠體金免疫層析試紙條，能夠一步實(shí)現(xiàn)檢 測，結(jié)果準(zhǔn)確，無需洗滌和標(biāo)準(zhǔn)參照，能夠?qū)蝹€或批量樣本實(shí)時快速定性或半定量檢測， 檢測靈敏度高，檢測限達(dá)到10ng/mL。所述試紙條對分子結(jié)構(gòu)類似物鏈格孢酚Α0Η無交叉響 應(yīng)。
[0041] 本發(fā)明的檢測果蔬中鏈格孢毒素 ΑΜΕ膠體金免疫層析試紙條，具有制備簡單，價格 便宜，能夠降低因操作繁冗造成的檢測誤差;另外，試劑保存時間長，現(xiàn)場操作簡單方便，可 在現(xiàn)場大批量樣本中鏈格孢毒素 ΑΜΕ的快速檢測及篩查中發(fā)揮重要作用。能夠更好地輔助 我國食品企業(yè)及政府職能監(jiān)管部門等開展相關(guān)的檢測工作。
【附圖說明】
[0042] 圖1為本發(fā)明所述ΑΜΕ半抗原合成路線圖。
[0043] 圖2為本發(fā)明所述ΑΜΕ半抗原核磁共振氫譜圖。
[0044] 圖3為本發(fā)明所述ΑΜΕ半抗原LC-MS譜圖。
[0045] 圖4為本發(fā)明所述ΑΜΕ膠體金免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
[0046] 圖5為本發(fā)明所述ΑΜΕ膠體金試紙條檢測結(jié)果判定圖。
[0047] 圖6為本發(fā)明所述膠體金免疫層析試紙條對ΑΜΕ的檢測結(jié)果圖。
[0048] 圖7為本發(fā)明所述膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0050] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052] 實(shí)施例1ΑΜΕ單克隆抗體的制備
[0053] 1、ΑΜΕ半抗原合成
[0054] 將10mg的ΑΜΕ，14.5mg溴丁酸甲酯和30.2mg的碳酸鉀溶于lmL的甲酰胺(DMF)溶液， 50°C磁力攪拌反應(yīng)2h;待反應(yīng)混合物冷卻后，加入2mL水稀釋，隨后用酒精進(jìn)行萃取得到沉 淀中間產(chǎn)物（15mg);將沉淀溶于0.5mL甲醇和0.5mL四氫呋喃(THF)混合液，隨后加入到含有 1.8mg氫氧化鋰的水溶液（0. lmL)中，室溫條件下反應(yīng)5h，得到羧基化修飾的ΑΜΕ半抗原 HOmghAME羧基化修飾過程以及核磁共振、LC-MS表征譜圖分別見圖1、2、3。
[0055] 2、免疫原的合成
[0056] 本發(fā)明所述免疫原為ΑΜΕ半抗原與BSA偶聯(lián)得到。具體制備方法:將15.8mg ΑΜΕ半 抗原溶于1.5mL Ν，Ν-二甲基甲酰胺(DMF)中；加入13.7mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，攪拌 30min;加入7.6mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫避光磁力攪拌3.5h;離心，除去沉淀物N， 二環(huán)已基脲;將上清液逐滴加到由磷酸緩沖液(0.1M，pH 7.4)配制的85六溶液中，室溫避 光攪拌2h;透析。用0. lmol/L的roS溶液透析3d，每天換液3次，即得AME-BSA免疫原，分裝后， 保存于_20°C冰箱中備用。
[0057] 3、ΑΜΕ單克隆抗體的制備
[0058] (1)動物免疫
[0059]將合成的AME-BSA免疫原溶于PBS緩沖液(pH 7.0)，然后將免疫原與弗氏佐劑按照 1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。第一次免疫采用弗氏完全佐劑疫苗，對8-10周齡 Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，在頸背部皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射，免疫注射劑量為200yg次/只。15天后進(jìn) 行第二次免疫，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上;30天后進(jìn)行第三次免疫，采用弗氏不 完全佐劑，免疫劑量同上;44天后進(jìn)行第四次免疫，同樣采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同 上;58天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，不加佐劑，直接采用AME-BSA進(jìn)行免疫。免疫Balb/c小鼠的時間見 表1。
[0060] 表1免疫Balb/c小鼠時間表 [0062] (2)細(xì)胞融合和克隆
[0063]將能夠穩(wěn)定產(chǎn)生ΑΜΕ單克隆抗體的Balb/c小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按照 8:1的比例進(jìn)行混合，隨后離心，棄掉上清，將沉淀的細(xì)胞制成糊狀，放置于37°C水浴箱，并 在lmin內(nèi)加入融合劑聚乙二醇(PEG4000)，輕輕攪拌細(xì)胞反應(yīng)2min，并在隨后的4min內(nèi)加入 20mL無血清的PEG營養(yǎng)液，lOOOrpm離心10min后棄掉上清。用20mL-50mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì) 胞，并將其接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100yL，并將其置于37°C恒溫培養(yǎng)箱 中；待細(xì)胞長至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板底部的1/2~1/3時，利用間接競爭ELISA方法測定細(xì)胞上清 液，篩選陽性孔;利用有限稀釋法，將陽性細(xì)胞在檢測后的2d內(nèi)進(jìn)行亞克隆，直到得到能夠 穩(wěn)定分泌ΑΜΕ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;將此雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和傳代，無限量 的產(chǎn)生ΑΜΕ特異性單克隆抗體。
[0064] (3)單克隆抗體腹水制備及純化
[0065] (1)小鼠致敏:利用液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6-8周后，注射免疫原500μ!7只，10 天后即可制備腹水。
[0066] (2)注射細(xì)胞:收集雜交瘤細(xì)胞并用1640培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，取100-150萬細(xì)胞 注射于小鼠腹腔，一周后可見小鼠狀態(tài)不活躍并且小鼠的腹腔腫大。
[0067] (3)腹水采集:注射細(xì)胞一周后，用無菌注射器對腹腔腫大的小鼠采集腹水，每隔 1 d- 2d采集一次，多次反復(fù)采集直到小鼠自然死亡。
[0068] (4)腹水純化:用辛酸-飽和硫酸銨法對采集到的腹水進(jìn)行純化，純化后放入-20°C 冰箱中保存。使用前，需在4°C條件下利用0.01m〇l/L NaCl透析48h，每隔6h-8h換液一次。 [0069] 4、抗體效價的測定
[0070]在酶標(biāo)板的每個孔中分別包被100yL稀釋到一定濃度的包被原，37 °C孵育2h;清洗 液洗板3次后，每孔加入封閉液100yL，37°C孵育2h;清洗液洗板3次后，每孔分別加入用常規(guī) 酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋2000倍的酶標(biāo)二抗；再加入梯度稀釋的抗體100yL，25 °C避光反應(yīng) 30min;洗板4-5次后，加入50yL底物液A液，50yL底物液財(cái)夜；顯色30min后加入50yL終止液終 止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定吸光度，吸收波長為450/630nm。本發(fā)明得到的單克隆抗體的效價可 達(dá)到 1:270000。
[0071 ]實(shí)施例2AME膠體金免疫層析試紙條的制備 [0072] 2.1膠體金的制備
[0073]取99mL超純水和lmL 1 %的三氯金酸水溶液，混勻后，磁力攪拌加熱煮沸，加入 1.8mL 1 %檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱煮沸。當(dāng)溶液的顏色由淺黃色變?yōu)樗{(lán)黑色，最后變?yōu)?酒紅色后，繼續(xù)加熱煮沸l(wèi)Omin。當(dāng)制備好的膠體金溶液的溫度降至室溫時，將制備好的膠 體金溶液定容到lOOmL。最后，將制備好的膠體金溶液放于洗凈的玻璃瓶中，并于4°C環(huán)境條 件下存放備用。
[0074] 2.2膠體金-ΑΜΕ抗體復(fù)合物的制備
[0075] 取制備好的粒徑大小為18nm的膠體金溶液2mL，用0.1Μ K2C03調(diào)節(jié)其pH到8.0;隨后 逐滴加入200yL濃度為O.1μg/μL的ΑΜΕ單克隆抗體(實(shí)施例1所得），室溫條件下磁力攪拌反 應(yīng)2h;逐滴加入10 %的HSA溶液，使其終濃度為0.5 %，室溫條件下磁力攪拌反應(yīng)30min;加入 10 %的PEG20000溶液，并使其終濃度為0.2 %，室溫條件下磁力攪拌30min; 12000rpm離心 30min，棄掉上清，留下膠體金沉淀；向沉淀中加入1 %的HSA溶液重懸膠體金，然后12000rpm 離心，重復(fù)進(jìn)行三次后，用膠體金重懸液（0 . 〇25g PEG20000，2.5g蔗糖，0.5g HSA和50yL Tween-20溶于50mL 10mM pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中）重懸沉淀至原體積的1/10。
[0076] 2.3膠體金-ΑΜΕ抗體復(fù)合物在膠體金結(jié)合墊上的包被
[0077]將膠體金結(jié)合墊浸泡在預(yù)處理緩沖液（lg BSA，1.5g蔗糖和O.Olg疊氮鈉溶于 50mL10mM pH 7.4的磷酸鹽緩沖液）中，并放置于37°(：恒溫水浴箱中孵育3〇1^11;隨后用大量 的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行徹底清洗，37°C烘箱干燥2h，最后4°C干燥條件下保存?zhèn)溆?；取上述?備好的10yL膠體金-ΑΜΕ抗體復(fù)合物鋪于膠體金結(jié)合墊（lcm長X 0.5cm寬），37 °C烘箱lh后，4 °(：干燥條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0078] 2.4樣品墊的制備
[0079] 將樣品墊放置于預(yù)處理緩沖液(0.5g BSA，50yL Tween-20溶于50mL的磷酸鹽緩沖 液）中，并于37°C恒溫水浴箱中孵育30min;隨后用大量的磷酸鹽緩沖液徹底清洗，37°C烘箱 中干燥2h，最后4°C干燥條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0080] 2.5硝酸纖維素膜(NC膜)上檢測線和質(zhì)控線的制備
[00811 檢測線T線：將AME-0VA包被原（lmg/mL)按照1. OyL/cm的包被量固定于NC膜T線預(yù) 設(shè)區(qū)域，形成T線；
[0082]質(zhì)控線C線：同樣將羊抗鼠二抗（lmg/mL)按照l.OyL/cm的包被量固定于NC膜C線預(yù) 設(shè)區(qū)域，形成C線；
[0083]質(zhì)控線與檢測線之間的距離約為5mm，37°C放置2h進(jìn)行干燥固定。為了防止NC膜的 非特異性吸附，我們對干燥后的固定有包被原和二抗的NC膜進(jìn)行封閉：將固定有包被原和 二抗的NC膜浸入到NC膜封閉液（1.2g HSA，0.2g脫脂奶粉和120yL Tween-20溶于40mL Tris-HCl緩沖液）中，并放于37°C恒溫箱中維持30min。隨后用大量的1?緩沖液對其進(jìn)行徹 底清洗后，室溫條件下干燥，最后4°C干燥條件下存放備用。
[0084] 2.6試紙條的組裝
[0085]首先，將固定有抗體的NC膜粘貼在PVC底板上;其次，用吸水墊壓住NC膜的一端2mm 左右，NC膜的另一端被包被有膠體金-ΑΜΕ抗體復(fù)合物的膠體金結(jié)合墊壓住約2mm左右；最 后，樣品墊壓住膠體金結(jié)合墊2_左右。膠體金免疫層析試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖見圖4。
[0086]實(shí)施例3AME膠體金免疫層析試紙條檢測原理
[0087] 1、檢測方法:用一次性吸管吸取待檢樣本，滴加到3-4滴(約70yL)于樣品墊上。
[0088] 2、結(jié)果判斷：
[0089] 膠體金試紙條檢測結(jié)果判定見圖5。
[0090] 陽性:Τ線不顯色，C線顯色，表示樣本中ΑΜΕ的濃度高于檢測限，檢測結(jié)果為陽性；
[0091] 陰性:Τ線和C線都顯色，表示樣本中ΑΜΕ的濃度低于檢測限，檢測結(jié)果為陰性；
[0092] 無效:C線不顯色，表示該試紙條已經(jīng)變質(zhì)失效，檢測結(jié)果無效。
[0093]實(shí)施例4本發(fā)明膠體金免疫層析試紙條對ΑΜΕ的檢測
[0094]以ΑΜΕ標(biāo)準(zhǔn)品為檢測對象，用1?緩沖液依次稀釋ΑΜΕ標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度分別為50ng/ mL、40ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0 · lng/mL、0ng/mL〇分別取70yL上 述ΑΜΕ標(biāo)準(zhǔn)品，分別滴加到制備的膠體金免疫層析試紙條上進(jìn)行檢測，5-10min后觀察顯色 結(jié)果（圖6)。
[0095] 從結(jié)果中可以看出，當(dāng)ΑΜΕ濃度小于10ng/mL時，隨著ΑΜΕ標(biāo)準(zhǔn)品濃度的降低，檢測 線上紅色強(qiáng)度增加；當(dāng)ΑΜΕ濃度大于10ng/mL時，檢測線不顯色。
[0096] 上述結(jié)果表明，該試紙條的檢測限為10ng/mL。
[0097]實(shí)施例5本發(fā)明膠體金試紙條的特異性試驗(yàn)
[0098]由于鏈格孢酚A0H和ΑΜΕ具有相似的結(jié)構(gòu)，因此，本發(fā)明利用A0H進(jìn)一步考察此膠體 金試紙條的檢測特異性。以Α0Η標(biāo)準(zhǔn)品為檢測對象，用ΡΒ緩沖液依次稀釋Α0Η標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃 度分別 400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、Ong/mL。依次取 70yL 上述 Α0Η 標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 分別滴加到制備的膠體金免疫層析試紙條上進(jìn)行檢測，5-10min后觀察顯色結(jié)果(圖7)。
[0099] 結(jié)果顯示為：當(dāng) A0H 的濃度分別為400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、0ng/mL 時，檢測線和質(zhì)控線均顯色，檢測結(jié)果均為陰性，可以得出本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條 具有高的檢測專一性，無交叉反應(yīng)。
[0100] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測鏈格孢毒素鏈格孢酚單甲醚(ΑΜΕ)的免疫層析試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jié)合 墊、NC膜、吸水墊和PVC底板，其特征在于，膠體金結(jié)合墊上包被有膠體金-ΑΜΕ單抗復(fù)合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠體金試紙條，其特征在于，NC膜上設(shè)置了檢測線和質(zhì)控線； 所述檢測線上固定有ΑΜΕ-OVA偶聯(lián)抗原，濃度為lmg/mL。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述膠體金試紙條，其特征在于，所述質(zhì)控線上固定有羊抗鼠二抗， 濃度為lmg/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述膠體金試紙條，其特征在于，所述膠體金-ΑΜΕ單抗復(fù) 合物的制備方法如下：用還原劑將氯金酸還原成膠體金納米顆粒;將膠體金與ΑΜΕ單克隆抗 體混合孵育3〇1^11，加入10%的854溶液使其終濃度為1%，反應(yīng)2〇1^11后，加入10%的 PEG20000并使其終濃度為0.2 %，繼續(xù)反應(yīng)20min;離心純化、濃縮產(chǎn)生膠體金-ΑΜΕ單抗復(fù)合 物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述膠體金試紙條，其特征在于，所述ΑΜΕ單克隆抗體的制備方法如 下： (1) ΑΜΕ羧基化衍生物半抗原制備:將ΑΜΕ，溴丁酸甲酯和碳酸鉀溶于甲酰胺溶液，50°C 磁力攪拌反應(yīng)2h;待反應(yīng)混合物冷卻后，加水稀釋，隨后用酒精進(jìn)行萃取得到沉淀中間產(chǎn) 物;將沉淀溶于甲醇和四氫呋喃混合液，隨后加入到含有氫氧化鋰的水溶液中，室溫條件下 反應(yīng)5h，得到羧基化修飾的ΑΜΕ半抗原； (2) AME-BSA抗原制備:將ΑΜΕ半抗原溶于Ν，Ν-二甲基甲酰胺中；加入二環(huán)己基碳二亞胺 攪拌;加入Ν-羥基琥珀酰亞胺，室溫避光磁力攪拌;離心，除去沉淀物Ν，Υ -二環(huán)已基脲;將 上清液逐滴加到由磷酸緩沖液配制的BSA溶液中，室溫避光攪拌；用0. lmol/L的roS溶液透 析3d，每天換液3次，即得AME-BSA抗原； (3) 抗體篩選與純化。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述ΑΜΕ單克隆抗體與 膠體金的最佳結(jié)合量為7.2yg/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述ΑΜΕ單克隆抗體與 膠體金的最佳結(jié)合pH值為8.0。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金的納米顆 粒大小為13~40nm。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金的納米顆粒大 小為18nm。10. 根據(jù)權(quán)利要求1~3或5~7任一項(xiàng)所述的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述 試紙條的寬度為4~5mm。
【文檔編號】G01N33/531GK106093381SQ201610539564
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】滿燕, 梁剛, 潘立剛, 付海龍
【申請人】北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心