檢測乙腦病毒的方法及量子點標記免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫檢測方法，特別是涉及使用量子點標記免疫層析試紙，以免疫學的方法檢測乙腦病毒的方法。一種量子點標記免疫層析試紙，在塑料板上從下到上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；其中，所述硝酸纖維素膜一端有乙腦病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C；所述量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應，并且量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于進樣點一端。該方法的檢測靈敏度比目前常用的一種檢測方法的檢測靈敏度高1000倍左右。
【專利說明】檢測乙腦病毒的方法及量子點標記免疫層析試紙及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫檢測方法，特別是涉及使用量子點標記免疫層析試紙，以免疫學的方法檢測乙腦病毒的方法。
【背景技術】
[0002]乙腦病毒于1935年首先在日本患者腦組織中分離獲得，因此又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),為球形單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬，直徑20?30nm，內(nèi)有衣殼蛋白與核酸構成的核心，外披以含脂質(zhì)的囊膜，表面有囊膜糖蛋白刺突，即病毒血凝素，囊膜內(nèi)尚有內(nèi)膜蛋白，參與病毒的裝配，乙腦病毒基因組全長llkb，自5'至3'端依次編碼結構蛋白C、M、E以及非結構蛋白NSl—NS5。當人體被帶病毒的蚊蟲叮蚊后，病毒即進入血液循環(huán)中。發(fā)病與否，一方面取決于病毒的毒力與數(shù)量，另一方面取決于機體的反應性及防御機能。如果已經(jīng)接種過乙腦疫苗，體內(nèi)存在一定數(shù)量的抗體，此時人體抗體病能力較強，病毒即被消滅，不發(fā)病或不表現(xiàn)臨床癥狀。當人體抵抗力較弱，而感染病毒量大，毒力強時，病毒經(jīng)血循環(huán)即可突破血腦屏障侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在神經(jīng)細胞內(nèi)復制增殖，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛病變。不同的神經(jīng)細胞對病毒感受不同，以及腦組織在高度炎癥時引起的缺氧、缺血、營養(yǎng)障礙等，造成中樞病變部位不平衡，如腦膜病變較輕，腦實質(zhì)病變較重；間腦、中腦病變重，脊髓病變輕。
[0003]目前，常用的檢測方法為膠體金法，此法雖然檢測快速簡便，容易操作，但是準確率較低，靈敏度也較低。因此尋求一種價格便宜、操作簡便、靈敏度和特異性都較高的檢測方法是迫切需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述技術的不足之處，本發(fā)明提供一種價格便宜、操作簡便、靈敏度和特異性都較高的檢測試紙以及用該試紙檢測乙腦病毒的方法。
[0005]一種量子點標記免疫層析試紙，設有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙；
[0006]其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0007]其中，所述硝酸纖維素膜一端有乙腦病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C ；
[0008]其中，所述量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應，并且量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于進樣點一端。
[0009]優(yōu)選的,所述量子點為CdTe/ZnSe核殼量子點。
[0010]優(yōu)選的，所述塑料板為粘性PVC底板。
[0011]優(yōu)選的，所述乙腦病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。[0012]優(yōu)選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為1.0g/L。
[0013]優(yōu)選的，所述檢測帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5_。
[0014]如上所述的試紙的制備方法，包括如下步驟:
[0015](I)量子點與乙腦病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián):
[0016]取0.0lM的PBS緩沖液100?200uL與5?20uL表面連有羧基的量子點；
[0017]選取偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)_3乙基碳二胺鹽酸鹽；
[0018]加入乙腦病毒IgG單克隆抗體150?200uL ；
[0019]搖床反應I?4小時；
[0020]層析柱過濾，離心純化；
[0021 ] 用1%?5%的牛血清白蛋白封閉；
[0022]4°C 保存；
[0023](2)試紙的制備:
[0024]用0.05?0.15M的PBS緩沖液稀釋乙腦病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L乙腦病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端，形成檢測帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存；
[0025]將量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端，與形成的T帶和C帶相對應，室溫干燥，4°C保存；
[0026]在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0027]用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
[0028]用所述的試紙檢測乙腦病毒，包括如下步驟:將樣品點樣在組裝好的試紙上接近乙腦病毒IgG單克隆抗體的一端，反應5min后，在紫外分析儀中觀察結果。
[0029]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:由于在所制備的試紙中加入了核殼量子點，特別是采用了 CdTe/ZnSe水溶性核殼量子點，將水溶性的量子點與特異性的通過共價偶聯(lián)，然后利用雙抗夾心原理結合量子點的熒光性質(zhì)檢測樣品中是否含有目標物。在紫外燈的照射下，通過觀察免疫層析試紙條上檢測帶和質(zhì)控帶的熒光線，判斷檢測結果。本發(fā)明將免疫反應的高特異性和量子點的熒光特性相結合，利用量子點多波長激發(fā)，高強度熒光發(fā)射，發(fā)射峰窄，峰形對稱，發(fā)光穩(wěn)定性好的熒光特性，建立了快速，特異，簡便，靈敏的免疫層析檢測方法。通過觀察熒光信號達到了定量檢測的目的。該方法的檢測靈敏度比目前常用的一種快速檢測方法-膠體金的檢測靈敏度高約1000倍左右。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為試紙制備的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0032]實施例1:一種量子點標記免疫層析試紙，設有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙，所述玻璃纖維素膜A為沒有點樣的市場上購買的玻璃纖維素膜；
[0033]其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0034]其中，所述硝酸纖維素膜一端有乙腦病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C ；
[0035]其中，所述量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應，并且量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于進樣點一端。
[0036]優(yōu)選的,所述量子點為CdTe/ZnSe核殼量子點。
[0037]優(yōu)選的，所述塑料板為粘性PVC底板。
[0038]優(yōu)選的，所述乙腦病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
[0039]優(yōu)選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為1.0g/L。
[0040]優(yōu)選的，所述檢測帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5mm。
[0041]實施例2:如上所述的試紙的制備方法，如圖1所示，包括如下步驟:
[0042](I)量子點與乙腦病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián):
[0043]取0.0lM的PBS緩沖液100?200uL與5?20uL表面連有羧基的量子點；
[0044]選取偶聯(lián)試劑，偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)_3乙基
碳二胺鹽酸鹽；
[0045]加入乙腦病毒IgG單克隆抗體150?200uL ；
[0046]搖床反應I?4小時；
[0047]層析柱過濾，離心純化；
[0048]用1%?5%的牛血清白蛋白封閉；
[0049]4°C 保存；
[0050](2)試紙的制備:
[0051]用0.05?0.15M的PBS緩沖液稀釋乙腦病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L乙腦病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端，形成檢測帶T和質(zhì)控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存；
[0052]將量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端，與T帶和C帶相對應，室溫干燥，4°C保存；
[0053]在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；
[0054]用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
[0055]其中，步驟(I)中偶聯(lián)效果的檢測方法如下:
[0056]凝膠電泳法:采用0.8瓊脂糖凝膠，電壓為80V，電泳15min后，在紫外分析儀中觀察電泳結果。
[0057]斑點印跡法:將0.3g/L乙腦病毒-BSA液點在硝酸纖維素膜上，晾干后浸泡于含5%BSA 的 0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，10nmol/L, PH=7.4，含 NaC18.5g/L)中，封閉膜上剩余的蛋白結合位點，于37°C孵育lh，封閉后取出，PBS洗滌。制備三個完全相同的乙腦病毒印跡膜，晾干后分別放入量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體,量子點-BSA及量子點溶液，于37°C搖床反應30min，PBS洗滌。紫外分析儀中觀察結果。
[0058]實施例3:用所述的試紙檢測乙腦病毒IgG單克隆抗體，包括如下步驟:將樣品點樣在組裝好的試紙上接近乙腦病毒IgG單克隆抗體的一端，反應5min后，在紫外分析儀中觀察結果。用PBS緩沖液及正常人的血液設為空白對照。
[0059]結果判定:在C帶顯現(xiàn)紅色熒光帶的前提下，目視T帶的熒光帶強度，與空白對照，熒光越弱，代表待測液中含被檢物的濃度越低。
[0060]實施例4:試紙檢測有效性驗證，配制四種濃度的乙腦病毒溶液，濃度分別為0.5，1.0,2.0,5.0ug/L。利用檢測試紙和化學發(fā)光試紙盒對樣本進行檢測，每個濃度檢測6次，測定試紙檢出結果的有效性。如表一所示，結果表明用本發(fā)明制備的試紙檢測出來的呈現(xiàn)陽性，并且溶液濃度越大熒光強度越大。
[0061]表一:各種濃度乙腦病毒的試紙條檢測結果
【權利要求】
1.一種量子點標記免疫層析試紙，其特征在于，設有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙； 其中，所述塑料板上從下到上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙； 其中，所述硝酸纖維素膜一端有乙腦病毒多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質(zhì)控帶C ； 其中，所述量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的一端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應，并且量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于進樣點一端。
2.如權利要求1所述的量子點標記免疫層析試紙，其特征在于，所述量子點為CdTe/ZnSe核殼量子點。
3.如權利要求1所述的量子點標記免疫層析試紙，其特征在于，所述塑料板為粘性PVC底板。
4.如權利要求1所述的量子點標記免疫層析試紙，其特征在于，所述乙腦病毒多克隆抗體的濃度為0.5g/L。
5.如權利要求1所述的量子點標記免疫層析試紙，其特征在于，所述兔抗鼠二抗的濃度為 1.0g/L。
6.如權利要求1所述的量子點標記免疫層析試紙，其特征在于，所述檢測帶T和質(zhì)控帶C間距不少于5mm。
7.如上 任意一項權利要求所述的量子點標記免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)量子點與乙腦病毒IgG單克隆抗體的偶聯(lián): 取0.01M的PBS緩沖液100~200uL與5~20uL表面連有羧基的量子點； 選取偶聯(lián)試劑； 加入乙腦病毒IgG單克隆抗體150~200uL ； 搖床反應I~4小時； 層析柱過濾，離心純化； 用1%~5%的牛血清白蛋白封閉； 4°C保存； (2)試紙的制備: 用0.05~0.15M的PBS緩沖液稀釋乙腦病毒多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L乙腦病毒多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端,形成檢測帶T和質(zhì)控帶C,T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37°C封閉待用，或者干燥后4°C保存； 將量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B —端，與檢測帶T和質(zhì)控帶C相對應，并且量子點標記的乙腦病毒IgG單克隆抗體位于進樣點一端，室溫干燥，4°C保存； 在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點標記乙腦病毒IgG單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙； 用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。
8.如權利要求7所述的量子點標記免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，步驟(1)中的偶聯(lián)試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1- (3-二甲基氨丙基)-3乙基碳二胺鹽酸鹽。
9.用權利要求1-6任意一項所述的試紙檢測乙腦病毒，其特征在于，包括如下步驟:將樣品點樣在組裝好的試紙上接近乙腦病毒IgG單克隆抗體的一端，反應5min后，在紫外分析儀中觀 察結果。
【文檔編號】G01N33/533GK103543268SQ201310484909
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權日:2013年10月16日
【發(fā)明者】文德敏, 申有長, 于曉永 申請人:北京華衛(wèi)驥生物醫(yī)藥有限公司