專利名稱：載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的制備方法。特別是一種載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法。
背景技術(shù)：
免疫治療在針對(duì)傳染性疾病以及腫瘤的預(yù)防和治療中扮演著重要的角色。免疫治療的手段不外乎各種抗原和抗體對(duì)于人體的使用?？贵w，無(wú)論是單克隆還是多克隆，均為蛋白大分子，而抗原則相當(dāng)多樣化，包括細(xì)胞、病毒、蛋白、多肽、以及基因物質(zhì)。
近10多年來(lái)，以可降解、生物兼容的聚合物為基質(zhì)的緩釋微球在小分子化學(xué)藥物及多肽藥物上有著成功的應(yīng)用，這類緩釋微球能夠使多肽抗原在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間(或多脈沖)釋放，產(chǎn)生持續(xù)的抗體響應(yīng)和其它免疫應(yīng)答也多有報(bào)道。通過(guò)納米或微小顆載體將抗原輸送到APC胞漿，從而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，特別是CTL應(yīng)答的工作也吸引了相當(dāng)?shù)难芯客度?。在此基礎(chǔ)上如何將蛋白大分子抗原、抗體包封在這類對(duì)于多肽分子成功的輸送體系中，使之以自然構(gòu)像釋放于循環(huán)系統(tǒng)或體內(nèi)特定的靶位是本發(fā)明所要解決的問(wèn)題。
對(duì)于在可降解高分子劑型中保持蛋白大分子的自然構(gòu)像，不少研究者做過(guò)有益的嘗試。比如，在過(guò)去的幾十年里，文獻(xiàn)中見(jiàn)到過(guò)各種關(guān)于提高蛋白質(zhì)在微囊包過(guò)程中的穩(wěn)定性的方法的報(bào)道。但是，這些方法只能解決一個(gè)或一部分問(wèn)題，而對(duì)于其他問(wèn)題不能兼顧，甚至引發(fā)出新的問(wèn)題。也有些方法只適用于特定的一種蛋白質(zhì)。還有一些報(bào)導(dǎo)也由于研究者自身所關(guān)注的研究領(lǐng)域不同而顯得互相矛盾。舉個(gè)例子說(shuō)明，對(duì)于市場(chǎng)上唯一同類產(chǎn)品--緩釋重組人類成長(zhǎng)激素(rhGH)來(lái)說(shuō)，其穩(wěn)定性是靠和鋅形成絡(luò)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而與鋅形成絡(luò)合物是rhGH在體內(nèi)的自然形態(tài)。當(dāng)這種鋅絡(luò)合制備方法用于另一種蛋白，如促紅細(xì)胞生成素(EPO)，蛋白分子發(fā)生聚集的比率可以高達(dá)40％，引起導(dǎo)致免疫原性的顧慮。為避免蛋白在微囊包過(guò)程中因解除有機(jī)溶劑而變形失活，科學(xué)家預(yù)先將蛋白分子與糖類、無(wú)機(jī)鹽或者其他保護(hù)劑制為固體顆粒狀，從而采取一種固體分散在油相，在進(jìn)一步分散在水相(即油包固體—水包油，S-O-W)的方法微囊包蛋白藥物。這些蛋白穩(wěn)定化輔料常常由于其高溶解度而產(chǎn)生強(qiáng)滲透壓力，引起突釋。比如，當(dāng)溶解度高的硫酸鹽用于提高EPO在微囊包過(guò)程中的素穩(wěn)定性時(shí)，突釋高達(dá)總劑量的55％。
(Cleland，J.L.，Jones J.S.，穩(wěn)定的重組人生長(zhǎng)素和珈嗎干擾素劑型用于生物可降解的微球微囊化.藥學(xué)研究，1996年，第13期，第1464-1475頁(yè))；Cleland和Jones研究了在W-O-W(油包水-水包油)和S-O-W微囊化過(guò)程中各種輔料對(duì)重組人類生長(zhǎng)激素和干擾素的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)甘露醇和海藻糖能夠在防止蛋白在微膠囊過(guò)程中聚集這個(gè)方面起到最好的作用。Sanchez核查了類似的賦形劑對(duì)于另一種蛋白——破傷風(fēng)類酶素的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Cleland和Jones的報(bào)告中被認(rèn)定為對(duì)復(fù)原重組人類生長(zhǎng)激素和干擾素不起有效作用的葡聚糖能在水合條件下的釋放階段對(duì)蛋白質(zhì)起到最好保護(hù)功能。這樣的實(shí)驗(yàn)似乎說(shuō)明了單糖在干燥過(guò)程中對(duì)蛋白能起到更好的保護(hù)作用，而高分子化合物則在釋放階段起到更好效果。不過(guò)，Sanchez的葡聚糖-PLGA復(fù)合微球緩釋劑型的釋放曲線顯示60％的載藥量發(fā)生了突釋。這種突釋放也許是由于直接凍干法制備的蛋白-輔料顆粒尺寸過(guò)大引起的。
在S-O-W過(guò)程中，預(yù)制備的蛋白顆粒的大小十分重要。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine protein Microparticles throughLyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，171376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，HiroshiYamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通過(guò)冷凍蛋白和聚乙二醇水混合溶液制備球型蛋白微球，藥學(xué)研究，2000年，第17期，第1376-1373頁(yè))；Morita發(fā)現(xiàn)當(dāng)固體蛋白質(zhì)顆粒的直徑從5微米增大到20微米時(shí)，不僅初期的釋放速率翻倍，其微囊包封率從80％下降到20％。Cleland討論了在S-O-W過(guò)程前縮小蛋白質(zhì)微粒體積大小的方法。進(jìn)一步粉碎蛋白質(zhì)凍干粉不能得到直徑小于10微米的微粒，而把這些粉末研磨成更小的尺寸的方法卻受阻于研磨熱引起的蛋白質(zhì)性變。雖然噴霧式干燥法能得到預(yù)期大小的蛋白質(zhì)微粒，但是其間的切力和產(chǎn)生的熱量卻又會(huì)由于有了氣體液體界面的介入而引起性變。噴霧干燥法或許可以提供足夠小的蛋白顆粒，但是噴嘴附近的高剪切力和液體與空氣間的界面張力會(huì)使蛋白變性。更不妙的是，噴霧干燥或噴霧式冷凍干燥中須使用表面活性劑，而表面活性劑有促成了蛋白質(zhì)在下一步制劑程序中與溶劑互相作用。Maa等報(bào)道了在噴霧干燥之前預(yù)先將重組人類生長(zhǎng)激素和鋅絡(luò)合的方法防止蛋白質(zhì)成分的聚集。不過(guò)鋅絡(luò)合會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)激素以外的蛋白變性。[Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，andHiroyuki Yoshino.Formation and Isolation of Spherical fine proteinMicroparticles through Lyophilization of protein-poly(ethylene glycol)Aqueous Mixture.Pharm.Res.，171376-1373(2000)]，(Takahiro.Morita，Yuji Horikiri，Hiroshi Yamahara，Takehiko Suzuki，and Hiroyuki Yoshino.通過(guò)冷凍蛋白和聚乙二醇水混合溶液制備球型蛋白微球，藥學(xué)研究，2000年，第17期，第1376-1373頁(yè))；Motita等用PEG沉淀蛋白質(zhì)的方法制備了蛋白超微顆粒。但是，在微囊包過(guò)程中這些微粒還是直接處于有機(jī)溶劑的作用下。由于蛋白質(zhì)對(duì)于高分子化合物基質(zhì)的內(nèi)部表面的吸附作用，未受任何保護(hù)的蛋白質(zhì)和PLGA的直接接觸會(huì)引起不完全的釋放。為了避免親水-疏水分界面，科學(xué)家曾用親水性雙相體系制備高分子化合物微粒。然而，在乳化階段必須靠共價(jià)或離子同步交聯(lián)作用來(lái)固化顆粒，從而使蛋白質(zhì)暴露在活性反應(yīng)物中。
專利申請(qǐng)?zhí)朇N02146543.6，公開(kāi)號(hào)CN1401328，名稱流行性腦脊髓膜炎多糖-蛋白結(jié)合疫苗，該技術(shù)將A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖通過(guò)化學(xué)的方法以共價(jià)鍵結(jié)合到有效的蛋白載體上，制備出含有兩種結(jié)合疫苗的聯(lián)合疫苗制劑，該制劑可供人體免疫接種，用于預(yù)防A群、C群流行性腦脊髓膜炎奈瑟氏球菌的感染。不過(guò)該技術(shù)是針對(duì)的是非蛋白亞單位疫苗，而是用蛋白做載體，導(dǎo)致異種蛋白本身的免役原性的問(wèn)題難于避免，且是通過(guò)化學(xué)修飾，同樣化學(xué)修飾導(dǎo)致疫苗本身的性質(zhì)的變化不得而知。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用多糖玻璃體保護(hù)疫苗和抗體活性的方法。并且通過(guò)多糖玻璃體保護(hù)疫苗制備成納米或微小顆載體將抗原輸送到APC細(xì)胞的胞漿里，從而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，特別是CTL細(xì)胞?；蛑苽涑删忈尩奈⑶騺?lái)維持血液中抗原濃度，從而刺激漿細(xì)胞長(zhǎng)期分泌抗體，誘導(dǎo)體液免疫。局部緩釋抗體主要是針對(duì)固體腫瘤的血管增生迅速，利用局部注射緩釋微球，特異性抑制腫瘤血管增生，使得腫瘤得不到足夠得營(yíng)養(yǎng)而餓死。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的具體步驟如下①將疫苗或抗體加入多糖溶液；②將所制備的疫苗或抗體-多糖6％或6％以上濃度溶液與相同濃度的聚乙二醇溶液在低于室溫高于冰點(diǎn)的溫度下混合，或?qū)⒁呙缁蚩贵w-多糖6％或6％以上濃度溶液與并含有0.2-2％的聚電解質(zhì)的聚乙二醇溶液在冰點(diǎn)以上的溫度混合，或?qū)⒁呙缁蚩贵w-多糖6％以下濃度溶液與相同濃度聚乙二醇溶液在冰點(diǎn)以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相-水相乳濁液冷凍干燥；④將所得到的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機(jī)溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有疫苗或抗體的-多糖玻璃體微粒。
所述的聚乙二醇，其分子量為1,000-30,000；其濃度為0.2％-50％。
所述的聚乙二醇，用于除去PEG連續(xù)相的有機(jī)溶劑是溶解PEG而不溶解多糖的溶劑。
所述的多糖，其分子量為10,000-2,000,000；其濃度為2％-20％。
所述的多糖，為葡聚糖。
所述的聚電解質(zhì)為海藻酸鈉、羧甲酸纖維素鈉帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)。
所述的多糖分散相顆粒，含有緩沖物質(zhì)、鹽類和小分子糖類物質(zhì)。
所述的緩沖物質(zhì)為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
所述的疫苗為亞單位疫苗、活病毒疫苗、減活病毒疫苗、死病毒疫苗、核酸疫苗。
所述的亞單位疫苗為甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、艾滋病疫苗、炭疽疫苗、腫瘤疫苗、SARS疫苗、流感疫苗、血吸蟲(chóng)病疫苗，還可以添加免疫佐劑如細(xì)胞因子、TAP、無(wú)機(jī)鹽、CpG等起到增強(qiáng)免疫的效果。
所述的活病毒疫苗為麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、鼠疫疫苗、卡介苗。
所述的亞單位疫苗的重量百分比0.001％-50％，所述的抗體為重量百分比0.001％-50％，所述的多糖重量百分比50-90％。
所述的抗體，為抗血管增生的抗體，病毒抗體、腫瘤抗體和細(xì)胞因子抗體或者抗細(xì)胞因子的抗體。載在多糖玻璃體中的疫苗和抗體，可以長(zhǎng)期保持活性和治療效果。
緩釋微球劑型，載有抗體、疫苗和病毒的多糖微粒分散在可降解高分子微球的基質(zhì)中；高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在水相中形成復(fù)乳即油包固體—水包油(S/O/W)的方法，或者通過(guò)將多糖玻璃體微粒分散在油溶的可降解高分子溶液中形成初乳(S/O)，再分散在另一油相中形成復(fù)乳即油包固體—水油包油(S/O/O)的方法，或者通過(guò)噴霧干燥法制備微球，或者添加到各種凝膠中。
所述的高分子為聚醚酰亞胺、聚酯、聚酸酐、聚氨基酯、或骨架非肽鍵的聚氨基酸，包括聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸及其組合；還包括硅像膠、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、卡波母、透明質(zhì)酸、明膠、膠原蛋白、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚氰基丙烯酸酯、聚膦腈、聚磷酸酯、纖維蛋白原、纖維蛋白及它們的組合、凝膠包括聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乙二醇-聚羥基乙酸、聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸溫敏型水凝膠、糖敏型凝膠和酸敏型凝膠、它們的組合。
所述的溫敏型凝膠，其特征為載于疫苗或抗體多糖玻璃體微粒或多糖溶液中的蛋白被選擇性地分配在多糖相中處于熱力學(xué)上更穩(wěn)定的狀態(tài)。此外，溫敏型凝膠系在升溫相變(從液體到膠狀)過(guò)程中發(fā)生脫水收縮引起的突釋，而分配在多糖相中的蛋白則可以在相當(dāng)程度上避免這類突釋。所述的多糖玻璃體或者未經(jīng)乳化凍干的含有疫苗或抗體的多糖溶液可以被直接加入低溫下處于液體狀態(tài)的溫敏型凝膠或它們的組合。
所述的緩釋疫苗的微球劑型為皮下注射，起到長(zhǎng)期緩釋有治療和預(yù)防作用的疫苗。
所述的緩釋抗體的微球劑型為固體腫瘤周圍注射，起到長(zhǎng)期緩釋，和提高固體腫瘤周圍的抗體濃度，起到治療腫瘤的效果。
所述的APC細(xì)胞吞噬的疫苗的微球劑型為0.5μm-10μm的微球，皮下注射或肌肉注射能被APC細(xì)胞吞噬，引起細(xì)胞免疫或體液免疫，或兩者兼有的免疫應(yīng)答。
所述的疫苗多糖玻璃體可以進(jìn)一步分散在功能性的高分子溶液，制備成緩釋微球、免疫細(xì)胞能吞噬的微粒(0.5μm-10μm)、或涂在各種支架的表面涂層、制備成骨架、栓塞劑等。
本發(fā)明方法制備的疫苗和抗體多糖玻璃體微粒表面光滑圓整，顆粒規(guī)整無(wú)粘連，粒徑可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)控從0.1μm到10μm。進(jìn)一步把疫苗和抗體多糖玻璃體分散在控釋高分子材料中，根據(jù)臨床的需要制備不同的劑型，如緩釋微球、APC細(xì)胞吞噬的0.5μm-10μm的小微球等，可以長(zhǎng)期保持活性和治療效果。制備的載有疫苗或抗體多糖玻璃體微粒可以直接用于吸入劑型，保護(hù)結(jié)構(gòu)脆弱的疫苗或抗體；載有疫苗或抗體多糖玻璃體微粒的熱敏液-膠體可以直接用于臨床皮下注射給藥或植入皮下起緩控釋疫苗或抗體的效果。載有疫苗或抗體的玻璃體可以通過(guò)S/O/W或S/O/O復(fù)乳方法制備成緩釋微球，粒徑在500nm-10,000nm的微球可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫或細(xì)胞和體液免疫，在20μm-120μm微球可以緩控釋疫苗起到以體液免疫為主免疫治療和預(yù)防。多糖相不僅可以在制劑過(guò)程中保護(hù)疫苗或抗體，還可以用來(lái)改善其釋放動(dòng)力學(xué)。對(duì)于給定疫苗或抗體擔(dān)載量的微球來(lái)說(shuō)，多糖的用量是一個(gè)方便的因素可用來(lái)調(diào)控疫苗或抗體的釋放速率和釋放模式。增加多糖的用量，則釋放速率提高，不完全釋放的問(wèn)題得到改善，但突釋的可能性增大。減小多糖的用量則起到相反的效果。仔細(xì)地選擇多糖的用量同時(shí)結(jié)合可降解高分子的分子量及親水-疏水性能可以達(dá)到既控制突釋，又避免不完全釋放的目的。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例的基本條件疫苗或抗體—多糖玻璃體的制備和微球的制備或載蛋白質(zhì)-多糖玻璃體的敏感型凝膠制備?？梢愿鶕?jù)具體疫苗和抗體的性質(zhì)，可以選定三種制備疫苗或抗體--多糖玻璃體的方法一種、兩種或三種。
實(shí)施例11.低溫水相-水相乳液法制備疫苗或抗體-多糖玻璃體①制備疫苗疫苗或抗體、PEG和多糖水溶液用超純水分別制備10％的PEG和10％的多糖水溶液，精確稱取10克PEG和10克多糖水分別放在100毫升的燒杯里加水90克，然后把兩個(gè)燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待PEG和10％的多糖全部溶解取下來(lái)冷卻待用。用電子天平精確稱取800毫克疫苗或抗體溶于7.2毫升水中待用。
備疫苗或抗體、PEG和多糖水相-水相乳液在0℃-4℃條件下，將1.的多糖、疫苗或抗體和PEG水溶液按照體積比分別為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成水相-水相乳液；或稱取按照多糖和PEG的質(zhì)量比為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混勻再加水溶解，再按照多糖和疫苗或抗體的重量比為1∶1加入，使之形成形成水相-水相乳液。
凍疫苗或抗體、PEG和多糖水相-水相乳液將制備疫苗或抗體、PEG和多糖形成水相-水相乳液，一些沒(méi)有分配到多糖相的蛋白質(zhì)，在降溫過(guò)程中再分配到多糖分散相中，冷凍過(guò)夜。
④完成步驟③的樣品在真空冷凍干燥機(jī)凍干；⑤完成步驟④的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續(xù)相獲得載疫苗多糖玻璃體。
得到的疫苗或抗體多糖玻璃體的粒徑大都在300nm-5μm，得到這些玻璃體光滑圓整，粒徑分布均勻?？梢允挂呙缁蚩贵w的結(jié)構(gòu)得到好的保護(hù)，避免了在劑型制備過(guò)程失活。
2.載有疫苗或抗體多糖玻璃體的微球制備稱取1g和5g的PVA和NaCl，加超純水94g，同時(shí)加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續(xù)緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無(wú)氣泡后，停止攪拌，放于4℃冰箱待用。該溶液濃度為1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精確稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩渦振蕩，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現(xiàn)用現(xiàn)配，以防二氯甲烷揮發(fā)。
稱取疫苗或抗體多糖玻璃體微粒10mg，均勻分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟玫鞍踪|(zhì)-多糖玻璃體微粒均勻分散于PLGA溶液中，將所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化鈉的溶液中，以2200rpm的轉(zhuǎn)速勻漿成復(fù)乳(S/O/W)，于一分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到4℃的10％氯化鈉水溶液中，攪拌3～4小時(shí)后收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預(yù)凍過(guò)夜，再真空冷凍干燥，制得粒徑為50μm-120μm的微球。制備微球還可以用S/O/O復(fù)乳法和噴霧干燥法制備的微球，可以用于皮下注射，起到緩釋和治療作用。
實(shí)施例21.低溫誘導(dǎo)相分離法制備疫苗或抗體-多糖玻璃體①制備疫苗或抗體、PEG和多糖水溶液用超純水分別制備5％的PEG和5％的多糖水溶液，精確稱取5克PEG和5克多糖水分別放在100毫升的燒杯里加水95克，然后把兩個(gè)燒杯放在加熱的磁力攪拌30min，待PEG和5％的多糖全部溶解取下來(lái)冷卻待用。用電子天平精確稱取400毫克蛋白溶于3.6毫升水中待用。
②疫苗或抗體、PEG和多糖均相共水溶液將①的多糖、疫苗或抗體和PEG水溶液按照體積比分別為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶旋渦30s-60s充分混勻，形成均相溶液；或稱取按照多糖和PEG的質(zhì)量比為1∶1∶5、1∶1∶10、1∶1∶20、1∶1∶40在西林瓶先混勻再加水，使之溶解形成均相溶液。
③冷凍疫苗或抗體、PEG和多糖均相共水溶液將制備疫苗或抗體、PEG和多糖均相共水溶液在降溫過(guò)程中發(fā)生相分離，使多糖成為分散相，PEG成為連續(xù)相。但是避免速凍條件下冷凍過(guò)夜。
④完成步驟③的樣品在真空冷凍干燥機(jī)凍干；⑤完成步驟④的樣品用二氯甲烷洗滌三次除去PEG連續(xù)相獲得載疫苗或抗體多糖玻璃體。
2.載有疫苗或抗體多糖玻璃體的微球制備稱取1g和5g的PVA和NaCl，加超純水94g，同時(shí)加熱、攪拌，至PVA完全溶脹，停止加熱，繼續(xù)緩慢攪拌，待溶液呈澄清透明且無(wú)氣泡后，停止攪拌，放于4℃冰箱待用。該溶液濃度為1％PVA(W/W)和5％NaCl(W/W)。
精確稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)200mg，加二氯甲烷980mg，漩渦振蕩，使PLGA溶于二氯甲烷中，得PLGA的二氯甲烷溶液，濃度為20％(W/W)，現(xiàn)用現(xiàn)配，以防二氯甲烷揮發(fā)。
稱取疫苗或抗體多糖玻璃體微粒10mg，均勻分散于0.5g的PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟玫鞍踪|(zhì)-多糖玻璃體微粒均勻分散于PLGA溶液中，將所得初乳再次分散于含1％PVA和10％氯化鈉的溶液中，以2200rpm的轉(zhuǎn)速勻漿成復(fù)乳(S/O/W)，于一分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到4℃的10％氯化鈉水溶液中，攪拌3～4小時(shí)后收集陳化的蛋白微球，用超純水洗滌三次，在冰相預(yù)凍過(guò)夜，再真空冷凍干燥，制得粒徑為50μm-120μm的微球。
制備微球還可以用S/O/O復(fù)乳法和噴霧干燥法制備的微球，可以用于皮下注射，起到緩釋和治療作用。
實(shí)施例3穩(wěn)定的水相-水相乳液法得到的載疫苗或抗體多糖分散相玻璃體的粒徑大多數(shù)都在300nm-5μm，得到這些玻璃體光滑圓整，粒徑分布均勻?？梢允挂呙缁蚩贵w的結(jié)構(gòu)得到好的保護(hù)，避免了在劑型制備過(guò)程失活。
稱取聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)100mg，使之在漩渦混合器的作用下充分溶解在1ml的乙腈中，然后稱取10mg的疫苗或抗體多糖玻璃體加入乙腈的溶液中，并在磁力攪拌下充分分散。在一定量的外油相溶液中加入200ml棉子油的表面活性劑span80，在電力攪拌器以200rpm攪拌下充分混勻。把分散有疫苗或抗體多糖玻璃體的乙腈溶液逐滴加入攪拌中的外油相溶液中，攪拌固化5個(gè)小時(shí)，抽濾，得到的微球顆粒用50ml石油醚洗三次，減壓干燥10個(gè)小時(shí)，收集微球，在現(xiàn)微鏡觀察微球的粒徑為50μm～120μm的微球，符合皮下注射的要求。
可以緩控釋疫苗，起到維持體內(nèi)的疫苗濃度，從而激發(fā)體液免疫，維持體內(nèi)抗體濃度達(dá)到治療和預(yù)防目的。
實(shí)施例4載有疫苗或抗體多糖玻璃體溫敏型凝膠制備稱取疫苗或抗體多糖玻璃體微粒10mg，在4℃均勻分散于0.5g的PLGA-PEG-PLGA的水溶液中，PLGA-PEG-PLGA的濃度為20％(W/W)，磁力攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速1800rpm，充分?jǐn)嚢枋沟靡呙缁蚩贵w多糖玻璃體微粒均勻分散于PLGA-PEG-PLGA溶液中，將所得均勻分散于PLGA-PEG-PLGA的混懸液加熱到37℃固化，做體外釋放。而臨床應(yīng)用則現(xiàn)配現(xiàn)用。
實(shí)施例5模型疫苗BSA緩控釋劑的制備和體外釋放行為可以在保持疫苗成分或抗體的自然構(gòu)像的溫和條件下將其制成多糖玻璃體微粒。這種微粒具有對(duì)有機(jī)溶劑、溫度等條件的耐受性，可以進(jìn)一步將得到保護(hù)的疫苗顆粒制成諸如高分子緩釋微球等各種維持體內(nèi)的疫苗濃度、提高抗體的滴度，或者通過(guò)交叉抗原提呈刺激細(xì)胞免疫。
一、溶液配置1.BSA溶液制備稱取肌紅蛋白20.7mg，加入超純水2ml中渦選溶解，得到肌紅蛋白溶液濃度約10mg/ml。
2.葡聚糖溶液制備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
3.PEG溶液制備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
二、模型疫苗BSA-葡聚糖微粒制備1.BSA葡聚糖微粒制備分別稱取肌紅蛋白溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.50g、0.16g和1.00g(注兩份)，在0℃的條件下，采用勻漿器E檔(22，000rpm)勻漿3×5s。上述乳液在-20℃放過(guò)夜，再冷凍干燥24h。干燥物置于二氯甲烷5ml中，12,000rpm離心5min，傾去上層清夜，重復(fù)二氯甲烷洗滌過(guò)程三次。將最后得到的肌紅蛋白葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白對(duì)照葡聚糖微粒制備分別稱取葡聚糖溶液和PEG溶液0.15g和1.00g，按上面制備方法同法制備。
(注將上述兩種微粒在PCS測(cè)定其粒徑分布和大小及掃描電鏡觀察形態(tài)呈球形，微粒大多數(shù)粒徑在1～2um左右。)三、模型疫苗BSA緩釋制劑的制備1∶5膜控釋制劑制備稱取PLGA(75/253A)15.1mg、二氯甲烷1ml，渦選溶解。加入700ul搖勻的BSA葡聚糖微?；鞈乙?，渦旋使分散均勻。通過(guò)S/O/W方法制備成PLGA微球。我們可以清楚的看到球中有分散均勻的BSA葡聚糖微粒。
四、釋放液測(cè)定釋放液樣品采用micro-BCA試劑盒測(cè)定。以BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。BSA-葡聚糖PLGA微球釋放液吸收值減除同法制備的空白微球釋放液吸收值進(jìn)行校正，帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算釋放液BSA濃度。依次繪制不同葡聚糖/PLGA比例涂層中BSA的釋放曲線。我們可以看出其釋放行為良好，無(wú)明顯突釋行為。
實(shí)施例6模型抗體β-半糖乳糖苷酶蛋白緩控釋劑的制備和體外釋放行為目前國(guó)際上已經(jīng)有500種抗體用于診斷和治療，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)20個(gè)抗體上市，其中8種用于腫瘤治療的靶向抗體。如針對(duì)血管表皮生長(zhǎng)因子[VEGF]的抗體Avastin，使晚期結(jié)腸癌患者生存期平均延長(zhǎng)五個(gè)月，但是治療費(fèi)用及其昂貴。由于抗體的分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，通常四級(jí)結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)惡劣的環(huán)境下，構(gòu)像更易發(fā)生變化，比化學(xué)藥更容易失活。因此需要一個(gè)的輸送完整結(jié)構(gòu)抗體的體系，直接送到腫瘤細(xì)胞的血管周圍，抑制腫瘤細(xì)胞的血管生長(zhǎng)?；蚱渌鼩[瘤細(xì)胞的抗體，起到局部緩釋抗體，提高局部血藥濃度，減少藥的用量和毒性，節(jié)約治療成本。故我們選擇了一個(gè)與抗體分子量大小相當(dāng)，也具有空間四級(jí)結(jié)構(gòu)的模型蛋白β-半糖乳糖苷酶蛋白來(lái)說(shuō)明此體系對(duì)抗體的保護(hù)作用。
一、模型β-半糖乳糖苷酶蛋白-葡聚糖微粒制備按照實(shí)例5制備二、模型疫苗BSA-葡聚糖微粒制備和微球制備按照事例5制備三、釋放試驗(yàn)按照實(shí)例5進(jìn)行釋放液測(cè)定；四、本發(fā)明方法對(duì)β-半糖乳糖苷酶蛋白的保護(hù)作用為了驗(yàn)證本發(fā)明對(duì)生物活性物質(zhì)有較好的保護(hù)作用，設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)有機(jī)溶液存在條件下葡聚糖微粒對(duì)結(jié)構(gòu)易變的蛋白大分子的保護(hù)作用，把β-半糖乳糖苷酶(一個(gè)具有四級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量為500KD的酶)載進(jìn)葡聚糖微粒進(jìn)行了測(cè)試。先將蛋白質(zhì)以0.67mg/mlβ-半糖乳糖苷酶溶于葡聚糖溶液，按照1∶20的比例，然后將其加入實(shí)例1所描述的PEG溶液中乳化。冷凍干燥后，用二氯甲烷反復(fù)洗滌幾遍除去PEG。接下來(lái)的步驟中，將所回收的載著蛋白質(zhì)的葡聚糖微粒在緩沖液中重新溶解，加入o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)，測(cè)試對(duì)底物-ONPG的水解催化活性。酶的催化作用在經(jīng)歷了從實(shí)例5到實(shí)例6所描述的操作過(guò)程(包括乳化、冷凍干燥以及二氯甲烷洗滌)后，只是下降了不到10％。此10％的活性下降還包括了由于在乳化過(guò)程中被分配在PEG相的部分蛋白以及冷凍干燥過(guò)程中損失的蛋白活性。也就是說(shuō)，在與微囊包過(guò)程所用的有機(jī)溶液—二氯甲烷的接觸中，葡聚糖微粒有效地保存了蛋白酶的活性。
實(shí)施例7被抗原提呈細(xì)胞(APC)吞噬的微粒疫苗制備當(dāng)微粒的粒徑在500nm-10,000nm容易被APC細(xì)胞吞噬，一些抗原可以通過(guò)不同的途徑從內(nèi)吞體逃逸到細(xì)胞漿。這一途徑又稱吞噬體-胞質(zhì)溶膠(phagosome-cytosol)方式；或MHCI類分子經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體直接進(jìn)入內(nèi)體與外源性抗原結(jié)合，并將其提呈到細(xì)胞表面；在溶酶體中外源性抗原肽經(jīng)胞吐作用被釋放到胞外，與細(xì)胞表面的MHCI類分子結(jié)合?；谏鲜龇墙?jīng)典外源性抗原MHCI類分子提呈原理，設(shè)計(jì)了保證疫苗的完整結(jié)構(gòu)，并且應(yīng)用可以幫助疫苗從內(nèi)吞體逃逸出來(lái)的高分子材料(PEI)，來(lái)保證有更多的疫苗從內(nèi)吞體到細(xì)胞漿，從而有更多的機(jī)會(huì)刺激細(xì)胞免疫。
一、溶液配置1.戊肝疫苗溶液制備稱取戊肝疫苗4.05mg，加入超純水1ml中渦選溶解，得到戊肝疫苗溶液濃度約4.05mg mg/ml。
2.葡聚糖溶液制備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
3.PEG溶液制備稱取葡聚糖1.0g，加超純水至10.00g，加熱攪拌至溶解。得到葡聚糖溶液重量百分比約10％。
二、模型疫苗戊肝疫苗-葡聚糖納米粒制備1.戊肝疫苗葡聚糖微粒制備分別稱取戊肝疫苗溶液、葡聚糖溶液和PEG溶液0.05g、0.02g和8.00g(注兩份)，另一分添加小分子1mg的PEI在多糖相在0℃的條件下，采用勻漿器E檔(22,000rpm)勻漿3×5s。上述乳液在-20℃放過(guò)夜，再冷凍干燥24h。干燥物置于二氯甲烷5ml中，12,000rpm離心5min，傾去上層清夜，重復(fù)二氯甲烷洗滌過(guò)程三次。將最后得到的戊肝疫苗葡聚糖微粒保存在1ml二氯甲烷中。
2.空白對(duì)照葡聚糖微粒制備分別一份稱取葡聚糖溶液和PEG溶液0.02g和8.00g，和另一份0.02g葡聚糖溶液和加4mg的PEI及PEG溶液和8.00g，按上面制備方法同法制備。
三、模型疫苗戊肝疫苗-葡聚糖納米粒的PLGA微球的制備1.稱取疫苗戊肝疫苗-葡聚糖納米粒10mg，50mg PLGA50/50(平均分子量6,500)溶于1ml乙腈，含0.5％(w/v)司盤(pán)的棉子油8ml，將兩液體混合，10krpm勻漿30-60秒，顯微鏡下觀察小于10um(S/O/O法制備)，將此乳液滴入100ml棉子油萃取揮發(fā)4小時(shí)，最后加入100ml石油醚洗滌15min。最后過(guò)濾揮干。
四、戊肝疫苗-葡聚糖納米粒的PLGA微球的制備過(guò)程的免疫活性的回收分別稱取2mg的戊肝疫苗-葡聚糖納米粒，和2mg PLGA微球，其中微球用4ml二氯甲烷洗滌4次，用1200轉(zhuǎn)/min離心，去上清液。最后揮干重新溶解在磷酸緩沖液，再用廈門(mén)大學(xué)提供的試劑合(ELISIA)測(cè)定。其回收的免疫活性，我們發(fā)現(xiàn)除掉物理?yè)p失，活性幾乎全部保持?？梢灶A(yù)防戊肝。
權(quán)利要求
1.一種載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征在于，具體步驟如下①將疫苗或抗體加入多糖溶液；②將所制備的疫苗或抗體-多糖6％或6％以上濃度溶液與相同濃度的聚乙二醇溶液在低于室溫高于冰點(diǎn)的溫度下混合，或?qū)⒁呙缁蚩贵w-多糖6％或6％以上濃度溶液與并含有0.2-2％的聚電解質(zhì)的聚乙二醇溶液在冰點(diǎn)以上的溫度混合，或?qū)⒁呙缁蚩贵w-多糖6％以下濃度溶液與相同濃度聚乙二醇溶液在冰點(diǎn)以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相-水相乳濁液冷凍干燥；④將所得到的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機(jī)溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有疫苗或抗體的-多糖玻璃體微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的聚乙二醇，其分子量為1,000-30,000；其濃度為0.2％-50％之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的多糖，其分子量為10,000-2,000,000；其濃度為2％-20％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的聚電解質(zhì)為海藻酸鈉、羧甲酸纖維素鈉帶負(fù)電荷的聚電解質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是所述的多糖分散相顆粒，含有緩沖物質(zhì)、鹽類和小分子糖類物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的緩沖物質(zhì)為Mg(OH)2、ZnCO3、及MgCO3，鹽類為Zn(AC)2、ZnCl2、CaSO4、MgSO4，小分子糖類為海藻糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的疫苗為亞單位疫苗、活病毒疫苗、減活病毒疫苗、死病毒疫苗、核酸疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的亞單位疫苗為甲肝疫苗、乙肝疫苗、丙肝疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、艾滋病疫苗、炭疽疫苗、腫瘤疫苗、SARS疫苗、流感疫苗、血吸蟲(chóng)病疫苗；所述的活病毒疫苗為麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、鼠疫疫苗、卡介苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或者7或者8所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的抗體為重量百分比0.001％-50％，所述的多糖重量百分比50-90％，所述的亞單位疫苗的重量百分比0.001％-50％。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法，其特征是，所述的抗體，為抗血管增生的抗體，病毒抗體、腫瘤抗體和細(xì)胞因子抗體或者抗細(xì)胞因子的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的載有活性疫苗或抗體的多糖玻璃體微粒的制備方法。具體步驟如下①將疫苗或抗體加入多糖溶液；②將所制備的疫苗或抗體－多糖在冰點(diǎn)以上的溫度混合；③將所形成的混合溶液或水相－水相乳濁液冷凍干燥；④將所得到的凍干粉加入可溶聚乙二醇的有機(jī)溶液洗滌，除去聚乙二醇，得到載有疫苗或抗體的－多糖玻璃體微粒。本發(fā)明制備的疫苗和抗體多糖玻璃體微粒表面光滑圓整，顆粒規(guī)整無(wú)粘連，粒徑可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)控從0.1μm到10μm。可以長(zhǎng)期保持活性和治療效果。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1887275SQ200610029129
公開(kāi)日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2006年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月20日
發(fā)明者金拓, 袁偉恩, 吳飛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)