專利名稱：含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的三維微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微全分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于分離、富集樣品的含固相萃取整體柱介 質(zhì)的三維微流控芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
微全分析系統(tǒng)(P-TAS，又稱芯片實(shí)驗(yàn)室，Lab-on-a-chip)由于其具備可實(shí)現(xiàn)分析過程
連續(xù)化、集成化、自動(dòng)化和微縮化的特點(diǎn)，從而能夠極大地減少試劑的消耗量、縮短分析 時(shí)間、提高分析檢測效率，因此，在疾病診斷、生化分析、臨床檢測等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng) 用。由于實(shí)測樣品中基底和成分復(fù)雜，基體效應(yīng)與各干擾組分的共存，致使樣品預(yù)處理過 程多是在微流控芯片外通過離心、過濾、分離等方式實(shí)現(xiàn)，不利于微全分析系統(tǒng)的集成化， 尤其是樣品的純化富集等預(yù)處理技術(shù)更是制約微全分析系統(tǒng)發(fā)展的瓶頸之一。
針對(duì)現(xiàn)階段微流控芯片系統(tǒng)中對(duì)生物樣品的預(yù)處理，目前常用的預(yù)處理技術(shù)有基于堰、 柵欄、柱、篩等微器件構(gòu)成的過濾式預(yù)處理芯片，基于吸脫附原理的開口管、填充柱和整 體柱式固相萃取型預(yù)處理芯片，以及基于電場、磁場或聲場作用原理的預(yù)處理芯片等。與 微流控芯片上的諸多預(yù)處理方式相比，整體柱是一種新型的在管內(nèi)以原位(in situ)聚合 的方式形成的用于分離分析或作為反應(yīng)器的多孔固相萃取介質(zhì)，具有雙連續(xù)結(jié)構(gòu)和雙孔分 布兩大特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的多孔微球型柱材料相比，穿透孔的存在使得整體柱材料具有較好的 滲透性和較小的傳質(zhì)阻力。整體柱式固相萃取型預(yù)處理芯片可以通過選取不同性質(zhì)的吸附 劑使分析選擇性大為提高，但存在洗脫過程致使預(yù)處辟效率降低及集成難等問題。

發(fā)明內(nèi)容
'
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、簡便、成本低廉、能用于樣品前處理的微流控固相 萃取預(yù)處理三維芯片及其制備方法。
本發(fā)明提出的微流控芯片由基片和蓋片直接封接而成，有效地實(shí)現(xiàn)樣品前處理整體柱 與微流控芯片微管道網(wǎng)絡(luò)一體化集成。蓋片上設(shè)有樣品入口、試劑入口和廢液出口及固相 萃取預(yù)處理微通道，采用PDMS整體澆鑄成型法制備而成，固相萃取預(yù)處理微通道內(nèi)采用 紫外光照原位聚合法制備有聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱，樣品入口設(shè)置在固相萃取預(yù)處理 微通道的入口端;所述基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS
為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)由樣品進(jìn)入通道、試劑進(jìn)入通
道共同連接混合反應(yīng)通道構(gòu)成；蓋片與基片粘接封裝后，蓋片上的固相萃取預(yù)處理微通道 末端與基片上的樣品進(jìn)入通道連通，蓋片上的試劑入口連通基片上的試劑進(jìn)入通道，蓋片 上的廢液出口位于基片上的混合反應(yīng)通道末端。
本芯片在蓋片上的微通道內(nèi)采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯類整體 柱；聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱是采用適宜比例的甲基丙烯酸丁酯(BMA)為功能單體， 二甲基乙二醇酯(EDMA)為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈(A舊N)為引發(fā)劑，1， 4丁二醇、異丙 醇、甲醇、乙醇、水等作為致孔劑，在365nm的紫外光照的條件下原位聚合聚甲基丙烯 酸丁酯類整體柱；采用掩膜可有效控制整體柱的在微管道中的位置和長度；通過微通道表 面Y-MAPS雙官能團(tuán)試劑改性處理，能有效地解決整體柱材料與管壁的鍵合問題。所述微 流控預(yù)處理芯片，預(yù)處理材料可以用于復(fù)雜生化樣品中待測目標(biāo)組分純化富集。
本芯片的制備方法如下
(1) 蓋片采用PDMS整體澆鑄成型法制作，首先第一次澆鑄PDMS，于90'C烘箱內(nèi)固 化半小時(shí)左右得到厚度為0. 3 0. 5mm厚的PDMS膜層，再將直徑為75 200y m細(xì)金屬Pt 絲固定于上述芯片上，第二次澆鑄PDMS，在60'C烘箱內(nèi)固化4小時(shí)得到含預(yù)處理微通道 的PDMS蓋片，并在與基片各微通道口對(duì)應(yīng)位置開有供微流體出入的導(dǎo)液孔。
(2) 以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧垸PDMS為芯片底片 材料，釆用濕法或干法刻蝕有流體混合和反應(yīng)微通道。
(3) 采用Y-MAPS雙官能團(tuán)試劑處理蓋片微通道。處理過程如下先用0.1MNaOH 溶液沖洗微管道；再用重蒸水沖洗至中性，并用50倍柱體積的丙酮沖洗干凈；然后將30 XV/V雙官能團(tuán)試劑y-MAPS丙酮溶液注入微通道中，密封，放置過夜；最后用去離子水 沖洗，干燥備用；
在(3)中的芯片微通道中，采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理 整體柱，以隔離紫外光的掩膜控制整體柱的長度和位置，按75%制孔劑和25%預(yù)聚物比 例將反應(yīng)物泵入已經(jīng)活化處理的微通道內(nèi)，所述預(yù)聚物采用甲基丙烯酸丁酯BMA為功能 單體，二甲基乙二醇酯EDMA為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈A舊N引發(fā)劑，三者按mBMA: mEDMA :mA舊N為59.5X: 39.5%: 1%的質(zhì)量比例混合，致孔劑采用甲醇和乙醇，兩者按V甲醉 :V ^為1 : 1的體積比例混合，在365nm處以18w功率的紫外光在2 10cm照射距離 下照射2 6小時(shí)，得到聚甲基丙烯酸丁酯整體柱；
(4) 將(4)制備的蓋片與基片直接粘接封裝，得到微流控固相萃取預(yù)處理芯片。 本發(fā)明提出的微流控固相萃取芯片可用于血樣中藥物(如吩噻嗪類藥物等)的凈化
和富集。
本發(fā)明提出的微流控固相萃取預(yù)處理三維芯片具有具有制作簡便、成本低廉、高負(fù)載 量、低進(jìn)樣量、快速分析、體積小巧的優(yōu)點(diǎn)，適合復(fù)雜生化樣品樣品的預(yù)處理。其中采用 整體澆鑄法制備微通道具有制備簡單、成本低廉、操作方便等特點(diǎn)，且能克服芯片封裝中 封接難、漏液等問題。采用掩膜有效控制整體微柱位置和尺寸，將整體柱分離介質(zhì)合理地
鍵合到微流控芯片管道中。芯片蓋片中的預(yù)處理管道采用了雙官能團(tuán)試劑Y -MAPS對(duì)芯片 微通道進(jìn)行改性修飾，以改善芯片表面性質(zhì)，使固相萃取介質(zhì)材料與芯片微通道內(nèi)壁得到
有效鍵合。
本發(fā)明采用的甲基丙烯酸丁酯有機(jī)聚合物整體柱屬于疏水作用分離介質(zhì)材料，主要依 據(jù)物質(zhì)的極性來分離純化待測樣品，而通過改變洗脫溶劑的濃度及運(yùn)行條件可以有效地獲 得良好的洗脫效率。與其他預(yù)處理整體柱相比，原位制備的甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱 克服了比表面積小、負(fù)載容量低、熱誘導(dǎo)聚合過程繁瑣、通透性不好，預(yù)處理效率不高等 不足，具有具有通透性好、柱壓低、機(jī)械強(qiáng)度高、分析速度快、直接進(jìn)行實(shí)際樣品分離、 富集的特點(diǎn)。
本發(fā)明提出的整體澆鑄法制備含固相萃取預(yù)處理單元的PDMS-玻璃微流控芯片，能明 顯改善預(yù)處理單元在微流控芯片上集成難的問題，且便于芯片上實(shí)現(xiàn)光度法、化學(xué)發(fā)光和 熒光定量檢測，是一種制備簡單、低成本、含樣品預(yù)處理單元的微流控固相萃取三維芯片， 其為微全分析系統(tǒng)集成化的發(fā)展提供更多的可能性。


圖1含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖2含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的微流控芯片結(jié)構(gòu)蓋片示意圖3含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的微流控芯片結(jié)構(gòu)基片示意圖中1.樣品入口； 2.試劑入口； 3.廢液出口；4.樣品進(jìn)入通道；5試劑進(jìn)入通道； 6混合反應(yīng)通道7蓋片；8基片；A-B.整體柱。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提出的微流控固相萃取預(yù)處理芯片，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，整個(gè)芯片由基片8和 蓋片7直接封接而成，結(jié)構(gòu)尺寸為長(30mm) X寬(20mm) X高(3mm)。圖2中蓋 片厚度為1 2mm，蓋片中固相萃取預(yù)處理微通道(A-B整體柱)長為(5 10mm)，管 道直徑75 200um;圖3中基片厚度為1mm，基片中混合和反應(yīng)微通道尺寸為長(10 30mm) X寬(50 200um) X深(50 200 um)。
蓋片的結(jié)構(gòu)參見圖2，蓋片上設(shè)有樣品入口 1、試劑入口 2和廢液出口 3及畫相萃取 預(yù)處理微通道，采用PDMS整體澆鑄成型法制備而成，固相萃取預(yù)處理微通道內(nèi)采用紫外 光照原位聚合法制備有聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱A-B，樣品入口 1設(shè)置在固相萃取預(yù)處 理微通道的入口端。
基片的結(jié)構(gòu)參見圖3，基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷 PDMS為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)由樣品進(jìn)入通道4、試 劑進(jìn)入通道5共同連接混合反應(yīng)通道6構(gòu)成。
蓋片與基片粘接封裝后參見圖1，蓋片上的固相萃取預(yù)處理微通道末端與基片上的樣 品進(jìn)入通道4連通，蓋片上的試劑入口2連通基片上的試劑進(jìn)入通道5，蓋片上的廢液出 口 3位于基片上的混合反應(yīng)通道6末端。
按照?qǐng)D1所設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)制作目標(biāo)芯片。用95%的乙醇清洗玻璃片，以其作為基片， 按照PDMS涸化劑質(zhì)量比為10: 1配制PDMS澆鑄液，攪勻，靜置，除去氣泡，將其流 涎到玻璃片上，放置到9(TC烘箱中固化半小時(shí)，得到PDMS片，再將制做的模具固定在 上述PDMS片上，二次澆鑄成型得到樣品預(yù)處理芯片的蓋片。在對(duì)應(yīng)的出口和入口出制作 樣品進(jìn)出口通孔，得到目標(biāo)蓋片。采用玻璃片制作芯片底片，按照?qǐng)D1中芯片結(jié)構(gòu)示意圖 制備刻蝕掩膜，按照標(biāo)準(zhǔn)玻璃濕法刻蝕工藝刻蝕所需深度的通道結(jié)構(gòu)；用乙醇清洗載玻片， 采用濕法刻蝕得到含混合和反應(yīng)微管道的基片。用0.1MNaOH溶液沖洗毛細(xì)管以活化管 道內(nèi)壁；用重蒸水沖洗至中性，并用50倍柱體積的丙酮沖洗干凈；然后將雙官能團(tuán)試劑 Y-MAPS丙酮(30%V/V)溶液注入微通道中，密封，放置過夜；最后用去離子水沖洗， 干燥備用。微管道分別采用NaOH、重蒸水、丙酮和雙官能團(tuán)試劑Y-MAPS丙醇(30% V/V)活化處理，干燥備用；按75%制孔劑(mBMA : m瞧m顯為59.5%: 39.5%: 1%) 和25X預(yù)聚物(V鴨V乙醉為1 : 1)比例將聚合液泵入已經(jīng)活化處理的微通道內(nèi)，在365nm 處以18w(功率)紫外光照下聚合4小時(shí)得到有機(jī)聚合物整體柱，用乙醇洗滌，于6(TC溫度 下干燥，待用。制得聚合整體柱的孔容可達(dá)到0.31cm2，g'1， BET比表面積達(dá)到365.72 m2 g—1， SEM測試圖譜顯示聚合物由3 5pm的微球和一定尺寸的微孔組成。 本芯片的使用實(shí)例
本微流控固相萃取三維芯片可通過光電倍增管(PMT)、電荷耦合器件(CCD)和光纖等方式 采集數(shù)據(jù)，與多種檢測方法集成。以血液中的鹽酸丙米嗪藥物為實(shí)測樣品，利用強(qiáng)酸性的 高錳酸鉀-乙二醛-丙米嗪化學(xué)發(fā)光體系進(jìn)行測定。樣品用注射微泵從預(yù)處理整體柱通道的 入口端進(jìn)樣，以2. OmLAiin的流速經(jīng)預(yù)處理整體柱，被測物質(zhì)被固相萃取材料吸附，用一 定體積的洗脫液沖洗整體柱，最后用樣品洗脫液將被測物質(zhì)從固相載體上洗脫下來；同時(shí)， 在反應(yīng)試劑入口端以同樣的速度泵入反應(yīng)試劑(發(fā)光試劑)，在反應(yīng)通道的末端檢測信號(hào)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱對(duì)血液中鹽酸丙米嗪有明顯的分離富集效果， 其富集倍數(shù)達(dá)到10倍以上，本設(shè)計(jì)芯片分析系統(tǒng)的檢出限可達(dá)到5X 10—8g/mL。
權(quán)利要求
1、一種含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的三維微流控芯片，所述芯片由基片和蓋片封接而成，其特征在于所述蓋片設(shè)有樣品入口、試劑入口和廢液出口及固相萃取預(yù)處理微通道，采用PDMS整體澆鑄成型法制備而成，固相萃取預(yù)處理微通道內(nèi)采用紫外光照原位聚合法制備有聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱，樣品入口設(shè)置在固相萃取預(yù)處理微通道的入口端；所述基片以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)由樣品進(jìn)入通道、試劑進(jìn)入通道共同連接混合反應(yīng)通道構(gòu)成；蓋片與基片粘接封裝后，蓋片上的固相萃取預(yù)處理微通道末端與基片上的樣品進(jìn)入通道連通，蓋片上的試劑入口連通基片上的試劑進(jìn)入通道，蓋片上的廢液出口位于基片上的混合和反應(yīng)通道末端。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維微流控芯片，其特征在于所述蓋片中固相萃取預(yù)處 理微通道長為5 10mm，微通道直徑75 200um，基片中混合和反應(yīng)微通道尺寸為長 10 30mmX寬50 200u mX深50 200 um。
3、 權(quán)利要求1所述的三維微流控芯片的制備方法，包括以下步驟(1) 蓋片采用TOMS整體澆鑄成型法制作，首先第一次澆鑄PDMS，于90。C烘箱內(nèi)固 化半小時(shí)左右得到厚度為0. 3 0. 5mm厚的PDMS膜層，再將直徑為75 200y m細(xì)金屬Pt 絲固定于上述PDMS膜層上，第二次澆鑄PDMS，在6(TC烘箱內(nèi)固化4小時(shí)得到含預(yù)處 理微通道的PDMS蓋片，并在與下述基片各微通道口對(duì)應(yīng)位置開有供微流體出入的樣品入 口、試劑入口和廢液出口；(2) 以玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧垸PDMS為芯片基片材 料，采用濕法或干法刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)，微通道網(wǎng)絡(luò)尺寸為長10 30mmX寬5。 200u mX深50 200 um;(3) 采用y-MAPS雙官能團(tuán)試劑處理蓋片中微通道，處理過程如下先用0.1MNaOH 溶液沖洗微通道；再用重蒸水沖洗至中性，并用50倍柱體積的丙酮沖洗干凈；然后將30 XV/V雙官能團(tuán)試劑y-MAPS丙酮溶液注入微通道中，密封，放置過夜；最后用去離子水 沖洗，干燥備用；(4)在蓋片的微通道中，采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體 柱，以隔離紫外光的掩膜控制整體柱的長度和位置，按75%制孔劑和25%預(yù)聚物比例將 反應(yīng)物泵入已經(jīng)活化處理的微通道內(nèi)，所述預(yù)聚物采用甲基丙烯酸丁酯BMA為功能單體， 二甲基乙二醇酯EDMA為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈A舊N引發(fā)劑，三者按mBMA : mEDMA : mA舊N為59.5。/^: 39.5%: 1%的質(zhì)量比例混合，致孔劑采用甲醇和乙醇，兩者按V甲醉V 乙醇為1 : 1的體積比例混合，在365nm處以18w功率的紫外光在2 10cm照射距離下照 射2 6小時(shí)，得到聚甲基丙烯酸丁酯整體柱；(5)將步驟(4)制備的蓋片與步驟(1)制備的基片直接粘接封裝，使蓋片上的固 相萃取預(yù)處理微通道末端與基片上的進(jìn)樣通道連通，蓋片上的試劑入口連通基片上的試劑 進(jìn)入通道，蓋片上的廢液出口位于基片上的混合反應(yīng)通道末端，即得到微流控固相萃取預(yù) 處理芯片。
全文摘要
本發(fā)明屬于微全分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種含原位聚合甲基丙烯酸丁酯預(yù)處理整體柱的三維微流控芯片，在微流控芯片上的微通道內(nèi)采用紫外光照原位聚合法制備聚甲基丙烯酸丁酯類整體柱，微流控芯片的基片可采用玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚二甲基硅氧烷PDMS等為基材，刻蝕有流體混合和反應(yīng)的微通道網(wǎng)絡(luò)；蓋片采用整體澆鑄PDMS法制作集固相萃取預(yù)處理單元的微通道，在與基片各微通道口對(duì)應(yīng)位置開有供微流體出入的導(dǎo)液孔，并與基片直接鍵合，實(shí)現(xiàn)樣品預(yù)處理整體柱與微流控芯片微管道網(wǎng)絡(luò)一體化集成。本芯片具有制作簡便、成本低廉、進(jìn)樣量少、分離分析快速的優(yōu)點(diǎn)，適合復(fù)雜生化樣品樣品的預(yù)處理和分析測試。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101358912SQ20081007030
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月17日
發(fā)明者張文品, 溢 徐, 徐平洲, 強(qiáng) 曹, 萍 曾 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)