專利名稱：一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用大環(huán)抗生素-替考拉寧鍵合的手性固定相來手性分離側(cè)鏈帶保護(hù)的氨基酸，利用手性固定相在高效液相色譜系統(tǒng)上手性分離一些側(cè)鏈帶保護(hù)的氨基酸對映異構(gòu)體，DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯,DL-谷氨酸-5-叔丁基酯,O-叔丁基-DL-絲氨酸，O-叔丁基-DL-酪氨酸。
背景技術(shù)：
由于藥物治療多肽副作用低，藥效高，針對性強(qiáng)，不會(huì)蓄積于體內(nèi)而引起中毒的優(yōu)點(diǎn)，越來越多的多肽藥物應(yīng)用到了癌癥，肝炎，糖尿病臨床治療中，目前國內(nèi)的藥物治療多肽發(fā)展迅速，目前藥物多肽合成方法中無論是液相合成，固相合成，片段連接都會(huì)使用到氨基酸衍生物作為原料，而氨基酸衍生物的光學(xué)純度對合成多肽的質(zhì)量尤為重要，因此需要 一種快速，簡單，經(jīng)濟(jì)，應(yīng)用范圍廣的手性分離方法。目前報(bào)道的氨基酸手性分離的方法集中在非衍生化的天然氨基酸和主鏈N端有Boc，Z,或者Fmoc保護(hù)的這些方面，主要是利用冠醚，纖維素，大環(huán)抗生素類手性固定相來進(jìn)行手性分離(高效液相色譜手性冠醚固定相拆分丙氨酸，正纈氨酸和犬尿氨酸對映體2009 ;在替考拉寧鍵合的手性固定相上比較N-叔丁氧羰基氨基酸及其未保護(hù)氨基酸類似物的對映體選擇性分離1999 Comparison of enantioselective separationof N-tert-butyIoxycarbonyl amino acids and their non—blocked analoguesteicoplanin-based chiral stationary phase 1999)),側(cè)鏈的羧基或者輕基帶保護(hù)基團(tuán)而主鏈上未保護(hù)的氨基酸手性分離的報(bào)道卻很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用高效液相色譜法，同時(shí)使用鍵合替考拉寧的手性固定相進(jìn)行多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸衍生物的手性分離方法，考察流動(dòng)相中有機(jī)相的比例對手性分離的影響，最終確定合適的分離條件。主要解決解決高效液相色譜法手性分離體系中使用的流動(dòng)相體系比較繁瑣和手性色譜柱不穩(wěn)定的技術(shù)問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，采用替考拉寧手性固定相的高效液相色譜方法。包括以下步驟
I、用色譜級的甲醇和蒸餾水超聲脫氣，作為流動(dòng)相。2、甲醇和水作為流動(dòng)相，以甲醇比水體積比40:60的比例平衡手性色譜柱，平衡30分鐘，待紫外檢測器的基線維持在零點(diǎn)左右時(shí)可以準(zhǔn)備分析樣品。手性色譜柱ChiroBioticT (替考拉寧鍵合填料)，5 μ m, 4. 6 X 250mm (I. D) 流動(dòng)相 A:水；B:甲醇
時(shí)間(min)AB
O.0160%40%
50.O60%40%流速0. 4ml/min ;波長:220nm。3、將DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯、DL-谷氨酸_5_叔丁基酯、O-叔丁基-DL-絲氨酸、O-叔丁基-DL-酪氨酸等外消旋樣品配制成一定濃度，用甲醇-水混合溶液溶解，過濾作為待進(jìn)樣品。4、將配制好的樣品注射進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)，在手性固定相分離后，通過色譜工作站記錄分離色譜圖，并查看相關(guān)的分離參數(shù)，手性分離度這個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)要好，一般分離度要大于I. 5。按照本發(fā)明，所述的手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，手性色譜柱使用的是以硅膠為基質(zhì)的，在硅膠基質(zhì)上化學(xué)鍵合大環(huán)抗生素-替考拉寧的手性色譜柱(Tei-CSP)。本發(fā)明所用的樣品溶解條件為體積比甲醇水=40:60 ；
本發(fā)明所述的樣品在4. 6mm內(nèi)徑的分析柱上的樣品濃度分別為
DL-谷氨酸-5-叔丁基酯10mg/ml ；0-叔丁基-DL -絲氨酸10mg/ml ；
DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯10mg/ml ；0-叔丁基-DL-酪氨酸O. 6mg/ml。本發(fā)明的有益效果
解決了側(cè)鏈羧基被叔丁酯化或者側(cè)鏈羥基被叔丁基化這類氨基酸的手性分離問題，本發(fā)明所述的手性分離方法，使用的流動(dòng)相比較簡單，分離速度快，并且分離的條件對于溫度也沒有特殊要求，分離過程中不需要柱溫箱，不增加儀器成本，同時(shí)替考拉寧鍵合的手性柱穩(wěn)定性比較好，在手性分離上千次樣品后仍能得到很好的手性分離效果，同時(shí)這種手性柱也能用于其它類的氨基酸，肽，和手性藥物的手性分離，使用范圍廣，有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I為DL-谷氨酸-5-叔丁基酯消旋體在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=20:80的分離圖。圖2為DL-谷氨酸-5-叔丁基酯消旋體在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=30:70的分離圖。圖3為DL-谷氨酸-5-叔丁基酯消旋體在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=40:60的分離圖。圖4為O-叔丁基-DL-絲氨酸消旋體在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=20:80的分離圖。圖5為O-叔丁基-DL-絲氨酸消旋體在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=30:70的分離圖。圖6為O-叔丁基-DL-絲氨酸消旋體在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=40:60的分離圖。圖7為DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=20:80的分離圖。圖8為DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=30:70的分離圖。 圖9為DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=40:60的分離圖。
圖10為O-叔丁基-DL-酪氨酸在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=20:80的分離圖。圖11為O-叔丁基-DL-酪氨酸在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=30:70的分離圖。圖12為O-叔丁基-DL-酪氨酸在替考拉寧鍵合手性固相上，流動(dòng)相為甲醇水體積比=40:60的分離圖。
具體實(shí)施例方式4種外消旋體溶解，過濾
I)分別稱取3mg的O-叔丁基-L-酪氨酸和3mg的O-叔丁基-D-酪氨酸溶于IOml 的容量瓶中(即配制O. 6mg/ml濃度的O-叔丁基-DL-酪氨酸)，用甲醇與水溶液體積比例40:60溶液溶解，超聲處理，待樣品完全澄清，加溶液至刻度線，用0.45 μ m有機(jī)相濾頭過濾，取濾液待用。2)其它3種氨基酸衍生物溶解，分別稱取5mg的L型和5mg的D型樣品置于Iml的樣品管中(即配制濃度為10mg/ml的DL-谷氨酸-5-叔丁基酯，O-叔丁基-DL -絲氨酸，DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯)，用甲醇與水溶液體積比例40:60溶液溶解，超聲處理，待樣品完全澄清,用O. 45 μ m有機(jī)相濾頭過濾，取濾液待用。色譜條件沃特斯515高壓輸液泵，沃特斯2489紫外檢測器，HS-2000色譜工作站。流動(dòng)相A :色譜級甲醇，B:蒸餾水,0.01分鐘到50分鐘A: B體積比=40:60 ;流速O. 4ml/min ;波長220nm ;手性色譜柱ChiroBiotic T, 5 μ m, 4. 6 X 250mm (I. D)，進(jìn)樣量5μ1。分尚圖見圖I 圖12。色譜條件的選擇 I. I手性色譜柱的選擇
替考拉寧是從垣霉素游動(dòng)放線菌(Actinoplanes teichomyceticus)菌發(fā)酵液中得到的一種新型的糖肽類大環(huán)抗生素，作為手性固定相具有廣泛的手性識別能力，可拆分的化合物包括未衍生的氨基酸，衍生氨基酸，肽，酸性化合物，含有芳香基團(tuán)的環(huán)狀化合物，堿性藥物等，同時(shí)替考拉寧鍵合的手性柱可以使用多種模式的流動(dòng)相，包括反相，極性離子相，正相3種分離模式，這種鍵合的手性固定相還有一個(gè)明顯的特點(diǎn)是比較穩(wěn)定，受流動(dòng)相影響比較小，柱載樣量也比較大，與其它類的手性柱相比具有體明顯的優(yōu)點(diǎn)，因此我們選用替考拉寧鍵合的手性柱(Astec公司的Chirobiotic T柱)作為分離手性化合物的色譜柱。I. 2流動(dòng)相的選擇
選用了不添加任何酸，堿，緩沖鹽的純甲醇和水就達(dá)到分離的目的，流動(dòng)相很容易配制，甲醇也更有利于樣品的手性分離，因此我們選用純甲醇和水作為手性分離的流動(dòng)相。不同比例流動(dòng)相對分離度的影響在實(shí)驗(yàn)過程中考察了甲醇和水的比例變化對手性分離度的影響，分別選擇甲醇水體積比=20:80、甲醇水體積比=30:70、甲醇水體積比=40:60三種比例的流動(dòng)相，從分離度來看甲醇水體積比=40:60效果最好，因此我們選擇該比例的流動(dòng)相作為分離條件。分離結(jié)果見下表
權(quán)利要求
1.一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，其特征是包括以下步驟 a、將4種外消旋體溶解在甲醇和水溶液中，超聲處理后過濾，取濾液待用； b、手性色譜柱平衡好后分別吸取濾液進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)，通過色譜工作站采集手性分離色譜圖，通過查看分離參數(shù)獲取氨基酸分離效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，其特征是所述的4種外消旋體為DL-天門冬氨酸-4-叔丁基酯、DL-谷氨酸-5-叔丁基酯、O-叔丁基-DL-絲氨酸、O-叔丁基-DL-酪氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，其特征是溶解樣品甲醇水溶液配置時(shí)體積比甲醇水=40:60。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，其特征是分析的色譜條件為 手性色譜柱替考拉寧鍵合填料；流動(dòng)相A為水；B為甲醇；時(shí)間AB O.01 分60%40% 50 分60%40% 流速0. 4ml/min,波長:220nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，其特征是所述的替考拉寧鍵合填料是硅膠為基質(zhì)的通過化學(xué)鍵合替考拉寧的手性填料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，以解決高效液相色譜法手性分離體系中使用的流動(dòng)相體系比較繁瑣和手性色譜柱不穩(wěn)定的技術(shù)問題。技術(shù)方案一種手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)氨基酸的方法，其特征是包括以下步驟a、4種外消旋體溶解在甲醇和水溶液中，超聲處理后過濾，取濾液待用；b、手性色譜柱平衡好后分別吸取濾液進(jìn)入高效液相色譜系統(tǒng)，通過色譜工作站采集手性分離色譜圖，通過查看分離參數(shù)獲取氨基酸分離效果。本發(fā)明所述的方法，使用的流動(dòng)相是在高效液相色譜中很常用的試劑，除了高效液相色譜儀不再需要?jiǎng)e的儀器，既節(jié)省成本又能夠簡單、快速地手性分離多種側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸。
文檔編號B01J20/29GK102824900SQ20121030849
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者巢慶, 徐紅巖 申請人:吉爾生化(上海)有限公司, 上海吉爾多肽有限公司, 無錫亞肽生物科技有限公司