一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用。該Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列組成；或者含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而形成的，具有抗凝血活性，能明顯延長血漿活化部分凝血活酶時間(APTT)，而對凝血酶原時間(PT)基本無影響。該Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑具有抗血栓作用，而且出血風(fēng)險小，可作為制備治療和預(yù)防血栓性疾病的藥物應(yīng)用。
【專利說明】
一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種具有抗凝作用的Kunitz型 絲氨酸蛋白酶抑制劑及其在制備治療和預(yù)防血栓性疾病中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 血栓栓塞性疾病是危害人類健康的常見病，也是當(dāng)前社會致死致殘的主要原因之 一。傳統(tǒng)的抗栓藥物如肝素、低分子量肝素、華法林、血小板聚集抑制劑（如阿司匹林）、水 蛭素等在臨床應(yīng)用中均具有較好的抗栓藥效，但他們卻還存在一定的不足，其中，最常見、 最嚴(yán)重的并發(fā)癥（副作用）是引起出血，因此，發(fā)明出血副作用小的抗栓新藥具有非常重要 的價值。
[0003] 近年來的研究表明：凝血過程中的凝血因子^ (coagulation factor XI，F(xiàn)XI) 及血衆(zhòng)激肽釋放酶（plasma kallikrein，PK)是出血風(fēng)險小的抗栓防治新革巴點[Bane CE Jr，Gailani D. Factor XI as a target for antithrombotic therapy. Drug Discov Today. 2014,19(9) :1454-8 ;Renne T，Gruber A. Plasma kallikrein ：novel functions for an old protease. Thromb Haemost. 2012,107(6) :1012-3]，F(xiàn)XIa或FXI、血楽激肽釋放 酶（PK)抑制劑可能開發(fā)為出血副作用小的抗栓藥物。
[0004] Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類含有Kunitz結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白類抑制 劑，是目前研究最多的絲氨酸蛋白酶抑制劑之一[羅玉嬌，李濱，舒衡平，蔣立平.Kunitz型 胰蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展.中國生化藥物雜志.2012,33(3) :316-9]。Kunitz型絲氨酸 蛋白酶抑制劑具有復(fù)雜多樣的功能，如具有抗炎、抗菌或抗蟲等作用，目前已有牛胰蛋白酶 抑制劑（BPTI)、尿胰蛋白酶抑制劑（UTI)等Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑作為藥物進(jìn)入臨 床應(yīng)用。
[0005] 生物體內(nèi)分布有大量的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，目前在Genbank中登 記的含有Kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白/多肽已超過1萬多條。我們從美洲鉤蟲（Necator americanus)中獲得了 一種含有Kunitz型結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶抑制劑-Necatorin， Necatorin及其經(jīng)氨基酸殘基替換、缺失或添加而形成的突變體具有較強的抗凝作用， 能明顯延長血漿活化部分凝血活酶時間（APTT)，而對凝血酶原時間（PT)基本無影響。 Necatorin及其突變體對FXIa、或PK有很強的抑制作用。動物實驗表明：Necatorin及其 突變體能抑制血栓形成，而且出血副作用小。因此，Necatorin及其突變體是一種具有出 血副作用小的抗凝多肽，可應(yīng)用于制備預(yù)防和治療血栓性疾病藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑及其 應(yīng)用。該Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑具有較強的抗凝活性，能明顯延長血漿活化部分凝 血活酶時間（APTT)，而對凝血酶原時間（PT)基本無影響。該Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制 劑可應(yīng)用于制備藥物以治療和預(yù)防血栓性疾病，并且具有出血副作用小的優(yōu)點。
[0007] 本發(fā)明提供了一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑。該Kunitz型 絲氨酸蛋白酶抑制劑含有由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列組成的多肽，或者含有由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列組成的多肽經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的替代、缺失或添加而形成 的，且能明顯延長APTT，而對PT基本無影響。
[0008] 本發(fā)明提供了一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑。該抑制劑含 有由SEQIDNα2、或SEQIDNα3、或SEQIDNα4、或SEQIDNα5、或SEQIDNα6、或 SEQ ID N0. 7、或 SEQ ID N0. 8、或 SEQ ID N0. 9、或 SEQ ID N0. 10、或 SEQ ID N0. 11 所示氨 基酸序列組成的多肽，這些多肽能明顯延長ΑΡΤΤ，而對ΡΤ基本無影響。
[0009] 本發(fā)明提供了一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，其對FXIa或 PK有很強的抑制作用。其中，由SEQ ID N0. 1、或SEQ ID N0. 2、或SEQ ID N0. 3所示氨基酸 序列組成的多肽對激活的凝血因子十一（FXIa)及血漿激肽釋放酶（PK)兩者均有較強的抑 制作用，由 SEQ IDN0.4、或 SEQ ID Ν0.5、或 SEQ IDN0.6、或 SEQ ID Ν0.7、或 SEQ ID Ν0.8、 或SEQ ID NO. 9、或SEQ ID NO. 10、或SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列組成的多肽較SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列組成的多肽對FXIa抑制作用有增強或無明顯變化，但抑制PK的能力 明顯減弱，即抑制FXIa的特異性明顯增強了。
[0010] 本發(fā)明的一個應(yīng)用在于應(yīng)用提供的一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶 抑制劑制備治療和預(yù)防血栓性疾病藥物。包含本發(fā)明的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑具 有明顯的抑制血栓形成作用，而且對出血時間無明顯影響，可用于作為或發(fā)展成為出血副 作用小的抗血栓約物。
[0011] 本發(fā)明的其它方面由于本文技術(shù)內(nèi)容的公開，對本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員是易于理解 并實施的。例如，包含本發(fā)明所述的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑與其它抗栓藥物聯(lián)合用 藥可減少出血副作用，包含本發(fā)明所述的多肽藥物組合物在臨床中的應(yīng)用，包含本發(fā)明的 多肽藥物與白蛋白等偶聯(lián)或融合以提高藥物半衰期，包含本發(fā)明的抗凝多肽在作為抗凝制 劑中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明提供的一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的優(yōu)點是：該 種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑不但能夠制備作為有效治療和預(yù)防血栓性疾病藥物應(yīng) 用，而且出血副作用小，對于解決目前臨床抗栓藥物治療出現(xiàn)的出血副作用具有重大價值。
【附圖說明】
[0013] 以下附圖僅旨在于對本發(fā)明做示意性說明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。其中， 圖1顯示的是Necatorin對APTT及PT的影響，X軸數(shù)值為Necatorin濃度（nM)，Y軸數(shù)值 為凝血時間（秒，sec)，Necatorin延長APT T的活性與其濃度呈依賴關(guān)系；圖2顯示的是 Necatorin的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列，上方序列為核苷酸序列，下方為氨基酸殘基 (簡寫）序列，示終止，下劃線部分序列為預(yù)測的信號肽序列。
【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合具體實例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做出的等同替換，均屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0015] 實施例1 :Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的獲得與制備
[0016] 在Genbank中登記的美洲鉤蟲基因組測序數(shù)據(jù)中，一種預(yù)測為具有Kunitz型結(jié)構(gòu) 域的多肽/蛋白（GenBank:ETN84717. 1)由62個氨基酸殘基組成，但其僅含有4個半胱氨酸 殘基（cys)，提示該Kunitz型結(jié)構(gòu)域還不不完整。多種已知的美洲鉤蟲Kunitz型絲氨酸蛋 白酶抑制劑信號肽具有較保守序列"MK/RFLLFLL"，因此我們利用已知的美洲鉤蟲Kunitz 型絲氨酸蛋白酶抑制劑（GenBank :ΕΤΝ75126· 1及GenBank :ΕΤΝ82803· 1)的cDNA序列設(shè)計 上游引物5'4了64441'1'1'(^6〇^1'1'1'(：1'1'-3'，根據(jù)前述661^31^疋了胳4717.1序列的相應(yīng)〇0嫩 序列（GenBank :KI657882. 1)設(shè)計下游引物 5'-CTACAGTTTATGTTTGCGGTTTA-3'，以美洲鉤蟲 成蟲cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得了具有完整成熟肽的編碼基因，編碼基因及其編 碼序列見圖2。編碼成熟肽序列見SEQ ID NO. 1所示序列，由69個氨基酸殘基組成，具有典 型Kunitz型結(jié)構(gòu)域所具備的6個半胱氨酸殘基（cys)。
[0017] 用BlastP程序進(jìn)行檢索，在GenBank中與SEQ ID NO. 1所示序列氨基酸序列 一致性大于或等于66%的序列有2條，其中具有最大序列相似性的序列為前述GenBank : ETN84717. 1所述序列，兩者的羧基端的50個氨基酸殘基序列一致，但氨基端序列有明顯差 異，且前者成熟肽由69個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸殘基（cys);后者登記的完 整序列由62個氨基酸殘基組成，僅含有4個半胱氨酸殘基（cys);與SEQ ID NO. 1所示序 列具有其次序列相似性的序列為GenBank :ETN84721. 1所述序列，兩者氨基酸序列一致性 (Identities)為68% (38/56)。因此，我們命名我們獲得的多肽為Necatorin。目前尚無 任何有關(guān)SEQ ID NO. 1序列的生物活性（功能）研究。
[0018] 用PCR法對SEQ ID NO. 1編碼序列進(jìn)行突變，結(jié)果獲得了突變體AP-1(SEQ ID N0. 2 所示氨基酸序列）、AP-2 (SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列）、AP-3 (SEQ ID NO. 4所示氨基酸序 列）、AP-4 (SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列）、AP-5 (SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列）、AP-6 (SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列）、AP-8 (SEQ ID NO. 9所示氨基酸序列）、AP-9 (SEQ ID NO. 10所 示氨基酸序列）及AP-10 (SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列）編碼序列。
[0019] Necatorin及其突變體編碼基因經(jīng)克隆、酶切連接入表達(dá)質(zhì)粒pET32a，成功構(gòu)建 的表達(dá)質(zhì)粒pET32a/Necatorin (或其突變體編碼序列）轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、離心分離細(xì)菌、超聲破碎、Ni-NTA親和層析獲得了純化的含Necatorin或其 突變體的融合蛋白，再用牛腸激酶切割融合蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析分離融合伴侶Trx和 目的多肽，獲得重組目的多肽。
[0020] 實施例2 :本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的抗凝活性
[0021] 本實施例中，用活化部分凝血活酶時間（APTT)及凝血酶原時間（PT)法檢測本發(fā) 明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的抗凝活性。本實施例所述的Kunitz型絲氨酸蛋 白酶抑制劑（抗凝多肽）是通過在大腸桿菌中重組表達(dá)、分離純化獲得（見實施例1)。
[0022] 活化部分凝血活酶時間（APTT)測定（白陶土）：于塑料試管中取10 μ 1 -定濃度 的抗凝多肽（空白對照用濃度為〇· 9 %的生理鹽水）與0· lml正常人血漿（枸櫞酸鈉抗凝） 混勻后，加入APTT (上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）試劑0. lml，37°C水浴5min，其間輕 輕振搖，再加入25mmol/L CaC12溶液0. lml混勾，置于37°C水浴，搖勾計時，觀察凝固時間， 即為APTT值。每個濃度均重復(fù)3次，取平均值。通過計算該重組多肽延長凝血時間的倍數(shù) 值分析其延長APTT的能力，計算公式為：延長APTT倍數(shù)=(測定的各濃度APTT值-空白 對照組APTT值）/空白對照組APTT值。
[0023] 凝血酶原時間（PT)測定：于塑料試管中取10 μ 1 -定濃度的抗凝多肽（空白對照 用生理鹽水）與0.1ml正常人血漿（枸櫞酸鈉抗凝）混勻后，37°C溫浴5min后，加入預(yù)溫 PT試劑（上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）0. 2ml，混勻，開始計時，血液凝固時間即為PT 值。
[0024] 結(jié)果表明：Necatorin及其突變體均能明顯延長APTT (表1)，但均基本不影響PT。 在50nM及ΙΟΟηΜ濃度（終濃度）下，重組Necatorin(SEQ ID NO. 1所示序列）分別能延長 0.43倍及1.01倍APTT。保留有3對完整Cys結(jié)構(gòu)的截斷突變體AP-1(SEQ ID N0. 2所示 序列）及AP-2 (SEQ ID Ν0· 3所示序列）具有與Necatorin相似的延長APTT活性；突變體 AP-3~AP-10 (SEQ ID N0. 4~SEQ ID N0. 11所示序列）延長APTT活性均有顯著增強（P < 0· 05)，如ΙΟΟηΜ的AP-3及AP-4分別能延長1. 66及1. 42倍APTT。但即使在lOOOnmol 的濃度下，Necatorin及其突變體均不明顯延長PT。
[0025] 不同濃度的Necatorin對APTT、PT的影響可見圖1。Necatorin延長APTT的能力 與其濃度呈依賴關(guān)系，但其基本不能延長PT。
[0026] 表1本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對APTT的影響
[0027]
[0028] 實施例3 :本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對凝血因子的抑制作用
[0029] 本實施例所述的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑（重組抗凝多肽）是通過在大腸 桿菌中重組表達(dá)、分離純化獲得（見實施例1)。用發(fā)色底物法檢測各重組多肽對凝血因子 的作用。
[0030] 在酶標(biāo)板每孔200 μ 1反應(yīng)體系中進(jìn)行。100 μ L人凝血因子Xla(FXIa)、或人 FXIIa(終濃發(fā)為lnM，Haematologic lechnologies Inc產(chǎn)品）、或人血衆(zhòng)激肽釋放酶 (plasma kallikrein，PK)(終濃度為InM，Merck產(chǎn)品）分別與20 μ L不同濃度重組多肽 (對照組用PBS)混勻。在25°C孵育15分鐘后，加入80yL發(fā)色底物（FXIa及FXIIa發(fā) 色底物用S2366,終濃度均為0. 4mM ;PK發(fā)色底物用S2302,終濃度為0. 8mM。發(fā)色底物均 為Chromogenix產(chǎn)品），3分鐘后測0D4()5值，根據(jù)0D 4。5值變化計算抑制情況，重復(fù)測3孔。 抑制率計算公式為：抑制率=(對照組〇D 4(]5值-加入重組多肽的0D 4。5值）/對照組0D 4。5 值 X100%〇
[0031] 結(jié)果表明：Necatorin及其突變體對PK、或FXIa有較強的抑制作用（表2和表3)。 Necatorin、AP-1 (SEQ ID N0. 2 所示序列）及 AP-2 (SEQ ID N0. 3 所示序列）對 PK 及 FXIa 兩者均有很強的抑制作用，如1〇ηΜ濃度的Necatorin可抑制83 %的PK活性及63 %的FXIa 活性。突變體AP-3~AP-10 (SEQ ID NO. 4~SEQ ID NO. 11所示序列）抑制FXIa的活性 較野生型序列（SEQ ID NO. 1所示序列）有所增強或無明顯變化，但他們抑制PK活性均有 不同程度減弱，如ΙΟΟηΜ的Necatorin能抑制約97%的ΡΚ活性，但ΙΟΟηΜ的AP-3 (SEQ ID NO. 4所示序列）僅能抑制約40%的PK活性。部分突變體抑制PK活性降低了，意味著其抑 制FXIa的特異性增強了。
[0032] 表2本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對PK的抑制作用
[0033]
[0034] 表3本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對FXIa的抑制作用
[0035]
[0036] 實施例4 :本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對小鼠尾出血時間（BT) 的影響
[0037] 取昆明小鼠，體重18~22g，雌雄各半，隨機(jī)分組（每組8只）。小鼠腹腔注射2 %戊 巴比妥鈉0. 2ml/100g麻醉，麻醉后于尾靜脈注射給藥，分別給予各重組多肽高（5mg *kg ^、 低（50 μ g · kg 4 2個劑量組、肝素鈉（1650U/kg，天津生物化學(xué)制藥有限公司）組和生理 鹽水組。給藥l〇min后，于鼠尾術(shù)端1mm處用外科手術(shù)刀橫向切斷鼠尾，立即將鼠尾放于試 管內(nèi)37°C恒溫的生理鹽水中，開始計時，觀察出血情況并記錄出血時間（BT)。出血時間最 長觀察10分鐘，超過10分鐘仍出血的按10分鐘計算。
[0038] 結(jié)果表明：本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對出血時間（BT)無明顯 影響（表4)，表明本發(fā)明所提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對小鼠的正常止血功能無 明顯影響，作為藥物應(yīng)用時，出血副作用小。
[0039] 表4本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對小鼠出血時間的影響（η = 8)
[0040]
[0041] 實施例5 :本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對大鼠動-靜脈旁路血栓 形成的影響
[0042] 取雄性SD大鼠，體重300~350g，隨機(jī)分組，每組8只，包括生理鹽水對照組，陽 性對照組（100U · kg 1肝素鈉，天津生物化學(xué)制藥有限公司），重組多肽（Necatorin、AP-3、 AP-4 及 AP-5)低（50 μ g · kg 3、中（200 μ g · kg 4 和高劑量組（800 μ g · kg 4。大鼠腹腔 注射2%戊巴比妥鈉1.5ml/kg體重，仰位固定，分離氣管插管。手術(shù)分離出右頸總動脈及左 頸外靜脈，在一內(nèi)徑1. 5mm、長22cm、充滿50U · mL的肝素生理鹽水的娃化聚乙稀管內(nèi)，內(nèi) 置一根長5cm的4號手術(shù)縫合線，將聚乙烯管的一端插入右頸總動脈，另一端插入左頸外靜 脈。尾靜脈給藥，給藥后5min，打開動脈夾，血液由右頸總動脈流經(jīng)聚乙烯管返回左頸外靜 脈。開放血流20min后中斷血流，迅速取出絲線稱重，總重量減去絲線重量為血栓濕重。血 栓形成抑制率=(生理鹽水對照組血栓濕重-給藥組血栓濕重）/生理鹽水對照組血栓濕 重 X100%〇
[0043] 結(jié)果見表5,與生理鹽水對照組比較，本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶 抑制劑能顯著抑制大鼠動-靜脈旁路血栓形成（p < 0. 01)，如Necatorin低劑量組 (50 μ g · kg 3血栓濕重為（10. 5 ± 2. 1) mg，血栓形成抑制率為78. 7 %。
[0044] 表5本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對大鼠動-靜脈旁路血栓形成 的影響（η = 8)
[0045]
[0046] 與生理鹽水對照組比較，Y < 0. 01
[0047] 實施例6 :本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對大鼠頸總動脈血栓形成 的影響
[0048] 取雄性SD大鼠（體重300-350g)隨機(jī)分組（8只/組），包括假手術(shù)組，模型組， 肝素鈉組（1650U · kg ^，重組多肽（Necatorin、AP-3、AP-4 及 AP-5)低（50 μ g · kg ^、中 (200 μ g · kg 4及高劑量組（800 μ g · kg 4。大鼠用以2%戊巴比妥鈉溶液1. 5ml/kg劑量 腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，于頸部正中切口，小心剝離左側(cè)頸總動脈1. 5cm，穿過 2根2號縫合線將其游離，用塑料紙將血管與周圍組織隔開，以保護(hù)血管周圍正常組織。尾 靜脈給藥后，將準(zhǔn)備好浸潤有40 μ 1 10% FeCl3溶液的濾紙片（0. 8cmX2. 0cm)將血管包 裹lOmin，從而誘導(dǎo)動脈血栓形成。20min后，結(jié)扎濾紙條兩端血管，精確剪下濾紙條包裹的 血管段，用濾紙吸干血管內(nèi)余血，稱重。血栓濕重=(含血栓的血管重量-取出血栓后的血 管重量）。假手術(shù)組用生理鹽水代替FeC13浸泡的濾紙條。
[0049] 結(jié)果見表6,與模型組比較，本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑能顯著 抑制大鼠頸總動脈血栓形成，如Necatorin低劑量組（50 μ g · kg 3血栓濕重為（4. 140. 8) mg，較模型組血栓濕重（7. 5 ±0. 7) mg顯著降低。
[0050] 表6本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對大鼠頸總動脈血栓形成的影 響（η = 8)
[0051]
[0052] 與生理鹽水對照組比較，*p <0· 01
[0053] 實施例7 :本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對大鼠靜脈血栓形成的影 響
[0054] 取雄性SD大鼠（體重300-350g)隨機(jī)分組（8只/組），包括生理鹽水對照組，重 組多肽（Necatorin、AP-3、AP-4 及 AP-5)低（50 μ g · kg ^、中（200 μ g · kg》及高劑量組 (800 μ g · kg 4。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液1. 5ml/kg劑量麻醉，剖腹分離下腔靜 脈，于左腎靜脈下方置一絲線備結(jié)扎血管用，自尾靜脈注射不同濃度受試藥物，5min后結(jié)扎 下腔靜脈造成淤血，然后關(guān)閉腹腔，4h后再次打開腹腔，于結(jié)扎下方2. Oem處夾閉血管，縱 行剖開檢查有無血栓形成，以正常對照組為基準(zhǔn)計算各組血栓形成比率，即血栓形成比率 為給有血栓形成的大鼠數(shù)/每組實驗大鼠數(shù)。抑制率=[(每組實驗大鼠只數(shù)-每組有血 栓形成的大鼠只數(shù)）/每組實驗大鼠只數(shù)_(生理鹽水組實驗大鼠只數(shù)-生理鹽水組有血栓 形成的大鼠只數(shù)）/生理鹽水組實驗大鼠只數(shù)）]。
[0055] 結(jié)果表明（表7)本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑能顯著抑制大鼠的 靜脈血栓形成，如在Necatorin低劑量組（50 μ g · kg》，10只實驗大鼠中有2只大鼠有靜 脈血栓形成，相對于生理鹽水組的100%大鼠能形成血栓，血栓形成抑制率為80%。
[0056] 表7本發(fā)明提供的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑對大鼠下腔靜脈血栓形成的影 響（η = 10)
[0057] 與生理鹽水對照組比較，Y < 0. 01
[0058] 以上所述僅為本發(fā)明示意性的【具體實施方式】，并非用以限定本發(fā)明的范圍。任何 本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思和原則的前提下所作的等同變化、修改與結(jié)合， 均應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。 工業(yè)實用件
[0059] 本發(fā)明提供的具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑是凝血因子 Xla(FXIa)，或血漿激肽釋放酶（PK)的抑制劑，該類抑制劑不但能夠制備作為有效預(yù)防和 治療血栓性疾病藥物應(yīng)用，而且出血副作用小，對于解決目前臨床抗凝抗栓治療出現(xiàn)的出 血并發(fā)癥具有重大意義。
【主權(quán)項】
1. 一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在于含有： (a) 由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列組成的多肽；或者 (b) 由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或添加而 形成的、且能明顯延長血漿活化部分凝血活酶時間，但不延長凝血酶原時間。2. 如權(quán)利要求1所述的一種具有抗凝作用的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在 于，所述的替換、缺失或添加而形成的多肽含有：由SEQ ID NO. 2、或SEQ ID NO. 3、或SEQ ID NO. 4、或 SEQ ID NO. 5、或 SEQ ID NO. 6、或 SEQ ID NO. 7、或 SEQ ID NO. 8、或 SEQ ID NO. 9、 或SEQ ID NO. 10、或SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列組成的多肽。3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于在 制備治療和預(yù)防血栓性疾病藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，將所 述的一種Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑或其衍生物或組合物作為活性成份直接或與藥學(xué) 上可接受的載體制成制劑。
【文檔編號】A61K38/57GK105985432SQ201510097858
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月5日
【發(fā)明人】莫永炎
【申請人】莫永炎