本發(fā)明涉及一種吡喃衍生物藥學上可接受的鹽或其鹽的水合物，以及其晶型結(jié)構(gòu)、制備方法或其藥物組合物和它們在制備二肽激酶-IV(DPP-IV)抑制劑藥物上的用途。
背景技術(shù)：
：二肽基肽酶-IV(DipeptidylPeptidase,DPP-IV,EC3.4.14.5)是一個絲氨酸蛋白酶，從含有L-脯氨酸和L-丙氨酸的多肽N端倒數(shù)第二位水解N端二肽。通過增強腸促胰島素活性發(fā)揮作用，屬于非胰島素治療藥物。DPP-IV抑制劑無體重增加和水腫等不良反應。PCT/CN2015/080570專利申請公開了新的吡喃衍生物(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃基-3-胺，結(jié)構(gòu)式如式(A)。該結(jié)構(gòu)顯示對DPP-IV具有良好的抑制作用，具有用于預防和/或治療II型糖尿病的潛能。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明主要目的在于提供吡喃衍生物：(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃基-3-胺的鹽或其鹽的水合物及其晶型。在本發(fā)明藥物或其組合物的制備中，其鹽或其鹽的水合物及其晶型比游離堿化合物具有更好的穩(wěn)定性，耐高溫、高濕及強光照，使其更適于藥物劑型的制備。本發(fā)明涉及一種式(I)所示化合物的鹽或其鹽的水合物：本發(fā)明優(yōu)選方案，式(I)所示化合物的鹽或其鹽的水合物為式(II)結(jié)構(gòu)：其中，HA為藥學上可接受的酸，比如鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、丙二酸、草酸、己二酸、三氟乙酸、琥珀酸、水楊酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸；n選自1或2；m選自0～3。本發(fā)明優(yōu)選方案，HA選自鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、丙二酸、草酸、己二酸、三氟乙酸、琥珀酸、水楊酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸。本發(fā)明優(yōu)選方案，當HA選自鹽酸、磷酸或?qū)妆交撬釙r，n選自1或2；當HA選自苯甲酸、檸檬酸或富馬酸時，n選自1。本發(fā)明優(yōu)選方案，一種式(III)所示的化合物：其中，m選自1～3。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物為晶型I，使用Cu-Kα輻射，其X-射線粉末衍射圖譜在以下2θ位置具有特征衍射峰：6.7°±0.2°、13.8°±0.2°、14.5°±0.2°、24.2°±0.2°和27.9°±0.2°。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物為晶型I，使用Cu-Kα輻射，其X-射線粉末衍射圖譜還在以下2θ位置具有特征衍射峰：14.0°±0.2°、16.5°±0.2°、17.8°±0.2°、19.3°±0.2°、20.3°±0.2°和21.0°±0.2°。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物為晶型I，使用Cu-Kα輻射，其X-射線粉末衍射圖譜還在以下2θ位置具有特征衍射峰：13.4°±0.2°、15.4°±0.2°、22.7°±0.2°、24.5°±0.2°和25.0°±0.2°。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物的晶型I的X-射線粉末衍射圖譜基本如圖1所示。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物的差示掃描量熱熱分析圖基本如圖2所示。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物的熱重分析曲線基本如圖3所示。本發(fā)明優(yōu)選方案，式(III)所示的化合物，m＝3。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的如上所述鹽或其鹽的水合物，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供通式(I)所示的化合物的鹽或其鹽的水合物，或通式(II)或通式(III)所述化合物，或如上所述的藥物組合物在制備用于預防和/或治療糖尿病和/或糖尿病并發(fā)癥的藥物中的應用。優(yōu)選地，所述糖尿病并發(fā)癥包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性神經(jīng)病和糖尿病性腎病中的一種或多種。優(yōu)選地，所述糖尿病包括II型糖尿病。本發(fā)明還提供一種治療代謝性疾病的方法，所述方法包括給藥本發(fā)明任意所述的鹽或其鹽的水合物，或前述藥物組合物。本發(fā)明化合物的合成方法為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明化合物可以由以下方案制備而得：式(IV)化合物與HA反應得到式(II)；或式(V)化合物與HA反應得到式(II)；其中，HA選自鹽酸、硫酸、磷酸、醋酸、丙酸、丙二酸、草酸、己二酸、三氟乙酸、琥珀酸、水楊酸、苯甲酸、鄰苯二甲酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、苯磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸；n選自1或2；m選自0～3；P為氨基保護基。優(yōu)選地，HA選自鹽酸、磷酸、苯甲酸、對甲苯磺酸、檸檬酸或富馬酸。更優(yōu)選地，HA為質(zhì)量分數(shù)為15％～37％的鹽酸。通式(IV)化合物或者通式(V)化合物可用溶劑溶解后，加入HA酸進行反應，其中：溶劑可以是一切能夠溶解通式(IV)化合物或者通式(V)化合物的溶劑，比如乙醇；反應在0～90℃均可以。反應得到的產(chǎn)物純度高，作為選擇，得到的產(chǎn)物還可以進一步重結(jié)晶。重結(jié)晶時，產(chǎn)物可以選擇離子水與乙醇的混合液溶解，加熱溶解后，用合適的析晶溶劑析出產(chǎn)物，所述的析晶溶劑，比如醋酸異丙酯、乙酸乙酯、異丙醚或甲基叔丁基醚。本發(fā)明的反應根據(jù)TLC或者HPLC等本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法跟蹤反應進度。本發(fā)明二鹽酸鹽水合物合成中，鹽酸與游離堿化合物的摩爾比例為3:1至10:1。本發(fā)明中參與反應的酸一般在0℃～室溫條件下滴加到反應體系，可以在0℃以下滴加。除非有相反的陳述，本發(fā)明中使用的術(shù)語具有下述含義。本發(fā)明所述基團和化合物中所涉及的碳、氫、氧、硫、氮或鹵素均包括它們的同位素，及本發(fā)明所述基團和化合物中所涉及的碳、氫、氧、硫、氮或鹵素任選進一步被一個或多個它們對應的同位素所替代，其中碳的同位素包括12C、13C和C14，氫的同位素包括氕(H)、氘(D，又稱為重氫)、氚(T，又稱為超重氫)，氧的同位素包括16O、17O和18O，硫的同位素包括32S、33S、34S和36S，氮的同位素包括14N和15N，氟的同位素19F，氯的同位素包括35Cl和37Cl，溴的同位素包括79Br和81Br。本文所述化合物可以含有一個或多個不對稱中心，并且由此可以以外消旋物、外消旋混合物、單一對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體混合物和單一非対映異構(gòu)體存在?！坝行┝俊爸敢鸾M織、系統(tǒng)或受試者生理或醫(yī)學翻譯的化合物的量，此量是所尋求的，包括在受治療者身上施用時足以預防受治療的疾患或病癥的一種或幾種癥狀發(fā)生或使其減輕至某種程度的化合物的量?！癐C50”指半數(shù)抑制濃度，指達到最大抑制效果一半時的濃度。數(shù)值范圍a～b表示從數(shù)a到數(shù)b的任意數(shù)，比如，“m選自1～3”表示m可以選自1至3任意的數(shù)值。本發(fā)明晶型結(jié)構(gòu)可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種分析技術(shù)分析，包括但不限于，X-射線粉末衍射(XRD)、示差掃描熱法(DSC)和/或熱重法(TG)。熱重分析(ThermogravimetricAnalysis，TGA)，又叫熱重法(Thermogravimetry，TG)。附圖說明圖1是化合物1在80℃干燥16小時所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖2是化合物1在80℃干燥16小時所得的晶型I的差示掃描量熱(DSC)熱分析圖。圖3是化合物1在80℃干燥16小時所得的晶型I的熱重(TG)曲線-微熵熱重分析(DTG)曲線。圖4是化合物1在80℃干燥8小時所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖5是化合物1在60℃干燥10小時所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖6是化合物1在30℃干燥8小時所得的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖7A是由單晶衍射確定的化合物1的單晶中分子球棍模型；圖7B為與圖7A相對應的由單晶確定的絕對構(gòu)型；圖7C為單晶中氫鍵示意圖(圖中O2～O4表示水分子)。圖8是實施例9中化合物1重結(jié)晶前的晶型I使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。圖9是實施例9中化合物1重結(jié)晶后的晶型使用Cu-Kα輻射的X-射線粉末衍射圖譜。具體實施方式以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施過程和產(chǎn)生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)和特點，不作為對本案可實施范圍的限定。化合物的結(jié)構(gòu)是通過核磁共振(NMR)和/或質(zhì)譜(MS)來確定的。NMR的測定是用(BrukerADVANCEIII400)核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，內(nèi)標為四甲基硅烷(TMS)。MS的測定用(Agilent6120B(ESI))。HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(Zorba×SB-C18100×4.6mm)。薄層層析硅膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅膠板采用的規(guī)格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm～0.5mm。柱層析一般使用煙臺黃海硅膠200～300目硅膠為載體。無特殊說明，甲基叔丁基醚、四丁基溴化銨、氫化鈉、三氟乙酸購買于成都市科龍化工試劑廠；二碳酸二叔丁基酯、N,N'-二羰基二咪唑、N,O-二甲基羥氨鹽酸鹽購買于愛斯特(成都)醫(yī)藥技術(shù)有限公司；碳酸銫、N-羥基丁二酰亞胺、二苯亞甲基甘氨酸乙酯購買于安耐吉化學；2,5-二氟溴苯購買于上海德默醫(yī)藥科技有限公司；異丙基氯化鎂/氯化鋰四氫呋喃溶液購買于百靈威科技有限公司；炔丙基苯磺酸酯、四丁基氟化銨、三(乙酰氧基)硼氫化鈉、四丁基六氟磷酸胺購買于阿達瑪斯試劑公司；環(huán)戊二烯基雙(三苯基膦)氯化釕(II)購買于ACROSorgainics；硼烷二甲硫醚購買于韶遠化學科技(上海)有限公司；過硼酸鈉購買于天津光復精細化工研究所；氯{[(1R,2R)-(-)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](五氟苯磺酰)氨基}(對傘花烴)釕(II)購買于Stremchemical；碘甲烷購買于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。氫氣氛是指反應瓶連接一個約2L容積的氫氣氣球。氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反復操作3次。實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫。室溫溫度為10℃～30℃。中間體1：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羰基四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(中間體1)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-oxotetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate第一步：2-氨基戊基-4-炔酸乙酯(1B)ethyl2-aminopent-4-ynoate室溫下，將1A(50g,0.187mol)溶于甲基叔丁基醚(300mL)中，加入炔丙基苯磺酸酯(44g,0.224mol)和四丁基溴化銨(6.1g,0.019mol)，升溫至50℃，加入碳酸銫(121.8g,0.374mol)，于50℃溫度下反應過夜。將反應液過濾，濾餅用甲基叔丁基醚(40mL×2)洗滌，合并有機相，旋蒸濃縮至一半體積，加入鹽酸溶液(3mol/L,100mL)，室溫下攪拌1小時，靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(70mL×2)萃取，收集水相，濃縮得到1B。第二步：2-((叔丁氧羰基)氨基)-4-炔戊酸(1C)2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pent-4-ynoicacid將氫氧化鈉(33.7g,0.842mol)溶于水(100mL)，逐滴滴加至1B(26.4g,0.187mol)中，室溫下攪拌2小時，滴加二碳酸二叔丁基酯(45g,0.206mol)的甲基叔丁基醚(125mL)溶液，室溫下攪拌4小時。靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(80mL×2)洗滌，水相用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH約3，用甲基叔丁基醚(100mL×2)萃取，合并有機相，有機相用飽和氯化鈉水溶液(30mL×2)洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，旋干，得到黃色油狀液體1C(33g,產(chǎn)率83％)。Msm/z(ESI):212.0[M-1]。第三步：(1-(甲氧基(甲基)氨基)-1-羰基戊基-4-炔-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1D)tert-butyl(1-(methoxy(methyl)amino)-1-oxopent-4-yn-2-yl)carbamate將1C(33g,0.155mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(200mL)中，控制溫度小于10℃，加入N,N'-羰基二咪唑(32.58g,0.201mol)，0℃下反應1小時，加入N,O-二甲基羥氨鹽酸鹽(19.6g,0.186mol)，室溫攪拌過夜。向反應液中逐滴加入水(150mL)，攪拌1小時，用乙酸乙酯(100mL×2)萃取，合并有機相，有機相依次用飽和碳酸氫鈉溶液(60mL×3)、飽和氯化鈉溶液(60mL×3)洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝10:1)，得到白色固體1D(35g,產(chǎn)率88.2％)。Msm/z(ESI):156.9[M-100]。第四步：(1-(2,5-二氟苯基)-1-羰基戊基-4-炔-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1E)tert-butyl(1-(2,5-difluorophenyl)-1-oxopent-4-yn-2-yl)carbamate氮氣保護下，將2,5-二氟溴苯(15.05g，78mmol)溶于干燥甲苯(50mL)中，冰鹽浴降溫至-10℃以下，逐滴加入異丙基氯化鎂/氯化鋰四氫呋喃溶液(66mL,1.3mol/L)，保持在-10℃左右攪拌1小時，滴加1D(10g,39mmol)的干燥四氫呋喃(100mL)溶液，保持溫度-10℃，加畢，于室溫下反應4小時，將溫度降至-10℃左右，逐滴加入飽和氯化銨溶液(40mL)，攪拌10分鐘，用3mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH5～6，靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(50mL×2)萃取，合并有機相，有機相用飽和氯化鈉溶液(30mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝50:1～8:1)，得到淡黃色固體1E(10.1g,產(chǎn)率83.5％)。Msm/z(ESI):210.1[M-100]。第五步：((1R,2S)-1-(2,5-二氟苯基)-1-羥基戊基-4-炔-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1F)tert-butyl((1R,2S)-1-(2,5-difluorophenyl)-1-hydroxypent-4-yn-2-yl)carbamate將1E(16.07g,52mmol)溶于四氫呋喃(100mL)，加入三乙烯二胺(17.39g,155mmol)與氯{[(1R，2R)-(-)-2-氨基-1,2-二苯基乙基](五氟苯磺酰)氨基}(對傘花烴)釕(II)(即RuCl(p-cymene)(R,R)-FSDPEN)(0.37g,0.52mmol)，逐滴加入甲酸(14.27g,310mmol)，加畢，于40℃反應過夜。將反應液濃縮除去四氫呋喃和甲酸，向殘留物中加入水(60mL)和鹽酸(3mol/L,10mL)，用甲基叔丁基醚(90mL×3)萃取，合并有機相，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(35mL×2)洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝60:1～10:1)，得到淡黃色膠狀物1F(15.37g,產(chǎn)率95％)。Msm/z(ESI):334.2[M+23]。第六步：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(1G)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-3,4-dihydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1F(15.37g,49.4mmol)加熱條件下溶于N,N-二甲基甲酰胺(75mL)，加入四丁基六氟磷酸胺(2.49g,6.42mmol)、N-羥基丁二酰亞胺(2.84g,24.75mmol)、三苯基膦(0.86g,3.26mmol)和碳酸氫鈉(2.16g,25.69mmol)，氮氣置換三次，抽真空15分鐘，加入環(huán)戊二烯基雙(三苯基膦)氯化釕(II)(即CpRuCl(PPh3)2)(1.79g,2.47mmol)，氮氣置換三次，并抽真空15分鐘，氮氣保護下，升溫至85℃反應過夜。向反應液中加入水(300mL)和甲基叔丁基醚(200mL)，用硅膠過濾，濾液靜置后分液，水相用甲基叔丁基醚(90mL×2)萃取，合并有機相，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(60mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝80:1～30:1)，得到淡黃色粉末固體1G(8.9g,產(chǎn)率57.9％)。Msm/z(ESI):256.2[M-56]。第七步：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羥基四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(1H)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-hydroxytetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1G(8.9g,28.6mmol)溶解于干燥甲基叔丁基醚(90mL)中，加入干燥甲苯(9mL)，溫度降至-10℃，逐滴加入硼烷二甲硫醚四氫呋喃溶液(2mol/L,35.9mL)，于0℃下反應3.5小時。緩慢加入水(4mL)，逐滴加入氫氧化鈉溶液(1mol/L,89mL)，攪拌15分鐘，分批加入過硼酸鈉(13.2g,85.8mmol)，室溫攪拌過夜。靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(50mL×2)萃取，合并有機相，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，向殘留物中加入甲苯(50mL)，加熱至90℃溶解，將正己烷(200mL)滴加至反應液中，析出白色固體，過濾，正己烷(30mL×2)洗滌濾餅，濃縮除去溶劑，得到白色固體粉末1H(7.9g，產(chǎn)率84％)。Msm/z(ESI):274.1[M-56]。第八步：((2R,3S)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羰基-四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(中間體1)tert-butyl((2R,3S)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-oxo-tetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1H(11.53g,35.03mmol)溶解于二氯甲烷(130mL)，降溫至0℃，將戴斯馬丁氧化劑(29.72g,70.06mmol)分批加至反應液中，自然升至室溫反應4小時。降溫至0℃，將飽和碳酸氫鈉溶液(60mL)滴加至反應液中，攪拌20分鐘，過濾，濾液靜置分液，水相用甲基叔丁基醚(60mL×3)萃取，合并有機相，有機相用飽和碳酸氫鈉溶液(30mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮，殘留物用硅膠柱色譜分離提純(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝10:1-4:1)，得到白色晶狀粉末中間體1(10.85g,產(chǎn)率94.7％)。Msm/z(ESI):272.0[M-56]；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.29-7.13(m,4H),4.77–4.75(d,1H),4.22-4.12(d,2H),4.08-4.02(m,1H),2.75-2.70(m,2H),1.23(s,9H)。實施例1(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽水合物(化合物1)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminedihydrochloridehydrate第一步：2-乙氧基-2-亞氨基乙酸乙酯鹽酸鹽(1b)ethyl2-ethoxy-2-iminoacetatehydrochloride將氰基甲酸乙酯1a(9.9g,0.1moL)溶于干燥的乙醚(50mL)中，并加入干燥的無水乙醇(5.52g,0.12moL)，冰浴攪拌下通入干燥的氯化氫氣體直至飽和(體系增重5g)并繼續(xù)攪拌2小時，過濾析出的白色固體，濾餅用無水乙醚(20mL×3)洗滌，真空干燥，得到白色固體1b(14g,產(chǎn)率77％)。第二步：5-叔丁基2-乙基3a,4,6,6a-四氫吡咯并[3,4-d]咪唑-2,5(1H)-二甲酸酯(1c)5-tert-butyl2-ethyl3a,4,6,6a-tetrahydropyrrolo[3,4-d]imidazole-2,5(1H)-dicarboxy-late將叔丁基3,4-二胺基吡咯烷-1-羧酸酯鹽酸鹽(980mg,4.126mmoL)溶于六氟異丙醇(10mL)中，攪拌下加入1b(886mg,4.538mmoL)，50℃攪拌16小時。將反應液濃縮旋干，加入飽和食鹽水(50mL)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙酯乙酯(50mL×2)萃取。收集水相，并用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH值7～8，用乙酯乙酯(50mL×4)萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝20:1)，得到白色固體1c(700mg,產(chǎn)率60％)。MSm/z(ESI):284.1[M+1]；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.64(S,2H),4.37-4.33(q,2H),3.72-3.69(d,2H),3.55-3.50(dd,2H),1.44(s,9H),1.40-1.37(t,3H)。第三步：5-叔丁基2-乙基4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-2,5(1H)-二甲酸酯(1d)(2R,4R)-tert-butyl4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-2-(methoxymethyl)pyrrolidine-1-carboxylate將草酰氯(652.5mg,5.14mmoL)溶于干燥的二氯甲烷(15mL)中，用干冰丙酮浴降溫到-78℃，攪拌下滴加干燥的二甲基亞砜(803.96mg,10.29mmoL)，攪拌30分鐘。向反應液中滴加1c(970mg,3.43mmoL)的二氯甲烷(5mL)溶液，繼續(xù)攪拌20分鐘。-78℃下滴加二異丙基乙胺(2.216g,17.15mmoL)，自然升到室溫反應2小時。向反應液中加入飽和氯化銨溶液(50mL)、飽和氯化鈉溶液(50mL)和二氯甲烷(50mL)，分液，水相用二氯甲烷用(50mL×3)萃取，合并有機相，飽和氯化鈉溶液(50mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)得到白色固體1d(520mg,產(chǎn)率54％)。MSm/z(ESI):282.1[M+1]；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.54(s,2H),4.47(s,2H),4.46-4.41(q,2H),1.51(s,9H),1.44-1.41(t,3H)。第四步：5-叔丁基2-乙基1-甲基-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-2,5(1H)-二甲酸酯(1e)5-tert-butyl2-ethyl1-methyl-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-2,5(1H)-dicarboxylate將1d(5.4g,19.2mmoL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(110mL)中，加入碳酸鉀(3.3g,23.9mmoL)，冰浴下加入碘甲烷(3.4g,23.9mmoL)，室溫反應2小時，向反應液中加入飽和氯化銨溶液(300mL)，及飽和氯化鈉溶液(200mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，合并有機相，用飽和氯化鈉溶液(200mL×3)洗滌。用無水硫酸鈉干燥，過濾，將濾液減壓濃縮，得到淺黃色固體1e(5.3g,產(chǎn)率94％)。第五步：叔丁基2-氨甲?；?1-甲基-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1f)tert-butyl2-carbamoyl-1-methyl-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxy-late將1e(2.3g,7.8mmol)，溶于氨-甲醇溶液(40mL,7mol/L,280mmol)中，升溫至85℃封管攪拌反應20小時。將反應液冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)洗滌，濾液濃縮后與濾餅合并，得到白色固體1f(1.914g,產(chǎn)率93％)。第六步：叔丁基2-氰基-1-甲基-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1g)tert-butyl2-cyano-1-methyl-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate將1f(1.576g,5.925mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺(45mL)中，加入五氯化磷(1.482g,7.109mmol)，升溫至50℃反應2小時。將反應液冷卻至室溫，加入乙酸乙酯(50mL)，飽和氯化鈉溶液(150mL)，分液，水相用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有機相，分別用飽和食鹽水(50mL×3)、飽和碳酸氫鈉溶液(50mL×2)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，將濾液濃縮得到白色固體1g(1.25g,產(chǎn)率85％)。第七步：叔丁基1-甲基-2-(1H-四唑-5-基)-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1h)tert-butyl1-methyl-2-(1H-tetrazol-5-yl)-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate將1g(1030mg,4.153mmoL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入疊氮化鈉(810mg,12.459mmoL)及醋酸銨(960mg,12.459mmoL)，升溫至120℃反應過夜。加入1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值1～2，加水(200mL)，過濾，濾液用二氯甲烷(50mL×3)萃取。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，烘干得到黃色固體1h(1000mg,產(chǎn)率83％)。MSm/z(ESI):292.1[M+1]。第八步：叔丁基1-甲基-2-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1i-1)tert-butyl1-methyl-2-(2-methyl-2H-tetrazol-5-yl)-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate叔丁基1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)-4,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H)-甲酸酯(1i-2)tert-butyl1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-4,6-dihydropyrrolo[3,4-d]imidazole-5(1H)-carboxylate將1h(1000mg,3.436mmoL)溶于N,N-二甲基甲酰胺(25mL)中，冰浴下加入氫化鈉(165mg,4.124mmoL)，冰浴下攪拌0.5小時后加入碘甲烷(586mg,4.124mmoL)，自然升溫反應過夜。將反應液緩慢加入碎冰(50g)中，加入氯化鈉使溶液飽和，乙酸乙酯(50mL×4)萃取。合并有機相，用飽和氯化鈉溶液(50mL×3)洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，殘留物用硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯(v/v)＝2:1～1:1)，得到白色固體1i-1(682mg,產(chǎn)率55％)和白色固體1i-2(230mg,產(chǎn)率18％)。MSm/z(ESI):306.1[M+1]。1i-1：1HNMR(400MHz,DMSO):δ4.58-4.54(d,2H),4.39-4.37(d,2H),4.33(s,3H),3.99(s,3H),1.47(s，9H)。1i-2：1HNMR(400MHz,DMSO):δ4.54-4.50(d,2H),4.44(s,3H),4.34-4.31(d,2H),3.92-3.91(m,3H),1.47(s，9H)。第九步：1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)-1,4,5,6-四氫吡咯并[3,4-d]咪唑二苯磺酸鹽(1j)1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)-1,4,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-d]imidazoledibenzenesulfonate將1i-1(682mg,2.236mmoL)、苯磺酸.1.5H2O(827.3mg,4.472mmoL)溶于二氯甲烷(25mL)中，升溫至40℃反應過夜。將反應液濃縮旋干，真空干燥得到1j(1165mg)，直接用下一步反應。MSm/z(ESI):206.1[M+1]。第十步：叔丁基((2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸酯(1k)tert-butyl((2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-yl)carbamate將1j(1165mg,2.236mmoL)及中間體1(804.4mg,2.459mmoL)溶于N,N-二甲基乙酰胺(10mL)中，室溫下攪拌0.5小時，冰浴下加入三(乙酰氧基)硼氫化鈉(1279mg,6.037mmoL)，0℃攪拌0.5小時后自然升至室溫攪拌2小時。補加中間體1(400mg,1.223mmoL)及三(乙酰氧基)硼氫化鈉(400mg,1.887mmoL)，室溫反應2小時。將反應液加入飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)中，攪拌0.5小時，過濾，濾餅用水(20mL×3)洗滌后用二氯甲烷(100mL)溶解，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，殘留物用硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝60:1)，得到的粗產(chǎn)品用乙醚(50mL)溶解，加入正己烷(100mL)，過濾，得到黃色固體1k(480mg,產(chǎn)率42％)。MSm/z(ESI):517.1[M+1]。第十一步：(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺(1l)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-amine將1k(440mg,0.853mmoL)加入二氯甲烷(5mL)中，冰浴下加入三氟乙酸(2mL)，自然升至室溫反應2小時。將反應液旋干，加入飽和碳酸氫鈉溶液(100mL)調(diào)節(jié)pH值7～8，水相用二氯甲烷(30mL×4)萃取。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，殘留物用硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇(v/v)＝30:1,加入少量氨水)，得到黃色固體1l(134mg,產(chǎn)率38％)。MSm/z(ESI):417.1[M+1]；1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.23-7.06(m,3H),4.38(s,3H),4.32-4.26(m,2H),4.07-4.05(t,2H),4.03(s,3H),3.95-3.94(t,2H),3.46-3.41(t,1H),3.17-3.09(m,1H),2.96-2.90(m,1H),2.51-2.47(m,1H),1.58-1.49(q,1H)。第十二步：(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽水合物(化合物1)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminedihydrochloridehydrate1l(16g,38.43mmol)和無水乙醇(80mL)依次加入反應瓶中，將濃鹽酸(8mL)滴加到反應液中，加畢于室溫攪拌10分鐘，反應液中固體溶解完全，攪拌10分鐘后析出淺白色固體。將醋酸異丙酯(56mL)滴加到反應液中，室溫繼續(xù)攪拌1小時。將反應液過濾，濾餅用醋酸異丙酯(30mL×2)洗滌，抽干，真空干燥，得到灰白色固體化合物1(14g,收率85％)。圖2是所得化合物1在80℃干燥16小時所得的晶型I的差示掃描量熱(DSC)熱分析圖。圖3是化合物1在80℃干燥16小時所得的晶型I的熱重(TG)曲線-微熵熱重分析(DTG)曲線?；衔?通過單晶衍射測定化合物1所含HCl個數(shù)為2。單晶培養(yǎng)：取約5mg樣品放于玻璃小瓶中，用300μL乙醇超聲溶清，室溫下小孔揮發(fā)，得到小塊狀晶體，將此晶體作為晶種加至樣品的乙醇飽和溶液中，小孔揮發(fā)，得到塊狀晶體。單晶衍射儀器信息和檢測方法參數(shù)如表1所示：表1熱臺偏正光顯微鏡信息和檢測方法參數(shù)如表2所示：表2所得晶胞參數(shù)如下表3所示：表3單晶結(jié)構(gòu)信息表圖7A是由單晶衍射確定的化合物1的單晶中分子球棍模型；圖7B為與圖7A相對應的由單晶確定的絕對構(gòu)型；圖7C為單晶中氫鍵示意圖(圖中O2～O4表示水分子)，從圖7A～7C可知，一個API分子結(jié)合3個水分子，其中含O2的水分子與API分子通過氫鍵連接，比較穩(wěn)定，為結(jié)晶水；含O3和O4的兩個水分子處于游離的狀態(tài)，容易失去，但是對晶胞性狀不影響。實施例2(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽水合物(化合物1)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminedihydrochloridehydrate室溫下，1k(133g,0.257mol)和乙醇(864.5mL)依次加入反應瓶中，將濃鹽酸(146.3mL)滴加到反應液中，加畢于60℃～70℃反應3小時。將醋酸異丙酯(296.2mL)滴加到反應液中，自然冷卻到室溫，析出淺白色固體。過濾，濾餅用醋酸異丙酯(300mL×2)洗滌，抽干，真空干燥，得到灰白色固體化合物1(102g,收率80％)。實施例1或?qū)嵤├?中化合物1因真空干燥的溫度、時間不同，得到的水合物所含的水分子含量也不同，即包含的水分子個數(shù)不同，m值不同，見表4。表4化合物1經(jīng)不同溫度和干燥時間干燥后的含水量圖1所示為80℃干燥溫度、干燥16小時的X-粉末衍射圖，圖4所示為80℃干燥溫度、干燥8小時的X-粉末衍射圖，圖5所示為60℃干燥溫度、干燥10小時的X-粉末衍射圖，圖6所示為30℃干燥溫度、干燥8小時的X-粉末衍射圖。由此可知，雖然實施例1和實施例2中的水分子含量因真空干燥的溫度和時間不同而不同，但是其X-粉末衍射的圖基本一致，故本發(fā)明認為含有1～3摩爾水的(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯并[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺二鹽酸鹽都得到I型結(jié)晶。實施例3(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-對甲苯磺酸鹽(化合物2)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-amine4-methylbenzenesulfonate室溫下，將1l(2.0g,4.8mmol)溶于乙酸乙酯(60mL)中，加入反應瓶，將對甲苯磺酸一水合物(0.912g,4.8mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應液中，滴加完畢室溫下反應2小時。反應液有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物2(2.5g,產(chǎn)率88.6％，HPLC純度99.5％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.01(s,3H),7.49(d,2H),7.38-7.33(m,3H),7.12(d,2H),4.55(d,1H),4.34(s,3H),4.21(m,1H),4.06-3.99(m,4H),3.87(m,2H),3.60(m,1H),3.41(m,2H),3.11(m,1H),2.50(m,1H),2.29(s,3H),1.72(m,1H)。實施例4(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-二對甲苯磺酸鹽(化合物3)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminebis(4-methylbenzenesulfonate)室溫下，將1l(2.0g,4.8mmol)溶于乙酸乙酯(60mL)中，加入反應瓶，將對甲苯磺酸一水合物(1.824g,9.6mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應液，滴加完畢室溫下反應2小時。反應液有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物3(3.1g,產(chǎn)率85％，HPLC純度99.63％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.19(s,3H),7.49-7.47(m,4H),7.38-7.35(m,3H),7.11(d,4H),4.75-4.52(m,5H),4.41-4.34(m,4H),4.03(m,4H),3.67-3.62(m,2H),2.70(m,1H),2.27(s,6H),2.00(m,1H)。實施例5(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-磷酸鹽(化合物4)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminephosphate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應瓶，將磷酸(0.693g,6mmol，質(zhì)量分數(shù)為85％)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應液，滴加完畢室溫下反應2小時。反應液中有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物4(1.6g,產(chǎn)率52％，HPLC純度99.53％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.78(brs,5H),7.37-7.28(m,3H),4.50-4.37(m,1H),4.34(s,3H),4.19-4.16(m,1H),4.04-3.98(m,5H),3.86(m,2H),3.41-3.36(m,2H),3.10-3.05(m,1H),2.54(m,1H),1.70-1.67(m,1H)。實施例6(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-苯甲酸鹽(化合物5)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminebenzoate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應瓶，將苯甲酸(0.733g,6mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，滴加到上述反應液，滴加完畢室溫下反應2小時。反應液有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物5(2.1g,產(chǎn)率62％，HPLC純度99.76％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.95(d,2H),7.60(d,1H),7.49(t,2H),7.27-7.20(m,3H),4.34(s,3H),4.19-4.14(m,2H),4.03-3.98(m,5H),3.84(m,2H),3.30(t,1H),3.01-2.98(m,2H),2.35(d,1H),1.49-1.40(m,1H)。實施例7(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-檸檬酸鹽(化合物6)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-amine2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應瓶，將檸檬酸(1.152g,6mmol)溶于乙醇(20mL)中，滴加到上述反應液，滴加完畢室溫下反應2小時。反應液中有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物6(3.2g,產(chǎn)率87.7％，HPLC純度99.47％)。1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.36-7.20(m,3H),4.67-4.65(m,1H),4.39-4.35(m,4H),4.15-4.09(m,2H),4.05-4.00(m,5H),3.59-3.54(m,2H),3.30-3.27(m,1H),2.86-2.72(m,4H),2.72-2.65(m,1H),1.87-1.81(m,1H)。實施例8(2R,3S,5R)-2-(2,5-二氟苯基)-5-(1-甲基-2-(1-甲基-1H-四唑-5-基)吡咯[3,4-d]咪唑-5(1H,4H,6H)-基)四氫-2H-吡喃-3-胺-富馬酸鹽(化合物7)(2R,3S,5R)-2-(2,5-difluorophenyl)-5-(1-methyl-2-(1-methyl-1H-tetrazol-5-yl)pyrrolo[3,4-d]imidazol-5(1H,4H,6H)-yl)tetrahydro-2H-pyran-3-aminefumarate室溫下，將1l(2.5g,6mmol)溶于乙酸乙酯(80mL)中，加入反應瓶，將富馬酸(0.696g,6mmol)溶于甲醇(20mL)中，滴加到上述反應液，滴加完畢室溫下反應2小時。反應液中有白色固體析出，抽濾，濾餅用乙酸乙酯(10mL×3)、甲基叔丁基醚(10mL)洗滌，真空干燥，得到白色固體產(chǎn)物化合物7(2.3g,產(chǎn)率72％，HPLC純度99.62％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.31-7.23(m,3H),6.54(s,2H),4.34(m,4H),4.18-4.15(m,1H),3.99-3.98(m,5H),3.85(m,2H),3.33(t,1H),3.17-3.12(m,1H),3.05-3.00(m,1H),2.45(m,1H),1.60-1.52(m,1H)。實施例9化合物1重結(jié)晶將化合物1(53g,0.108mol)、去離子水(53mL)和無水乙醇(106mL)依次加入反應瓶中，加畢升溫至80℃，待固體溶解完全，加入活性炭(5.3g)，加畢，80℃下攪拌30分鐘，趁熱過濾，濾餅用熱無水乙醇(26.5mL)洗滌。合并濾液，將醋酸異丙酯(344.5mL)滴加到濾液中，自然冷卻至室溫，析出白色固體，繼續(xù)攪拌3小時，過濾，濾餅用醋酸異丙酯(60mL×2)洗滌，抽干，真空干燥(80℃，16小時)，得到精制后的化合物1(45g,收率84.9％)。重結(jié)晶后化合物1晶型沒有發(fā)生改變，重結(jié)晶前與重結(jié)晶后通過XRD圖譜對比晶型一致。重結(jié)晶前XRD圖譜為圖8。重結(jié)晶前XRD圖譜為圖9。實施例10溶解度研究樣品：化合物1(由表4中序號1條件得到)、化合物1l。實驗：取2mL生理鹽水和2mL0.5％CMC-Na溶液分別加入于BD離心管中，逐次加入樣品，每次加入樣品后在37℃水浴中加熱并強力振搖或超聲。待加入一定量樣品后溶液變渾濁，在37℃水浴中加熱30分鐘并強力振搖或超聲也不能使渾濁現(xiàn)象消失。實驗結(jié)果見表5。表5溶解度結(jié)論：化合物1相對于化合物1l在生理鹽水和0.5％CMC-Na溶液中的溶解度均顯著提高。實施例11穩(wěn)定性研究樣品：化合物1l、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6和化合物7。實驗：取化合物1l、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7分別在高溫(40℃和60℃)、高濕(RH75％和RH92.50％)、光照(5500±500lx)條件下進行試驗，0天、10天、12天、14天、20天或30天的HPLC檢測純度(百分數(shù)表示)，檢測條件及實驗結(jié)果見表6～9。HPLC檢測純度條件為：色譜柱：XselectCSHC18(4.6×150mm,3.5um)；柱溫：35℃；檢測波長：275nm；流動相：按表3進行梯度洗脫；流速1.0mL/min；其中A相為10mmol/L磷酸氫二鉀(pH＝10.95)，B相為甲醇。表6HPLC流動相T(min)0.014.0014.0020.0026.0030.0030.0137.00A(％)7070404010107070B(％)3030606090903030表7化合物1與化合物1l的穩(wěn)定性對比表8化合物1的穩(wěn)定性表9化合物2-7的穩(wěn)定性結(jié)論：化合物1無論在高溫、高濕還是光照條件下，10天后純度基本沒有變化，相比其游離堿化合物1l，穩(wěn)定性明顯提高。同時，化合物1在高溫、高濕還是光照條件下，12天或30天后純度基本沒有變化，穩(wěn)定性良好。化合物2、化合物3無論在高溫、高濕還是光照條件下，14天或20天后純度基本沒有變化，穩(wěn)定性良好。實施例12DPP-IV體外酶活測定利用重組人DPP-IV和H-Ala-Pro-AFC的酶學反應測定本發(fā)明化合物的DPP-IV體外酶活。按照DPP-IVFluorescentActivityAssayKit(BPSBioscience)配制緩沖液、待測樣品工作液、DPP-IV酶稀釋液和AFC底物稀釋液。準備96孔板，每孔先加入80μL緩沖液，之后加入5μLDPP-AFC-底物。再加入不同濃度待測樣工作液，每孔5μL，空白組加入5μL緩沖液。最后在測試組對照中加入10μLDPP-IV酶，空白對照組中加入10μL緩沖液。用Origin7.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，得到各測試化合物的IC50值，實驗結(jié)果見表10。表10DPP-IV體外酶活測定結(jié)果序號化合物編號IC50(nM)1化合物11.372化合物22.023化合物32.114化合物42.225化合物51.806化合物61.577化合物71.90結(jié)論：本發(fā)明化合物具有明顯的DPP-IV酶的抑制活性。當前第1頁1 2 3