生長相關(guān)蛋白grp3在調(diào)控植物生長中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了生長相關(guān)蛋白GRP3在調(diào)控植物生長中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的生長相關(guān)蛋白GRP3為a)或b)：a)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列5的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同蛋白功能的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，生長相關(guān)蛋白GRP3及其編碼基因能促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長和生殖生長，可以利用生長相關(guān)蛋白GRP3及其編碼基因調(diào)控植物的營養(yǎng)生長和生殖生長或培育轉(zhuǎn)基因植物。
【專利說明】
生長相關(guān)蛋白GRP3在調(diào)控植物生長中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中生長相關(guān)蛋白GRP3在調(diào)控植物生長中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 倒伏問題和光周期反應(yīng)敏感一直是困擾植物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要問題。倒伏發(fā)生在植 物的生殖生長時減產(chǎn)率會更高。不同緯度地區(qū)間引種會因日照長度的變化導(dǎo)致植物的開花 期、成熟期提前或延遲，均會造成植物的產(chǎn)量下降。因此，迫切需要采用分子育種手段，通過 外源基因的引入或?qū)?nèi)在基因的遺傳操作，定向調(diào)節(jié)植物的株型和光周期反應(yīng)敏感性，加 快抗倒伏和廣適應(yīng)植物的選育進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何促進(jìn)植物的生長。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了名稱為GRP3的蛋白質(zhì)。
[0005] 本發(fā)明所提供的GRP3為如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0006] a)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白質(zhì)；
[0007] b)將序列表中序列5的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的與植物生長相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0008] 其中，序列5由474個氨基酸組成。
[0009] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或 羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0010] 表1、標(biāo)簽的序列
[0011]
[0012] 上述b)中的GRP3可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上 述b)中的GRP3的編碼基因可通過將序列表中序列6所示的DNA序列中缺失一個或幾個 氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或 3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與GRP3相關(guān)的生物材料。
[0014] 本發(fā)明所提供的與GRP3相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種：
[0015] A1)編碼所述GRP3的核酸分子；
[0016] A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0017] A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；
[0018] A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0019] A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；
[0020] A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0021] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0022] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0023] A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0024] A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0025] All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0026] A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0027] A13)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0028] A14)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0029] A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0030] A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0031] A17)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0032] A18)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0033] A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0034] A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。
[0035] 上述生物材料中，A1)所述核酸分子為如下al)或a2)或a3)所示的基因：
[0036] al)核苷酸序列是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子；
[0037] a2)與al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一'丨生，且編碼氨基酸序列為 序列5的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0038] a3)在嚴(yán)格條件下與al)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為序列5的蛋 白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。
[0039] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也 可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0040] 其中，序列6由1425個核苷酸組成，編碼序列5所示的氨基酸序列。
[0041] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對本發(fā)明的編碼GRP3的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的GRP3的核苷酸序列55%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GRP3且具有GRP3功 能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0042] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本 發(fā)明的編碼序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高，或85% 或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī) 軟件進(jìn)行評價。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％)表示， 其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0043] 上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交 并洗膜2次，每次5min，又于0. 5 X SSC，0. 1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次，每 次15min ;或，0· 1XSSPE (或0· 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0044] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0045] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼GRP3的核酸分子的表達(dá)盒（GRP3基因表 達(dá)盒），是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)GRP3的DNA，該DNA不但可包括啟動GRP3基因轉(zhuǎn)錄 的啟動子，還可包括終止GRP3基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子 序列。可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟 動子，和誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子 35S :來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP"，Chao等人（1999) Plant Physiol 120:979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸 和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯）誘導(dǎo)）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子（PIN2) 或LAP啟動子（均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)）；熱休克啟動子（美國專利5,187,267);四環(huán) 素誘導(dǎo)型啟動子（美國專利5,057, 422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子 pF128 (CN101063139B (中國專利200710099169. 7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子（例如， 菜豆球蛋白、napin，oleosin 和大豆 beta conglycin 的啟動子（Beachy 等人（1985)EMB0 J.4 :3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參 考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子（N0S 終止子）、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸 和章魚氨酸合酶終止子（參見，例如：0dell等人（I985)Nature 313:810 ;Rosenberg等人 (1987)Gene，56:125;Guerineau 等人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141 ;Proudfoot(1991) Cell, 64:671 ;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141 ;Mogen 等人（1990)Plant Cell, 2:1261 ; Munroe 等人（1990)Gene, 91:151 ;Ballad 等人（1989)Nucleic Acids Res. 17:7891 ;Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0046] 可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述GRP3基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物 表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如PAHC25、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA139卜Xa 或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的Υ端非翻譯 區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷 酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)?；颍ㄈ?胭脂堿合成酶基因 Nos)、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類 似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼 序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源 是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基 因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工， 如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、螢光 素酶基因等）、抗生素的標(biāo)記基因（如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦 予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲 喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等（如 抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全 性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0047] 上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。
[0048] 上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。
[0049] 上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均 不包括繁殖材料。
[0050] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，GRP3的編碼基因（即序列6所示的DNA分子）通過 含有GRP3的編碼基因的表達(dá)盒的重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中。所述重組載體為用 序列6所示的DNA分子替換pTFlOl. 1-GFP的Xbal I和Sac I識別序列間的片段得到的重 組載體 pTFlOl. l-GRP3，pTF101. 1-GRP3 表達(dá)序列 5 所示的 GRP3 蛋白。所述 pTFlOl. 1-GRP3 與pTFlOl. 1-GFP的差別僅在于將pTFlOl. 1-GFP的Xbal I和Sac I識別序列間的DNA替 換為序列6所示的DNA分子。
[0051] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)、或所述生物材料在調(diào)控植物 生長中的應(yīng)用。
[0052] 上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為十字 花科植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0053] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了 一種培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0054] 本發(fā)明所提供的一種培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入 所述GRP3的編碼基因得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比生長 增加。
[0055] 上述培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述GRP3的編碼基因的編碼序列是 序列表中序列6的DNA分子。
[0056] 上述培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植 物。所述雙子葉植物可為十字花科植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0057] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述GRP3的編碼基因（即序列6所示的DNA分子）通過含 有GRP3基因表達(dá)盒的GRP3基因重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中。
[0058] 上述培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法中，其中所述GRP3基因可先進(jìn)行如下修 飾，再導(dǎo)入受體種子植物中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果：
[0059] 1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所 偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述GRP3基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合植 物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí) 現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約 60% ；
[0060] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中 已知的有效的序列進(jìn)行修飾；
[0061] 3)與各種植物表達(dá)的啟動子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動子可包括 組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的 選擇將隨著表達(dá)時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達(dá)啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多 啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于 雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達(dá)；
[0062] 4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達(dá)效率；例如來源于 CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā) 明基因進(jìn)行連接；
[0063] 5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列（例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序 列（例如來源于TMV, MCMV和AMV)。
[0064] 所述GRP3基因重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒栽體，直接DNA轉(zhuǎn) 化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞（Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press, New York, pp. 411-463 ；Geiserson and Corey，1998,Plant Molecular Biology (2nd Edition)·)。
[0065] 上述培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所 述GRP3基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可 以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種， 特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。
[0066] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了擴(kuò)增編碼所述GRP3的核酸分子全長或其 片段的引物對。
[0067] 本發(fā)明中，所述生長具體可為營養(yǎng)生長和/或生殖生長。所述營養(yǎng)生長可為根系 的生長、莖的生長、葉的生長和/或果莢的生長。所述根系的生長具體可體現(xiàn)在根長和/或 側(cè)根數(shù)量上，所述莖的生長具體可體現(xiàn)在株高上，果莢的生長具體可體現(xiàn)在果莢的長度上。 所述植物為種子植物，所述生殖生長可體現(xiàn)在開花時間和/或果莢的長度上。
[0068] 在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述調(diào)控植物生長為促進(jìn)擬南芥生長。所述植物生長 體現(xiàn)在所述植物株高的增加、所述植物總根長的增加、和/或所述植物側(cè)根數(shù)目的增加、所 述植物開花時間的縮短、所述植物果莢長度的增加。
[0069] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的生長相關(guān)蛋白GRP3及其編碼基因能促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長：轉(zhuǎn) GRP3基因植株的株高為受體植株的8. 69倍，總根長為受體植株的2. 67倍，側(cè)根數(shù)目為受 體植株的2. 33倍。本發(fā)明的生長相關(guān)蛋白GRP3及其編碼基因能促進(jìn)植物的生殖生長：轉(zhuǎn) GRP3基因植株的開花時間為受體植株的0. 69倍，果莢長度為受體植株的4. 09倍。實(shí)驗(yàn)證 明，可以利用本發(fā)明的生長相關(guān)蛋白GRP3及其編碼基因調(diào)控植物的營養(yǎng)生長和生殖生長 或培育轉(zhuǎn)基因植物。
【附圖說明】
[0070] 圖 1 為重組載體 pTFlOl. 1-GRP1、pTFlOl. 1-GRP2、pTFlOl. 1-GRP3 和 pTFlOl. 1-GRP4示意圖。其中，圖A為重組載體pTFlOl. 1-GRP1示意圖，圖B為重組載 體pTFlOl. 1-GRP2示意圖，圖C為重組載體pTFlOl. 1-GRP3示意圖，圖D為重組載體 pTFlOl. 1-GRP4 示意圖。
[0071] 圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在基因組水平上的鑒定結(jié)果。其中，圖A為轉(zhuǎn)GRP1基 因擬南芥植株中GRP1基因的鑒定結(jié)果，泳道Μ為Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (M121)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為水，泳道2為擬南芥cpd，泳道3-5為T3代轉(zhuǎn) GRP1基因擬南芥植株的三個株系；圖Β為轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株中GRP2基因的鑒定結(jié)果， 泳道 Μ 為 Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (Μ121)的 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道 1為水，泳道2為擬南芥cpd，泳道3和4為T3代轉(zhuǎn)GRP2基因轉(zhuǎn)基因植株的兩個株系；圖C 為轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株中GRP3基因的鑒定結(jié)果，泳道Μ為Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (M121)的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為水，泳道2為擬南芥cpd，泳道3-5 為T3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株的三個株系；圖D為轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株中GRP4基因 的鑒定結(jié)果，泳道 Μ 為 Direct-load? Star Marker Plus (D2000 Plus) (Μ121)的 DNA 分子 量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為水，泳道2為擬南芥cpd，泳道3-5為T3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株的三個 株系。
[0072] 圖3為利用半定量PCR鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的目的基因的表達(dá)。其中，圖A 為轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株中GRP1基因的表達(dá)檢測結(jié)果，從左至右的泳道依次為水，擬南芥 cpd，T3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株；圖B為轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株中GRP2基因的表達(dá)檢測 結(jié)果，從左至右的泳道依次為水，擬南芥cpd，Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株；圖C為轉(zhuǎn)GRP3 基因擬南芥植株中GRP3基因的表達(dá)檢測結(jié)果，從左至右的泳道依次為水，擬南芥cpd，1~ 3代 轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株；圖D為轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株中GRP4基因的表達(dá)檢測結(jié)果，從 左至右的泳道依次為水，擬南芥cpd，T 3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株。
[0073] 圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型檢測結(jié)果。其中，Α為轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株的 表型，B為轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株的表型，C為轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株的表型，D為轉(zhuǎn)GRP4 基因擬南芥植株的表型。
【具體實(shí)施方式】
[0074] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0075] 下述實(shí)施例中的載體pTFlOl. 1為美國愛荷華州立大學(xué)王侃實(shí)驗(yàn)室饋贈 ，（Margie M. Paz,Juan Carlos Martinezm, Andrea B.Kalvig, Tina M.Fonger, Kan Wang. (2006) Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation. Plant Cell Reports. Plant Cell Reports 25:206-213)，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研 究所（即
【申請人】）獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使 用。
[0076] 下述實(shí)施例中的擬南芥cpd突變體（Szekeres M，Nemeth K，KonczKalman Z，Mathur J，Kauschmann A，et al. (1996)Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP90, a cytochrome P450, controlling cell elongation and de-etiolation in arabidopsis. Cell 85:171-182.)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所（即
【申請人】） 獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。擬南芥cpd突 變體以下簡稱擬南芥cpd。
[0077] 實(shí)施例1、利用生長相關(guān)蛋白基因培育生長增加的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物
[0078] 本實(shí)施例提供了四個來源于大豆 Williams 82 (Haun，W. J.，Hyten，D. L.，Xu，W. ff. , Gerhardt, D. J. , Albert, T. J. , Richmond, T. , Jeddeloh, J. A. , Jia, G. F. , Springer, N. M. , Vance, C. P. &Stupar,R.M. (2011). The Composition and Origins of Genomic Variation among Individuals of the Soybean Reference Cultivar Williams 82. Plant Physiology 155,645-655.國家種質(zhì)庫編號：I2A12645,統(tǒng)一編號：WDD00587)的生長相關(guān) 蛋白基因，分別是生長相關(guān)蛋白GRP1基因、生長相關(guān)蛋白GRP2基因、生長相關(guān)蛋白GRP3基 因和生長相關(guān)蛋白GRP4基因。
[0079] 制備序列表中序列2所不的DNA分子（即生長相關(guān)蛋白GRP1基因，簡稱GRP1基 因），序列2所示的DNA分子編碼序列1所示的蛋白質(zhì)（即生長相關(guān)蛋白GRP1，簡稱GRP1 蛋白）。
[0080] 制備序列表中序列4所不的DNA分子（即生長相關(guān)蛋白GRP2基因，簡稱GRP2基 因），序列4所不的DNA分子編碼序列3所不的蛋白質(zhì)（即生長相關(guān)蛋白GRP2,簡稱GRP2 蛋白）。
[0081] 制備序列表中序列6所不的DNA分子（即生長相關(guān)蛋白GRP3基因，fg]稱GRP3基 因），序列6所不的DNA分子編碼序列5所不的蛋白質(zhì)（即生長相關(guān)蛋白GRP3,簡稱GRP3 蛋白）。
[0082] 制備序列表中序列8所不的DNA分子（即生長相關(guān)蛋白GRP4基因，fil]稱GRP4基 因），序列8所不的DNA分子編碼序列7所不的蛋白質(zhì)（即生長相關(guān)蛋白GRP4,簡稱GRP4 蛋白）。
[0083] 1、重組載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建
[0084] 載體pTFlOL 1-GFP的制備：將載體pTFlOL 1的Hind III和EcoR I識別序列 間的片段替換為序列9所示的DNA分子（即GFP表達(dá)盒）得到重組載體pTFlOl. 1-GFP， pTFlOL 1-GFP與pTFlOL 1的差別僅在于將pTFlOL 1的Hind III和EcoR I識別序列間的 DNA替換為序列9所示的DNA分子。序列9所示的GFP表達(dá)盒中，序列9的第25-859位核 苷酸為35S啟動子的序列，序列9的第880-1596位核苷酸為GFP基因的序列，序列9的第 1640-1894位核苷酸為N0S終止子的序列。
[0085] 將pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的片段替換為GRP1基因（即序列 2所示的DNA分子）得到重組載體pTFlOL 1-GRP1 (圖1中A)，pTFlOL 1-GRP1表達(dá)序列1 所示的GRP1 蛋白，pTFlOl. 1-GRP1 與 pTFlOl. 1-GFP 的差別僅在于將pTFlOl. 1-GFP 的 Xba I 和Sac I識別序列間的DNA替換為序列2所示的DNA分子。將重組載體pTFlOl. 1-GRP1導(dǎo) 入根癌農(nóng)桿菌GV3101 (天根生化科技有限公司產(chǎn)品）中，得到含有重組載體pTFlOl. 1-GRP1 的重組農(nóng)桿菌 GV3101/pTF101. 1-GRP1。
[0086] 將pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的片段替換為GRP2基因（即序列 4所示的DNA分子）得到重組載體pTFlOl. 1-GRP2 (圖1中B)，pTFlOl. 1-GRP2表達(dá)序列3 所示的GRP2蛋白，pTFlOL 1-GRP2與pTFlOL 1-GFP的差別僅在于將pTFlOL 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的DNA替換為序列4所示的DNA分子。將重組載體pTFlOl. 1-GRP2 導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，得到含有重組載體pTFlOl. 1-GRP2的重組農(nóng)桿菌GV3101/ pTFlOl. 1-GRP2。
[0087] 將pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的片段替換為GRP3基因（即序列 6所示的DNA分子）得到重組載體pTFlOL 1-GRP3 (圖1中C)，pTFlOL 1-GRP3表達(dá)序列5 所示的GRP3蛋白，pTFlOL 1-GRP3與pTFlOL 1-GFP的差別僅在于將pTFlOL 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的DNA替換為序列6所示的DNA分子。將重組載體pTFlOl. 1-GRP3 導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，得到含有重組載體pTFlOl. 1-GRP3的重組農(nóng)桿菌GV3101/ pTFlOl. 1-GRP3。
[0088] 將pTFlOl. 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的片段替換為GRP4基因（即序列 8所示的DNA分子）得到重組載體pTFlOL 1-GRP4(圖1中D)，pTFlOL 1-GRP4表達(dá)序列7 所示的GRP4蛋白，pTFlOL 1-GRP4與pTFlOL 1-GFP的差別僅在于將pTFlOL 1-GFP的Xba I和Sac I識別序列間的DNA替換為序列8所示的DNA分子。將重組載體pTFlOl. 1-GRP4 導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中，得到含有重組載體pTFlOl. 1-GRP4的重組農(nóng)桿菌GV3101/ pTFlOl. 1-GRP4。
[0089] 2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建
[0090] 將步驟1的重組農(nóng)桿菌GV3101/pTF101. 1-GRP1接種于含有抗生素的LB培養(yǎng)基 (該含有抗生素的LB培養(yǎng)基為向LB培養(yǎng)基中加入壯觀霉素、卡那霉素、氯霉素和利福平得 到的液體培養(yǎng)基，其中，壯觀霉素的濃度為50mg/L，卡那霉素的濃度為50mg/L，氯霉素的濃 度為25mg/L，利福平的濃度為20mg/L)上，于28°C下250rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6。。值為0· 6-0. 8， 收集菌液置于離心管中，于5000rpm下離心5min并收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體， 得到 GV3101/pTF101. 1-GRP1 懸浮液，GV3101/pTF101. 1-GRP1 懸浮液的 0D6。。值約為 0. 6,向 GV3101/pTF101. 1-GRP1懸浮液中加入Silwet L-77(北京五洲元業(yè)科貿(mào)公司產(chǎn)品，貨號為 SL77080596)，得到 GV3101/pTF101. 1-GRP1 侵染液。
[0091] 米用沾花浸染法（Clough SJ, Bent AF(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journal 16:735-743.)用 GV3101/pTF101. 1-GRP1 侵染液轉(zhuǎn)化擬南芥 cpd 收獲 1\代轉(zhuǎn) GRP1 基因種子。將代轉(zhuǎn)GRP1基因種子在含Bastar (日本明治公司）的MS培養(yǎng)基（Bastar 在MS培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L)上進(jìn)行篩選，得到?\代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥幼苗。將T 1 代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥幼苗在溫度為22°C、光周期為16h光照和8h黑暗的長日照人工氣候 室中進(jìn)行培養(yǎng)，得到T 2代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥種子。將T 2代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥種子在含 Bastar (日本明治公司）的MS培養(yǎng)基（Bastar在MS培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L)上進(jìn)行篩 選，得到T2代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥幼苗。將T 2代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥幼苗在溫度為22°C、光 周期為16h光照和8h黑暗的長日照人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，得到T 3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥 種子。
[0092] 按照上述方法，將上述重組農(nóng)桿菌GV3101/pTF101. 1-GRP1分別替換為重組農(nóng)桿 菌 GV3101/pTF101. 1-GRP2、重組農(nóng)桿菌 GV3101/pTF101. 1-GRP3 和重組農(nóng)桿菌 GV3101/ pTFlOl. 1-GRP4,其他步驟均不變，分別得到T3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥種子、T 3代轉(zhuǎn)GRP3基 因擬南芥種子和Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥種子。
[0093] 將Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥種子、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥種子、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP3基 因擬南芥種子、Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥種子和擬南芥cpd種子播種到培養(yǎng)土中，在溫度為 22°C、光周期為16h光照和8h黑暗的長日照人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，分別得到T 3代轉(zhuǎn)GRP1 基因擬南芥植株、Τ3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP4 基因擬南芥植株和擬南芥cpd植株。
[0094] 3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定
[0095] 3. 1、在基因組水平上鑒定步驟2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，具體方法如下：
[0096] 以步驟2的擬南芥cpd植株和水為對照，分別鑒定步驟2的T3代轉(zhuǎn)GRP1基因 擬南芥植株的3個株系（1-1U-2和1-3)、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株2個株系（2-1 和2-2)、T3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株3個株系（3-1、3-2和3-3)和T 3代轉(zhuǎn)GRP4基因 擬南芥植株3個株系（4-1、4-2和4-3)。鑒定Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株的引物對為： ATGGCATCTTTCATCATCATACCAC 和 TCATGGCGATTTACTTAGTCTGGAC。鑒定 Τ3代轉(zhuǎn) GRP2 基因 擬南芥植株的引物對為：ATGGCATCTTTCATCTTCACACCTG 和 TCATGGCGATTTACTTAGTTTGGAC。 鑒定Τ3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株的引物對為：ATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGCCAA和 CTAGTCTCTACGCTGCACAATAATT。鑒定T3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株的引物對為： ATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCT 和 CTAATGTCTACGCTGCACAATAATA。
[0097] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2,結(jié)果表明，步驟2的Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株三個株系的PCR 產(chǎn)物中均有大小為1437bp的目的條帶（圖2中Α泳道3、4和5)，而對照中無目的條帶（圖 2中A泳道1和2)，說明步驟2的T 3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株中均含有GRP1基因；步驟 2的Τ3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株的兩個株系PCR產(chǎn)物中均有大小為1440bp的目的條帶 (圖2中B泳道3和4)，而對照中無目的條帶（圖2中B泳道1和2)，說明步驟2的1~ 3代 轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株中均含有GRP2基因；步驟2的T3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株的三 個株系PCR產(chǎn)物中均有大小為1425bp的目的條帶（圖2中C泳道3、4和5)，而對照中無目 的條帶（圖2中C泳道1和2)，說明步驟2的T 3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株中均含有GRP3 基因；步驟2的Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株的三個株系PCR產(chǎn)物中均有大小為1419bp的 目的條帶（圖2中D泳道3、4和5)，而對照中無目的條帶（圖2中D泳道1和2)，說明步 驟2的T 3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株中均含有GRP4基因。
[0098] 3. 2、利用半定量PCR鑒定步驟2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的目的基因的表達(dá)，具體 方法如下：
[0099] 以步驟2的擬南芥cpd植株和水為對照，分別鑒定步驟2的Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南 芥植株株系1-1、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株株系2-1、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株株系 3-1和Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株株系4-1中目的基因的表達(dá)，內(nèi)參為擬南芥的ACTIN2， 內(nèi)參的引物為 actctcccgctatgtatgtcgc 和 agaaaccctcgtagattggcac。鑒定 Τ3代轉(zhuǎn) GRP1 基因擬南芥植株的引物對為：GCATCTTTCATCATCATACCACTCC 和 CAACAAAGGGGAGTCCGAGC。 鑒定T3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株的引物對為：ATGGCATCTTTCATCTTCACACCTG 和CGAAGGGGAGCCCGAGTGTAC。鑒定T3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株的引物對為： ATGGCTTCTTTGCCAGCTTTGC 和 CGGCGGAGGAAGAGGAGGAG。鑒定 Τ3代轉(zhuǎn) GRP4 基因擬南芥植株 的引物對為：ATGGCTTCTTTGCCAACACTTCTCT 和 GAACACGCGGCGGAGGTATAAG。
[0100] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3,結(jié)果表明，步驟2的T3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株株系1-1的PCR 產(chǎn)物中含有目的條帶（圖3中Α泳道左3)，而對照中無目的條帶（圖3中Α泳道左1和左 2)，說明步驟2的T3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株株系1-1中有GRP1基因的表達(dá)；步驟2的 Τ3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株株系2-1的PCR產(chǎn)物中含有目的條帶（圖3中Β泳道左3)，而 對照中無目的條帶（圖3中Β泳道左1和左2)，說明步驟2的Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植 株株系2-1中有GRP2基因的表達(dá)；步驟2的Τ3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株株系3-1的PCR 產(chǎn)物中含有目的條帶（圖3中C泳道左3)，而對照中無目的條帶（圖3中C泳道左1和左 2)，說明步驟2的Τ3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株株系3-1中有GRP3基因的表達(dá)；步驟2的 Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株株系4-1的PCR產(chǎn)物中含有目的條帶（圖3中D泳道左3)， 而對照中無目的條帶（圖3中D泳道左1和左2)，說明步驟2的Τ 3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥 植株株系4-1中有GRP4基因的表達(dá)。
[0101] 4、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型檢測
[0102] 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的具體步驟如下：
[0103] 將步驟2的T3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥三個株系的種子播種到培養(yǎng)土中，每個株系 隨機(jī)選取20株生長至13天的擬南芥植株，對各擬南芥植株的總根長和側(cè)根數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 得到Τ 3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥的總根長和側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0104] 按照上述方法，將Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥三個株系替換為Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南 芥兩個株系、Τ3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥三個株系、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥三個株系和擬南 芥cpd，其他步驟均不變，分別得到Τ3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥的總根長和側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果、 Τ3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥的總根長和側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥的總根長 和側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果和擬南芥cpd的總根長和側(cè)根數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0105] 將步驟2的T3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥三個株系的種子播種到培養(yǎng)土中，每個株系隨 機(jī)選取20株生長至55天的擬南芥植株，對各擬南芥植株的株高和果莢長度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到 Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥的株高和果莢長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果，同時對各個擬南芥植株從萌發(fā)到初花 的天數(shù)（即開花時間）也進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到Τ 3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥的開花時間。
[0106] 按照上述方法，將Τ3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥三個株系替換為Τ 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南 芥兩個株系、Τ3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥三個株系、Τ 3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥三個株系和擬南芥 cpd，其他步驟均不變，分別得到Τ3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥的株高、果莢長度和開花時間的統(tǒng) 計(jì)結(jié)果，Τ 3代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥的株高、果莢長度和開花時間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，Τ 3代轉(zhuǎn)GRP4基 因擬南芥的株高、果莢長度和開花時間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果和擬南芥cpd的株高、果莢長度和開花 時間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0107] T3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株株系1-1、T 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株株系2-1、T 3 代轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株株系3-1、Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株株系4-1和擬南芥cpd植 株的表型如圖4所示。T 3代轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株、T 3代轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株、T 3代 轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株、Τ3代轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株和擬南芥cpd植株的株高、總根長、 側(cè)根數(shù)目、開花時間和果莢長度如表2所示。
[0108] 表2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型
[0111] 結(jié)果表明，生長相關(guān)蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其對應(yīng)的編碼基因均能促進(jìn) 擬南芥的營養(yǎng)生長：轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株的株高為擬南芥cpd的5. 53倍，總根長為擬南 芥cpd的3. 78倍，側(cè)根數(shù)目為擬南芥cpd的5. 33倍；轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株的株高為擬 南芥cpd的8. 09倍，總根長為擬南芥cpd的3. 18倍，側(cè)根數(shù)目為擬南芥cpd的3. 00倍；轉(zhuǎn) GRP3基因擬南芥植株的株高為擬南芥cpd的8. 69倍，總根長為擬南芥cpd的2. 67倍，側(cè)根 數(shù)目為擬南芥cpd的2. 33倍；轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株的株高為擬南芥cpd的5. 48倍，總 根長為擬南芥cpd的3. 58倍，側(cè)根數(shù)目為擬南芥cpd的4. 00倍。
[0112] 生長相關(guān)蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其對應(yīng)的編碼基因均能促進(jìn)擬南芥的 生殖生長：轉(zhuǎn)GRP1基因擬南芥植株的開花時間為擬南芥cpd的0. 79倍，果莢長度為擬南芥 cpd的3. 22倍；轉(zhuǎn)GRP2基因擬南芥植株的開花時間為擬南芥cpd的0. 71倍，果莢長度為擬 南芥cpd的4. 04倍；轉(zhuǎn)GRP3基因擬南芥植株的開花時間為為擬南芥cpd的0. 69倍，果莢 長度為擬南芥cpd的4. 09倍；轉(zhuǎn)GRP4基因擬南芥植株的開花時間為為擬南芥cpd的0. 73 倍，果莢長度為擬南芥cpd的4. 04倍。
[0113] 實(shí)驗(yàn)證明，生長相關(guān)蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其對應(yīng)的編碼基因均能促進(jìn) 植物的營養(yǎng)生長和生殖生長，可以利用生長相關(guān)蛋白GRP1、GRP2、GRP3和GRP4及其對應(yīng)的 編碼基因調(diào)控植物的營養(yǎng)生長和生殖生長或培育轉(zhuǎn)基因植物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白質(zhì)； b) 將序列表中序列5的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的與植物生長相關(guān)的蛋白質(zhì)。2. 與權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種： A1)編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子； A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒； A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體； A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體； A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物； A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物； A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物； A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物； A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； A13)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織； A14)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物組織； A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； A17)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官； A18)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物器官； A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官； A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子為如下al)或a2) 或a3)所示的基因： al)核苷酸序列是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子； a2)與al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼氨基酸序列為序列 5的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子； a3)在嚴(yán)格條件下與al)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為序列5的蛋白質(zhì) 的cDNA分子或基因組DNA分子。4. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)、或權(quán)利要求2或3所述生物材料在調(diào)控植物生長中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。6. -種培育生長增加的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入權(quán)利要求1所述蛋 白質(zhì)的編碼基因得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比生長增加。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因的編 碼序列是序列表中序列6的DNA分子。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物為單子葉植物或雙子葉植 物。9. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用、或權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于： 所述生長為營養(yǎng)生長和/或生殖生長。10. 擴(kuò)增編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子全長或其片段的引物對。
【文檔編號】C07K14/415GK105985420SQ201510050601
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】王妙, 韓天富, 孫 石, 武婷婷, 吳存祥, 蔣炳軍, 侯文勝
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所