可拆分外消旋胺制備手性胺的轉(zhuǎn)氨酶及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種可拆分外消旋胺制備手性胺的轉(zhuǎn)氨酶及其編碼基因與應(yīng)用。轉(zhuǎn)氨酶是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轉(zhuǎn)氨酶的基因是如SEQ ID NO.2所示的堿基序列。采用本發(fā)明所述轉(zhuǎn)氨酶作為催化劑來拆分外消旋胺，與化學法相比，有著高的選擇性和轉(zhuǎn)化率，且反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境無污染，對于醫(yī)藥及化工領(lǐng)域手性胺的高效、綠色合成具有重大意義。
【專利說明】
可拆分外消旋胺制備手性胺的轉(zhuǎn)氨酶及其編碼基因與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種轉(zhuǎn)氨酶應(yīng)用于拆分外消旋胺制備手 性胺的方法。該酶能利用外消旋胺作為氨基供體，丙酮酸作為氨基受體，在PLP存在下，將外 消旋胺中一個對映體完全轉(zhuǎn)化為酮，剩下另一個未反應(yīng)的對映體，同時生成副產(chǎn)物丙氨酸。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性胺類化合物是一類重要的藥物合成中間體。近年來，手性制藥工業(yè)迅速發(fā)展 壯大，單一對映體藥物每年以大于20%的速度增長，其對手性胺的需求也隨之增長。目前， 超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，如神經(jīng)類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感 染藥物及疫苗等的合成都是以手性胺作為中間體。因此，找到一種高效制備手性胺的方法 迫在眉睫。制備手性胺的方法主要有兩種:化學法和生物法?；瘜W法主要通過化學拆分和化 學合成來制備手性胺，化學拆分法是利用手性胺中的氨基(拆分基團）與純的旋光化合物 (拆分劑)發(fā)生反應(yīng)從而把一對對映體分成兩個非對映體，產(chǎn)生物理性質(zhì)上的差異，用蒸餾、 結(jié)晶、色譜分離等常規(guī)的方法將其分離。化學合成法是在手性助劑的幫助下，將底物在一定 的條件下反應(yīng)轉(zhuǎn)化為手性胺。
[0003] 雖然化學的方法生產(chǎn)手性胺類化合物的工藝已經(jīng)比較成熟，但是操作過程復(fù)雜 (如手性拆分R，S-苯乙胺時，可能需要反復(fù)的重結(jié)晶)或是需要特殊的手性助劑幫助并且產(chǎn) 物的e. e.值并不高，同時也易對環(huán)境造成嚴重污染。
[0004] 生物法是主要利用轉(zhuǎn)氨酶作為生物催化劑促使化學反應(yīng)的進行，將底物轉(zhuǎn)化為手 性胺的過程。轉(zhuǎn)氨酶(4111；[1101^3118€6抑86 8,418)是依賴5-磷酸[1比咳醛(？1^>)的一種酶，它在 細胞的氮代謝過程中有著重要的氨基轉(zhuǎn)移作用，并且廣泛存在于大自然中。轉(zhuǎn)氨酶催化的 轉(zhuǎn)氨反應(yīng)由兩步反應(yīng)組成，第一步反應(yīng)是轉(zhuǎn)醛亞胺過程，酶活性位點上賴氨酸殘基上5-磷 酸吡哆醛(PLP)和-NH 2之間的席夫堿被氨基供體和PLP之間的席夫堿所取代形成一個外部 的醛亞胺，釋放出來的賴氨酸殘基成為以后的催化劑，然后是1，3氫轉(zhuǎn)移到從外部醛亞胺去 質(zhì)子化的亞胺，得到酮亞胺中間體，再將酮亞胺中間體水解釋放氧化產(chǎn)物和5-磷酸吡哆胺 (PMP)。第二步反應(yīng)包括氨基受體接受氨基生成相應(yīng)的胺類產(chǎn)品和輔酶再生的過程。
[0005] 生物法以轉(zhuǎn)氨酶為催化劑有著高的選擇性和轉(zhuǎn)化率，且反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境無 污染，對于醫(yī)藥及化工領(lǐng)域手性胺的高效、綠色合成具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種以轉(zhuǎn)氨酶為催化劑的生物法制備手性胺，具體是一種可拆分 外消旋胺制備手性胺的轉(zhuǎn)氨酶及其編碼基因與應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：轉(zhuǎn)氨酶，是如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序 列。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供轉(zhuǎn)氨酶的基因，是如SEQ ID N0.2所示的堿基序列。
[0009] 上述轉(zhuǎn)氨酶的制備步驟為：
[0010] S1:將如SEQ ID NO.2所示的轉(zhuǎn)氨酶的基因插入到質(zhì)粒中得到重組表達載體；
[0011] S2:將所述重組表達載體轉(zhuǎn)移到宿主微生物中得到基因工程菌；
[0012] S3:培養(yǎng)所述基因工程菌得到重組轉(zhuǎn)氨酶，即本發(fā)明所述轉(zhuǎn)氨酶。
[0013] 該轉(zhuǎn)氨酶來源于惡臭假單胞菌Pseudomonas putida，其具有的酶學性質(zhì)為：（a)通 過SDS-PAGE測定的分子量為45-60kDa;(b)酶活最大為3.6U/mg，Km為130.9mM，kcat/km為 0·; (c)與紫色色桿菌Chromobacterium violaceum中獲得的CV2025具有的58% 氨基酸序列同源性。
[0014]本發(fā)明另一目的是提供所述轉(zhuǎn)氨酶或轉(zhuǎn)氨酶的基因在拆分外消旋胺制備手性胺 中的應(yīng)用。具體實施時，該應(yīng)用是在轉(zhuǎn)氨酶、氨基供體、氨基受體以及PLP輔酶存在下，反應(yīng) 體系中底物外消旋胺的其中一個對映體發(fā)生氧化反應(yīng)生成酮，剩下另一個未反應(yīng)的對映 體。外消旋胺的拆分是在pH為5.0~11.0的反應(yīng)體系中實現(xiàn)的。
[0015]優(yōu)選的，外消旋胺的拆分是在4~60°C的反應(yīng)體系中實現(xiàn)的。所述反應(yīng)體系中PLP 輔酶的添加量為〇. 01~1. 〇mM。所述反應(yīng)體系中底物外消旋胺的添加量為5.0~100.0 mM。
[0016]下面以拆分外消旋苯乙胺(底物)為例來解釋本發(fā)明所述應(yīng)用的反應(yīng)過程:在磷酸 緩沖液中，氨基受體丙酮酸和輔酶PLP存在下，底物外消旋苯乙胺被拆分反應(yīng)生成苯乙酮， 剩下未反應(yīng)的R-苯乙胺，同時生產(chǎn)副產(chǎn)物丙氨酸。其轉(zhuǎn)化生成路線如下：
[0018] 式中：PpTA指轉(zhuǎn)氨酶;PLP指5-磷酸吡哆醛。
[0019] 采用本發(fā)明所述轉(zhuǎn)氨酶作為催化劑來拆分外消旋胺，與化學法相比，有著高的選 擇性和轉(zhuǎn)化率，且反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境無污染，對于醫(yī)藥及化工領(lǐng)域手性胺的高效、綠色 合成具有重大意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1為PpTA經(jīng)蛋白純化后聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。
[0021]圖2為PpTA最佳pH研究結(jié)果示意圖。
[0022]圖3為PpTA最適催化溫度的研究結(jié)果示意圖。
[0023]圖4為PpTA溫度穩(wěn)定性的研究結(jié)果示意圖。
[0024]圖5為PpTA在一定酶量下，酶活隨底物濃度變化的研究結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的較佳實施例，并予以詳細描述。
[0026] SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（SK8141)購于生工生物工程(上海)股份有限公 司。SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（SK8192)購于生工生物工程(上海）股份有限公 司；PCR擴增試劑dNTP，Buf f er，Taq酶購于生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性內(nèi)切 酶BamHI、XhoI購于Takara;連接酶和ligation buffer購于SCIENTIFIC;PCR引物購于生工 生物工程(上海)股份有限公司；DNA上樣緩沖液，DNA標準分子量Marker購于生工生物工程 (上海)股份有限公司；蛋白雙染色Marker購于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0027] 下列實施中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0028] 1.在本發(fā)明的下述實施例中，使用的大腸桿菌培養(yǎng)基配制方法如下：
[0029] (1)LB 培養(yǎng)基
[0030] 1L的LB液體培養(yǎng)基中加入10.0g NaCl，10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母浸粉，定容到1L 后，用pH計檢測其pH，一般顯酸性，然后用5mol/L的NaOH慢慢調(diào)節(jié)pH至7.0。若是配置固體培 養(yǎng)基，可在配好的液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按1.5 %的含量加入瓊脂粉。密封好后，用高壓蒸汽 滅菌鍋在121°C下，滅菌30min，待冷卻后放在4 °C低溫冰箱中保存待用。
[0031] (2)TB 培養(yǎng)基
[0032]將下列組分溶解在0.9L水中：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。將各組分溶 解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加入100mL滅過菌的磷酸緩沖液(2.31g的KH2P〇4和12.54g的 K2HPO4溶于 100mL水中。）。
[0033] 2.底物苯乙胺和產(chǎn)物苯乙酮含量的檢測方法:將反應(yīng)液加氯化鈉到飽和，用等體 積含有內(nèi)標(十二烷）乙酸乙酯進行萃取，取有機相用無水硫酸鈉干燥，在氣相色譜儀上進 行分析，在進樣口 250 °C，柱溫120 °C，檢測器250 °C下進行檢測。
[0034]實驗例1轉(zhuǎn)氨酶基因的篩選和分析
[0035] 通過對NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行篩選和分析，確定在惡臭假單胞菌Pseudomonas putida基因組中與紫色色桿菌Chromobacterium violaceumCV2025轉(zhuǎn)氨酶具有較高同源性 的蛋白基因序列為候選研究對象，基因序列SEQ ID N0.2所示。
[0036] 實驗例2重組表達載體pET28a_PpTA構(gòu)建
[0037]根據(jù)基因序列（P p T A )設(shè)計引物，P p T A基因上游引物為 C G C G G A T C CATGAGTGAAAAGAATTCGCAGACC，下游弓| 物為 CCCCTCGAGTCAGCGGACAGCTTCGTAGGTCAGG;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 下劃線部分為BamHI和Xhol酶切位點。再以惡臭假單胞菌Pseudomonas putida基因組為模 板PCR擴增得到PpTA基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明擴增得到的基因大小與理論值一致。將 回收的PpTA基因和pET28a，用限制性內(nèi)切酶BamHI和Xho I在37 °C水浴中酶切2小時，經(jīng)純化 回收的目的片段與質(zhì)粒在T4連接酶的作用下室溫過夜連接，得到重組表達載體pET28a-PpTA。將重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)的感受態(tài)細胞中，在含有卡納抗性的平板 上對陽性重組體進行篩選，挑取單菌落PCR驗證挑選陽性子。
[0038]可通過將本發(fā)明的重組表達載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得所述重組表達轉(zhuǎn)化體。 所述宿主微生物可以是本領(lǐng)域的各種常見宿主微生物，只要該微生物可以穩(wěn)定的自行復(fù)制 重組表達載體，且能有效的表達所攜帶的本發(fā)明的PpTA基因即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌，更 優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。
[0039]實驗例3大腸桿菌重組PpTA的表達及純化
[0040]所述的培養(yǎng)重組表達轉(zhuǎn)化體中所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的任何可使轉(zhuǎn) 化體生長并且產(chǎn)生本發(fā)明PpTA的培養(yǎng)基，對于大腸桿菌接種時優(yōu)選LB培養(yǎng)基，擴培時優(yōu)選 TB培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊限制，可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不 同按本領(lǐng)域普通知識進行選擇，只要能使轉(zhuǎn)化體生長并且產(chǎn)生本發(fā)明PpTA即可。其他培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化體具體操作均可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進行。
[0041]對于大腸桿菌菌株本發(fā)明選用下述方法:將實施例2中構(gòu)建好的菌株，接種至含卡 納的LB培養(yǎng)基中，37°C180r振蕩培養(yǎng)8h，按2%的接種量接入裝有50mL TB培養(yǎng)基的搖瓶中， 37°C 180r培養(yǎng)，當培養(yǎng)液的0D6Q()達到0.6時加入終濃度為0.1 mM的IPTG，20°C，180r誘導(dǎo)12h。 4°C，8000r離心5min收集菌體，用100mM pH為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌兩次。將獲得的菌體 用100mM pH為7.0的磷酸鈉緩沖液懸浮，冰浴中超聲破碎，離心收集上清，即為PpTA的粗酶 液。上清液中的重組蛋白經(jīng)過鎳柱進行純化，500mM咪唑進行洗脫，獲得純化的PpTA，聚丙烯 酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖1。
[0042]實施例4 PpTA酶活測定
[0043]利用氣相色譜儀檢測苯乙酮的生成量計算重組轉(zhuǎn)氨酶PpTA的酶活。
[0044] PpTA活力測定方法如下：在lmL體系中，50mM苯乙胺，0 · ImM PLP，50mM丙酮酸鈉， 0.1 mM磷酸緩沖液(pH7)，30°C、200r震蕩反應(yīng)lOmin后按苯乙酮含量測定方法進行測定。 [0045] PpTA轉(zhuǎn)氨酶活力單位定義:在上述條件下，lmL轉(zhuǎn)氨酶酶液每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1μ mol苯乙酮定義為一個酶活單位(U)。
[0046] 公式:酶活⑶=a/(c · t)
[0047]比活力(U/mg)=酶活/m
[0048] 其中：a:苯乙酮的物質(zhì)的量(μπιο?)
[0049] t:反應(yīng)時間(min)
[0050] c:酶的體積(mL)
[0051] m:酶液中蛋白含量(mg)
[0052] 實驗例5 PpTA酶學性質(zhì)
[0053] 接種子液后，在20°C誘導(dǎo)12h，收取菌液后進行細胞超聲破碎5min，8000g、4°C離心 5min，取上清粗酶液，測定PpTA酶活，對酶純化之后進行酶學性質(zhì)表征。
[0054] (1)ΡρΤΑ 最佳 pH 測定
[0055] 分別取pH為5、6、7、8、9、10、11、12測定PpTA的酶活，繪制酶活隨pH的變化曲線，比 較在不同pH值條件下PpTA酶活的大小，確定PpTA的最適催化pH。實驗結(jié)果如圖2所示。
[0056] (2)PpTA最佳溫度測定
[0057]分別取溫度為20°C、25 °C、30°C、35 °C、40°C、45 °C、50°C，測定PpTA的酶活，繪制酶 活隨溫度的變化曲線，比較在不同溫度條件下PpTA酶活的大小，確定PpTA的最適催化溫度。 實驗結(jié)果如圖3所示。
[0058] (3)PpTA溫度穩(wěn)定性
[0059] 分別取溫度為冰浴，4°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C，在相應(yīng)溫度下放置2h后，測 定PpTA殘余的酶活，繪制酶活隨溫度的變化曲線，確定PpTA的溫度穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如圖4 所示。
[0060] (4)不同底物濃度對PpTA酶活影響測定
[0061 ]分別取底物苯乙胺的濃度為 5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、 90mM、100mM，測定PpTA的酶活，制作酶活隨底物濃度的變化曲線，比較在不同底物條件下 PpTA酶活的大小。實驗結(jié)果如圖5所示。
[0062]實驗例6 PpTA拆分外消旋苯乙胺的轉(zhuǎn)化率及e.e.值測定 [0063] 標準反應(yīng)體系為1 mL的10OmM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有5OmM外消旋苯乙胺， 0 · ImM PLP，50mM丙酮酸鈉，1 · 0-3 · OU/mL PpTA酶液。反應(yīng)液置于1 · 5mL離心管中，30 °C，200r 振蕩反應(yīng)〇-24h，隔不同時間進行取樣測定反應(yīng)體系中苯乙酮的含量。取反應(yīng)液500yL，加氯 化鈉到飽和，用等體積乙酸乙酯進行萃取，充分震蕩混勻后，12000r離心5min，取有機相用 無水硫酸鈉干燥，用氣相色譜儀測定苯乙酮的含量，以4-二甲氨基吡啶在醋酸酐中的濃度 為50mg/mL為衍生劑，同時在40°C、700r下衍生有機相，再與飽和氯化胺溶液混合均勻后離 心，取有機相，無水硫酸鈉干燥后用于氣相色譜儀測定底物e.e.值。實驗結(jié)果如表1所示。 [0064]實驗例7 PpTA拆分外消旋1-甲基-3-苯基丙胺的轉(zhuǎn)化率及e.e.值測定 [0065] 標準反應(yīng)體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有10mM 1-甲基-3-苯基丙 胺，0.1 mM PLP，1 OmM丙酮酸鈉，4U/mLPpTA。反應(yīng)液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振蕩反應(yīng) 0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉(zhuǎn)化率和e.e.值。實驗結(jié)果如表1所示。
[0066]實施例8 PpTA拆分外消旋苯甘氨醇的轉(zhuǎn)化率及e.e.值測定 [0067]標準反應(yīng)體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有5mM外消旋苯甘氨醇， O.lmM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反應(yīng)液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振蕩反應(yīng)0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉(zhuǎn)化率和e. e.實驗結(jié)果如表1所示。
[0068]實施例9 PpTA拆分外消旋1-氨基茚滿的轉(zhuǎn)化率及e.e.值測定
[0069] 標準反應(yīng)體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有10mM外消1-氨基茚滿， O.lmM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反應(yīng)液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振蕩反應(yīng)0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉(zhuǎn)化率和e. e.實驗結(jié)果如表1所示。
[0070] 實施例10 PpTA拆分外消旋1，2，3，4_四氫-1-萘胺的轉(zhuǎn)化率及e.e.值測定
[0071 ] 標準反應(yīng)體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有5mM外消旋1，2，3，4-四 氫-1-萘胺，〇. ImM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反應(yīng)液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振 蕩反應(yīng)0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉(zhuǎn)化率和e. e.實驗結(jié)果如表1所示。
[0072]表1. PpTA拆分外消旋手性胺的轉(zhuǎn)化率及e.e.值
[0073]
[0074]表中l(wèi)a:外消旋苯乙胺；lb:外消旋1-甲基-3-苯基丙胺；lc:外消旋苯甘氨醇；Id: 外消旋1_氨基諱滿;le:外消旋1,2,3,4-四氫-1-萘胺;上述外消旋胺的結(jié)構(gòu)式如下：
[0076]當然，在本發(fā)明的某些實施例中反應(yīng)體系中PLP輔酶的添加量還可以為O.OlmM、 1.OmM〇
【主權(quán)項】
1. 轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，是如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。2. 轉(zhuǎn)氨酶的基因，其特征在于，是如SEQ ID NO.2所示的堿基序列。3. 如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，所述轉(zhuǎn)氨酶來源于惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida〇4. 權(quán)利要求1或3所述轉(zhuǎn)氨酶或者是權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)氨酶的基因在拆分外消旋胺制備 手性胺中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用是在轉(zhuǎn)氨酶、氨基供體、氨基受體以 及PLP輔酶存在下，反應(yīng)體系中底物外消旋胺的其中一個對映體發(fā)生氧化反應(yīng)生成酮，剩下 另一個未反應(yīng)的對映體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，外消旋胺的拆分是在pH為5.0~11.0的反 應(yīng)體系中實現(xiàn)的。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，外消旋胺的拆分是在4~60°C的反應(yīng)體系 中實現(xiàn)的。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)體系中PLP輔酶的添加量為0.01 ~1·0 mM〇9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)體系中底物外消旋胺的添加量為 5.0~100.0 mM〇
【文檔編號】C12P13/00GK105969746SQ201610458515
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】張建棟, 范曉軍, 武華磊, 張照昱, 常宏宏
【申請人】太原理工大學